RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 209827 (21) Numer zgłoszenia: 371254 (22) Data zgłoszenia: 23.01.2003 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: 23.01.2003, PCT/EP03/000659 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: 31.07.2003, WO03/062413 (13) B1 (51) Int.Cl. C07K 7/04 (2006.01) C12N 9/64 (2006.01) A61P 35/00 (2006.01) A61P 9/00 (2006.01) A61P 31/00 (2006.01) A61P 25/28 (2006.01) (54) Zastosowanie oligopeptydu i oligopeptydy (30) Pierwszeństwo: 23.01.2002, US, 60/351,317 (73) Uprawniony z patentu: Rath Matthias, Almelo, NL (43) Zgłoszenie ogłoszono: 13.06.2005 BUP 12/05 (72) Twórca(y) wynalazku: SHRIRANG NETKE, San Bruno, US ALEKSANDRA NIEDZWIECKI, San Jose, US (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 31.10.2011 WUP 10/11 (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Janina Kossowska PL 209827 B1
2 PL 209 827 B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie oligopeptydu i oligopeptydy. Szereg stanów patologicznych, w tym chorób nowotworowych, związanych jest ze zwiększoną aktywnością metaloproteinaz macierzy (MMP). MMP są grupą proteinaz serynowych, które mogą degradować macierz zewnątrzkomórkową (ECM). MMP są wydzielane do macierzy zewnątrzkomórkowej w postaci zymogenu. Po aktywacji z formy nieaktywnej MMP stają się aktywne enzymatycznie i trawią one ECM, a przedstawiony proces odgrywa główną rolę w przerzutach rakowych. Rodzina proteinaz MMP obejmuje przynajmniej kilku różnych przedstawicieli, do których należą do nich MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-8, MMP-9 i MMP-13. W raku MMP-2 bierze udział we wzroście guza pierwotnego a także w przerzutach. Ta konkretnie MMP zdolna jest do trawienia kolagenu i innych białek macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), co jest wstępnym warunkiem dla rozprzestrzeniania się raka przy inwazji i przerzutach. Mimo że wiele wysiłków poświęca się projektowaniu i badaniu czynników przeciwrakowych, istnieje ciągłe zapotrzebowanie na nietoksyczne czynniki terapeutyczne, które mogą skutecznie zablokować trawienie ECM za pośrednictwem MMP, osłabiając tym samym rozprzestrzenianie się raka i innych schorzeń. Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie syntetycznego oligopeptydu mającego sekwencję aminokwasową analogiczną do swoistej sekwencji aminokwasowej metaloproteinazy macierzy 2 (85-92), który skutecznie blokuje inwazję nowotworów i przerzuty nowotworów. Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie syntetycznych peptydów mających sekwencję aminokwasową PRKPKWEDK SEKW. NR ID.:2), które są użyteczne do blokowania inwazji i przerzutów nowotworów, oraz fragmentów, analogów i homologów SEKW. NR ID.: 2. Celem wynalazku jest również zastosowanie takich peptydów jako czynników hamujących inwazję raka i przerzuty u człowieka i ponadto zastosowanie terapeutyczne w zapobieganiu i leczeniu raków i innych schorzeń związanych z degradacją macierzy zewnątrzkomórkowej przez MMP. Innym celem niniejszego wynalazku jest zastosowanie syntetycznych peptydów jako immunogenu do wytworzenia przeciwciał, które mogą skutecznie blokować inwazję raka i jego przerzuty. Immunogenny oligopeptyd zawarty jest w kompozycji farmaceutycznej obejmującej dopuszczalny farmaceutycznie nośnik oraz oligopeptydy. Oligopeptyd ten może być wykorzystany jako szczepionka. Kompozycję farmaceutyczną obejmującą oligopeptyd można wykorzystać do zaindukowania odpowiedzi odpornościowej przeciwko białku obejmującemu epitop mający sekwencję oligopeptydu (np. SEKW. NR ID.: 2). Innym celem niniejszego wynalazku jest to, aby kompozycja była doskonała zarówno w warunkach in vivo, jak i in vitro. Niniejszy wynalazek dotyczy zastosowania oligopeptydu obejmującego sekwencję oligopeptydową wybraną z grupy składającej się z: a) sekwencji oligopeptydowej PRKPKWDK (Sekw. Id. Nr 2) lub LPPDVQRVD (Sekw. Id. Nr 6) b) sekwencji oligopeptydowej o długości 8 do 10 aminokwasów obejmującej sekwencję a); c) sekwencji oligopeptydowej o długości 8 do 10 aminokwasów obejmującej sekwencję oligopeptydową a) lub b), w której jeden lub więcej aminokwasów jest zastąpionych przez aminokwasy o podobnym ładunku, wielkości i /lub cechach hydrofobowości pod warunkiem, że sekwencja oligopeptydowa jest zdolna do blokowania inwazji i przerzutów komórek rakowych; d) sekwencji oligopeptydowej o długości 8 do 10 aminokwasów obejmującej sekwencję oligopeptydową a) do c), w której reszta aminokwasowa przy N- lub C-końcu jest pominięta, pod warunkiem, że sekwencja oligopeptydowa jest zdolna do blokowania inwazji i przerzutów komórek rakowych; e) sekwencji oligopeptydowej obejmującej jedno lub więcej powtórzeń sekwencji oligopeptydowej z a) do d) kowalencyjnie ze sobą związanych; i f) sekwencji oligopeptydowej o długości 8 do 10 reszt aminokwasowych obejmującej sekwencję oligopeptydową dowolną z a) do e) zdolną do indukowania odpowiedzi odpornościowej przeciw białku zawierającemu epitop o sekwencji oligopeptydu do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej, kompozycji diagnostycznej lub szczepionki do zapobiegania lub leczenia raka, chorób zakaźnych, chorób sercowo-naczyniowych, chorób degeneracyjnych lub stanów patologicznych towarzyszących zniszczeniu macierzy zewnątrzkomórkowej przez metaloproteinazy macierzy. Korzystnie oligopeptyd jest sprzężony z haptenami zwiększającymi odpowiedź odpornościową.
PL 209 827 B1 3 Korzystnie kompozycja farmaceutyczna jest podawana pacjentowi jako szczepionka, iniekcja, infuzja, inhalacja lub czopek. Korzystnie oligopeptyd jest formułowany w stężeniu w zakresie od 1 μm do 500 pm lub 50 do 200 M. W zakres wynalazku wchodzi również oligopeptyd obejmujący sekwencję oligopeptydową PR- KPKWDK (Sekw. Id. Nr: 2) lub LPPDVQRVD (Sekw. Id. Nr: 6), w którym sekwencja ma długość 8 do 10 reszt aminokwasowych. Korzystnie w tych sekwencjach jeden lub więcej aminokwasów jest zastąpionych przez aminokwasy o podobnym ładunku, wielkości i/lub cechach hydrofobowości, pod warunkiem, że sekwencja oligopeptydową jest zdolna do blokowania inwazji i przerzutów komórek rakowych. Korzystnie również reszta aminokwasowa przy N- lub C-końcu tych sekwencji jest pominięta, pod warunkiem, że sekwencja oligopeptydowa jest zdolna do blokowania inwazji i przerzutów komórek rakowych. Korzystnie jedno powtórzenie lub więcej z powtórzeń sekwencji oligopeptydowej związanych ze sobą kowalencyjnie. Korzystnie oligopeptyd jest zdolny do indukowania odpowiedzi odpornościowej przeciw białku obejmującemu epitop o sekwencji oligopeptydowej. Korzystnie oligopeptyd jest sprzężony z haptenem w celu zwiększenia odpowiedzi odpornościowej. Niniejszy wynalazek dotyczy również oligopeptydu według wynalazku do zastosowania w kompozycji farmaceutycznej, która korzystnie jest kompozycją diagnostyczną lub szczepionką. KRÓTKI OPIS RYSUNKÓW Na fig. 1 przedstawiono sekwencję aminokwasową enzymu MMP2. Sekwencje aminokwasowe wybrane do badań aktywności hamującej ujęto w ramki dla ułatwienia identyfikacji. Sekwencja aminokwasowa TMRKPRCGNPDYAN (także ujęta w ramki), dla której wykazano, że hamuje aktywność MMP2 (Loitta i wsp.), została wykorzystana jako odniesienie. Na fig. 2 przedstawiono porównawcze działanie hamujące różnych badanych oligopeptydów. Oligopeptyd PRKPKWDK jest wysoce skuteczny w blokowaniu inwazji komórek nowotworowych w oznaczeniu Matrigel z ludzkimi komórkami nowotworowymi czerniaka A2058. Na fig. 3 przedstawiono działanie hamujące oligopeptydu PRKPKWDK w blokowaniu inwazji komórek nowotworowych w oznaczeniu Matrigel z ludzkimi komórkami nowotworowymi czerniaka A2058. Na fig. 4 przedstawiono działanie hamujące oligopeptydu PRKPKWDK w blokowaniu inwazji komórek nowotworowych w oznaczeniu Matrigel z ludzkimi komórkami nowotworowymi raka sutka MCF7. W użytym tu znaczeniu termin "peptyd" odnosi się do związków organicznych obejmujących dwa lub więcej aminokwasów połączonych kowalencyjnie wiązaniami peptydowymi, peptyd może być dipeptydem (zawierającym dwa aminokwasy), tripeptydem (trzy aminokwasy) itd. W użytym tu znaczeniu termin "oligopeptyd" odnosi się do peptydu zawierającego zwykle mniej niż 30 aminokwasów. Długość oligopeptydów nie jest krytyczna dla wynalazku dopóki jak utrzymywany jest prawidłowy epitop. Korzystnie oligopeptyd może być możliwie mały o ile zachowuje zasadniczo pełną aktywność biologiczną większego oligopeptydu i jest skuteczny w blokowaniu inwazji komórek nowotworowych i przerzutów nowotworów. W tym opisie termin "oligopeptyd" jest stosowany zamiennie z terminem "syntetyczny peptyd". Oligopeptyd stosowany w tym wynalazku jest "izolowany" oprócz "biologicznie czystego" syntetycznego peptydu. W użytym tu znaczeniu jednoliterowe symbole aminokwasów są następujące: A (alanina); R (arginina); N (asparagina); D (kwas asparaginowy); C (cysteina); Q (glutamina); E (kwas glutaminowy); G (glicyna); H (histydyna); I (izoleucyna); L (leucyna); K (lizyna); M (metionina); F (fenyloalanina); P (prolina); S (seryna); T (treonina); W (tryptofan); i Y (tyrozyna). Podstawienia aminokwasowe dotyczą zwykle pojedynczych aminokwasów. Podstawienia, delecje, insercje lub dowolne ich kombinacje mogą być łączone dla uzyskania oligopeptydu. Zachowawcze podstawienia aminokwasowe polegają na zamianie jednego lub więcej aminokwasów na aminokwasy o podobnych charakterystykach ładunku, rozmiaru i/lub hydrofobowości tak, jak, na przykład, podstawienie kwasu glutaminowego (E) kwasem asparaginowym (D). Niezachowawcze podstawienia aminokwasowe polegają na zamianie jednego lub więcej aminokwasów na aminokwasy o innym ładunku,
4 PL 209 827 B1 rozmiarze i/lub hydrofobowości tak, jak, na przykład, podstawienie kwasu glutaminowego (E) waliną (V). Niniejszy wynalazek obejmuje zachowawcze zmiany oligopeptydu pod względem podstawień, delecji, insercji lub dowolnej ich kombinacji dopóki skuteczność blokowania inwazji komórek rakowych i przerzutów jest zasadniczo niezmieniona. Rath i wsp. (J Applied Nutr. 44:62-69, 1992; J Orthomolecular Med. 8:11-20, 1993) założyli, że sekwencje oligopeptydowe o wysokich maksimach hydrofilowości oraz konformacji i ładunku elektrycznego pośredniczą w patogenezie wielu chorób. Zgodnie z ich propozycją, wybrane sekwencje aminokwasów enzymu MMP mogą blokować działanie enzymu przez łączenie się z komplementarną sekwencją w substracie. Koncepcja ta jest całkowicie odmienna od przedstawionej przez Liotta i wsp. (patent USA nr 5,372,809), w której oligopeptyd blokuje cząsteczkę cynku w enzymie. Doświadczalne dowody wskazujące, że kompleksy różnych rodzajów białek w komórce mogą modyfikować aktywność białek w komórce (Gavin i wsp., Nature 415:141-147, 2002) są zasadniczo potwierdzeniem tej propozycji. W niniejszym wynalazku zidentyfikowaliśmy możliwe sekwencje oligopeptydowe w sekwencji aminokwasowej MMP-2 i stwierdziliśmy, że te sekwencje oligopeptydowe skutecznie zaburzają aktywność funkcjonalną MMP-2 przy wykorzystaniu inwazji ECM przez komórki nowotworowe in vitro jako modelu badawczego. Nie ograniczając się do żadnej teorii ani mechanizmu działania, niniejszy wynalazek dotyczy oligopeptydów, które mogą skutecznie blokować inwazję i przerzuty komórek nowotworowych. Jednym z mechanizmów działania może być to, że MMP-2 wiąże się z docelowymi cząsteczkami ECM przez swoiste miejsca wiązania. Blokowanie tych miejsc wiązania może zatem zabezpieczyć MMP-2 przed związaniem się z cząsteczkami substratu ECM, hamować niszczenie ECM i tym samym zapobiegać rozprzestrzenianiu się nowotworów i innych chorób w organizmie. Zidentyfikowano kilka potencjalnych miejsc wiązania w białku MMP-2, a niniejszy wynalazek wykazuje, że syntetyczne analogi tych sekwencji oligopeptydowych są skuteczne w zapobieganiu niszczeniu ECM. Jednym z tych leczniczych oligopeptydów jest PRKPKWDK, dla którego wykazano hamowanie inwazji komórek nowotworowych o około 90%. Niniejszy wynalazek dotyczy dodatkowego zastosowania terapeutycznego tego oligopeptydu w innych chorobach związanych z MMP. Ponieważ MMP-2 może wykorzystywać te same miejsca do wiązania się z cząsteczkami docelowymi w ECM, ujawniony w niniejszym wynalazku oligopeptyd może podobnie wpływać na inne choroby. Zapobiegawcze i terapeutyczne zastosowania zastrzeżonych tu syntetycznych oligopeptydów nie są zatem ograniczone do choroby nowotworowej, lecz mogą być także wykorzystane w chorobach układu sercowo-naczyniowego i innych schorzeniach związanych z niszczeniem ECM przez MMP. Oligopeptydy te mogą być podane pacjentowi jako szczepionka, jako iniekcje, wlewy, inhalacje, czopki lub inne dopuszczalne farmaceutycznie nośniki i/lub środki podawania. W zastosowaniu według niniejszego wynalazku, do podawania kompozycji zawierającej oligopeptydy można wykorzystać dowolną spośród szeregu znanych dróg podawania, takich jak podawanie doustne, dożylne, podskórne, przezskórne i miejscowe. Korzystnie kompozycję farmaceutyczną można podawać pozajelitowo. Oligopeptydy, mogą także być wykorzystane jako szczepionki do wytworzenia przeciwciał, do oznaczeń stosowanych w diagnozowaniu chorób związanych z MMP (zwłaszcza z MMP-2), a także do klinicznego monitorowania postępu łub regresji tej choroby przez oznaczenia krwi lub inne odpowiednie oznaczenia diagnostyczne. Oligopeptyd może zawierać od około 6 do około 20 aminokwasów. Korzystnie oligopeptyd zawiera od około 8 do około 10 aminokwasów, najkorzystniej oligopeptyd zawiera 8 aminokwasów. Syntetyczny oligopeptyd według wynalazku ma sekwencję aminokwasową analogiczną do sekwencji aminokwasowej w białku ludzkiej MMP-2. Amino- i/lub karboksylowe końce syntetycznego oligopeptydu mogą obejmować odpowiednio grupę aminową (-NH 2 ) lub karboksylową (-COOH). Alternatywnie, N-koniec oligopeptydu może, na przykład, stanowić grupa hydrofobowa, w tym, ale nie wyłącznie, benzokarbonylowa, dansylowa, t-butoksykarbonylowa, dekanoilowa, naftoilowa lub grupa węglowodanowa; grupa acetylowa, grupa 9-fluoroenylometoksykarbonylowa (FMOC) lub zmodyfikowana, nie występująca w naturze reszta aminokwasowa. Alternatywnie, C-koniec oligopeptydu może, na przykład, stanowić grupa amidowa; grupa t-butoksykarbonylowa lub zmodyfikowana, nie występująca w naturze reszta aminokwasowa. Alternatywnie, korzystnie niniejszy wynalazek obejmuje syntetyczne oligopeptydy blokujące inwazję i przerzuty komórek rakowych z pominiętą resztą aminową na N-końcu lub na C-końcu.
PL 209 827 B1 5 Niniejszy wynalazek obejmuje też oligopeptydy blokujące inwazję i przerzuty komórek rakowych modyfikacją przez podstawienie aminokwasu w danej sekwencji bez względu na ładunek i polarność podstawianego aminokwasu. Rozważane są też analogi peptydów, w których jedno lub więcej wiązań amidowych ewentualnie zastąpiono wiązaniem innym niż amidowe, korzystnie podstawionym amidowym lub izosterem wiązania amidowego. Zatem podczas gdy przez aminokwasy w peptydach zwykle rozumie się aminokwasy, a korzystne wykonania wynalazku ilustrowane są przez peptydy, specjalista rozumie, że w wykonaniach z wiązaniami innymi, niż amidowe, termin "aminokwas" lub "reszta" w użytym tu znaczeniu odnosi się do innych bifunkcjonalnych części niosących grupy o podobnej strukturze, co łańcuchy boczne aminokwasów. Dodatkowo, reszty aminokwasowe mogą być zablokowane lub odblokowane. Modyfikacje w oligopeptydach według wynalazku uzyskuje się przez powtórzenie sekwencji oligopeptydowej jeden lub więcej razy, przy czym powtórzenia są ze sobą kowalencyjnie połączone. Zapobiegawcze lub terapeutyczne zastosowanie jednego lub więcej oligopeptydów, których zastosowanie jest przedmiotem wynalazku wykorzystuje bezpośrednie i kompetytywne zmniejszenie lub zablokowanie działania metabolicznego lub oddziaływania MMP-2 przez podanie dożylne lub w inny dopuszczalny terapeutycznie sposób. Oligopeptydy, których zastosowanie jest przedmiotem wynalazku stosuje się zapobiegawczo lub terapeutycznie przez podanie ich w postaci podskórnych szczepionek lub w inny dopuszczalny sposób w celu wzbudzenia odpowiedzi odpornościowej, która może częściowo lub całkowicie zablokować oddziaływanie metaboliczne MMP, korzystnie MMP-2. Korzystnie oligopeptydy te są sprzężone z haptenami dla wzmocnienia odpowiedzi odpornościowej i tym samym skuteczności terapeutycznej. Oligopeptydy działają też jako regulatory na zasadzie sprzężenia zwrotnego dla specyficznego uniemożliwienia lub zmniejszenia tempa syntezy białek MMP-2 na poziomie komórkowym. Oligopeptydy z zastosowania według wynalazku blokują chorobę u człowieka obejmującą, ale nie wyłącznie, inwazję i przerzuty komórek rakowych, tym samym zapobiegają i leczą raka, a jednocześnie stosuje się je do zapobiegania lub leczenia chorób zakaźnych, chorób układu sercowo- -naczyniowego i chorób degeneracyjnych. Kompozycje wytworzone zgodnie z zastosowaniem według niniejszego wynalazku mogą obejmować peptyd lub peptydy w kombinacji z co najmniej jednym innym czynnikiem takim, jak związek stabilizujący, które mogą być podawane w dowolnym jałowym, biokompatybilnym nośniku farmaceutycznym, w tym ale nie wyłącznie, w soli fizjologicznej, buforowanej soli fizjologicznej, dekstrozie i wodzie. Kompozycje mogą być podawane pacjentowi pojedynczo lub w kombinacji z innymi czynnikami, lekami lub hormonami. Dopuszczalne farmaceutycznie nośniki mogą także składać się z zaróbek i środków pomocniczych, które ułatwiają formułowania preparatów ze związkami czynnymi. Dalsze szczegóły dotyczące technik formułowania i podawania można odnaleźć w najnowszym wydaniu "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, Pa. Substancja czynna z kompozycji farmaceutycznej może być dostarczona w postaci soli i formowana z wieloma kwasami, w tym między innymi, z kwasem chlorowodorowym, siarkowym, octowym, mlekowym, winowym, jabłkowym, bursztynowym itd. Sole z reguły są lepiej rozpuszczalne w rozpuszczalnikach wodnych lub innych rozpuszczalnikach protonowych niż odpowiednie postaci wolnej zasady. Oligopeptydy według wynalazku mogą być także wykorzystane jako szczepionki w celu wytworzenia przeciwciał oznaczanych we krwi przy diagnozowaniu chorób związanych z MMP (zwłaszcza z MMP-2), a także klinicznym monitorowaniu postępu lub regresji tej choroby. Następujące przykłady mają na celu zilustrowanie praktycznego wykonania tego wynalazku i nie mają ograniczać jego zakresu. Sekwencje oligopeptydowe Sekwencje aminokwasowe MMP-2 odnoszące się do regionów o wysokich maksimach hydrofilowości wzbogaconych w aminokwasy z ładunkiem zidentyfikowano za pomocą programu komputerowego. Oligopeptydy według niniejszego wynalazku mogą być zsyntetyzowane lub przygotowane technikami dobrze znanymi w tej dziedzinie. (Patrz, na przykład, Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., N.Y.). Wytworzone i zastosowane w niniejszym wynalazku oligopeptydy zestawiono w tabeli 1.
6 PL 209 827 B1 Działanie hamujące tych oligopeptydów na inwazję Matrigel i migrację przez błonę Matrigel różnych komórek rakowych oznaczano przy zastosowaniu "ulepszonej komory inwazyjnej Matrigel" ("improved Matrigel Invasion Chamber, Becton Dickinson, USA). Oligopeptyd TMRKPRCGNPDVAN, dla którego aktywność anty-mmp-2 wykazali Liotta i wsp., zastosowano jako standardowy punkt odniesienia dla oligopeptydów. Oligopeptyd T a b e l a 1: Różne sekwencje oligopeptydowe zidentyfikowane i stosowane w badaniach Numer sekwencji GDVAPKTDKE SEKW. NR ID.: 1 PRKPKWDK SEKW. NR ID.: 2 EDYDRDKKY SEKW. NR ID.: 3 GRSDGLM SEKW. NR ID.: 4 NYDDDRKW SEKW. NR ID.: 5 LPPDVQRVD SEKW. NR ID.: 6 RYNEVKKKMDP SEKW. NR ID.: 7 Ogólne warunki doświadczalne Zidentyfikowane oligopeptydy zsyntetyzowano na zamówienie. Zastosowano je w badaniach inwazji w Matrigel. (a) Badania inwazji w Matrigel Badania te przeprowadzono przy zastosowaniu ulepszonej komory inwazyjnej Matrigel" ("Improved Matrigel Invasion Chamber, Becton Dickinson, USA). W badaniach z ludzkimi komórkami czerniaka ludzkie fibroblasty NHDF (Clonetics) wysiano na wkładce "Matrigel" i umożliwiono osiągnięcie konfluencji. Przeprowadzono to w celu dokładnej symulacji warunków otaczających komórki nowotworowe in vivo w ciele. Następnie wysiano na wkładkę ludzkie komórki czerniaka A2058. Do komory dodano kondycjonowane podłoże z hodowli fibroblastów uzupełnione różnymi poziomami wybranych oligopeptydów. Układ inkubowano przez około 24 godziny. Na końcu tego okresu zdrapano komórki z górnej powierzchni wkładki. Komórki, które naruszyły błonę Matrigel i przemigrowały do dolnej powierzchni wkładki, wybarwiono barwnikiem "quick stain" i policzono pod mikroskopem. Procent zahamowania obliczono jako liczbę komórek, które nie przemigrowały przez błonę w porównaniu z kontrolą (poziom "0" oligopeptydu). Aktywność hamowania kontroli traktowano jako "0". Podłoże z oznaczeń inwazji zachowano dla badań zymogramów. W badaniach z wykorzystaniem ludzkich komórek raka sutka MCF7 procedura była zasadniczo podobna do stosowanej dla komórek czerniaka, z wyjątkiem tego, że w miejsce komórek NHDF zastosowano fibroblasty MRC5 (ATCC). W badaniach z wykorzystaniem ludzkich komórek raka sutka MDA-MB 231 komórki fibroblastów MRC5 (ATCC) wysiano w studzienkach. Pozostała część procedury była taka sama, jak w badaniach z komórkami MCF7. (b) Badania zymogramów Podłoże (25-30 μi) z różnych studzienek w badaniach inwazji naniesiono na żele zymogramowe "Novex" (Invitrogen". Żele rozwinięto i wybarwiono zgodnie ze wskazaniami producenta. Metaloproteinazy macierzy (MMP) zidentyfikowano na podstawie ich znanych mas cząsteczkowych. P r z y k ł a d 1 Działanie hamujące różnych sekwencji oligopeptydowych na inwazję Matrigel i migrację komórek czerniaka A2058 Siedem (7) oligopeptydów (sekwencje aminokwasowe - patrz tabela 1) zbadano pod kątem hamowania inwazji ludzkich komórek nowotworowych czerniaka. Oligopeptyd o sekwencji aminokwasowej PRKPKWDK wykazywał aktywność blokującą. Oligopeptyd o sekwencji TMRKPRCGNPDVAN wykazywał około 11% hamowania w porównaniu z 73% wykazywanymi przez PRKPKWDK (fig. 1). Oligopeptyd VI o sekwencji aminokwasowej LPPDVQRVD także miał pewną aktywność blokującą (tj. około 20%). Oligopeptyd "I" o sekwencji aminokwasowej GDYAPKTDKE nie wykazywał żad-
PL 209 827 B1 7 nej aktywności aż do stężenia 100 μm (nie pokazane na fig. 2), wobec 63% wykazywanych przez PRKPKWDK przy tym samym stężeniu. P r z y k ł a d 2 Działanie hamujące oligopeptydu PRKPKWDK na inwazję Matrigel i migrację komórek czerniaka A2058 W tych badaniach stężenie PRKPKWDK w podłożu zmieniało się od 0 do 150 μm. Stwierdzono, że oligopeptyd postępująco hamował inwazję komórek czerniaka (fig. 3) od około 37% przy stężeniu 50 μm do 73% przy 150 μm. Błona Matrigel jest analogiem ECM i zdolność komórek rakowych do przebicia i migracji na drugą stronę błony odzwierciedla zdolność komórek rakowych do tworzenia przerzutów w organizmie. Oligopeptyd był w stanie znacząco zmniejszyć inwazję trzech różnych typów komórek rakowych. W tym układzie badawczym aktywność skierowana była przeciwko ECM. W podsumowaniu stwierdzamy, że nasze badania jasno wykazują, że oligopeptyd może wpływać na degradację ECM w organizmie i tym samym hamująco wpływać na postępowanie chorób, w których rozkład ECM stanowi podstawowe uszkodzenie. P r z y k ł a d 3 W badaniach tych określiliśmy hamujące działanie PRKPKWDK na inwazję i migrację w żelu Matrigel ludzkich komórek raka sutka MCF7 (ATCC). Podobnie, jak dla komórek czerniaka, oligopeptyd ten hamował inwazję komórek rakowych. Hamowanie przy stężeniu 150 μm wynosiło około 70%. Wzrastało ono do około 90% przy stężeniu 200 μm (fig. 4). P r z y k ł a d 4 W badaniach tych rozpatrywaliśmy hamujące działanie PRKPKWDK przy zastosowaniu innych ludzkich komórek raka sutka - MDA-MB 231. Hamowanie przy stężeniu 150 μm wynosiło około 94%. P r z y k ł a d 5 Następnie ustaliliśmy, czy oligopeptydy mogą wpływać na działanie enzymu po jego wydzieleniu. Badania zymogramowe nie wykazały żadnego hamującego wpływu PRKPKWDK na ilość MMP-2 wydzielanej przez różne komórki rakowe (dane nie przedstawione). Opisano szereg wykonań wynalazku. Tym niemniej rozumieć należy, że różne modyfikacje mogą być poczynione bez odejścia od ducha i zakresu wynalazku. Podczas gdy powyższy opis przedstawiono ze znaczną ilością szczegółów, sekwencje przedstawiono dla wyjaśnienia, nie zaś ograniczenia. Modyfikacje i ulepszenia, w tym odpowiedniki ujawnionej powyżej technologii będące w zasięgu możliwości i umiejętności specjalistów zawarte są w zakresie dołączonych tu zastrzeżeń. Dla specjalistów oczywistym będzie, że liczne modyfikacje, przeróbki i zmiany mogą być dokonane w odniesieniu do konkretnych elementów powyższego opisu bez odejścia od pomysłu wynalazczego opisanego tu wynalazku. Na przykład, modyfikacje (chemiczne albo enzymatyczne) opisanych tu podstawowych sekwencji wchodzą również w zakres niniejszego wynalazku. Na przykład, ujawniona sekwencja może być dipeptydem lub tripeptydem. Ujawnione sekwencje mogą być także zmodyfikowane tak, by zawierały tę resztę na N-końcu lub na C-końcu peptydów. Sekwencje mogą także być chemicznie zmodyfikowane dla zwiększenia ich aktywności (np. przez amidację C-końcowej części sekwencji lub włączenie reszty glicyny lub alaniny, na którymkolwiek z końców). Zgodnie z tym rozumie się, że różne modyfikacje mogą być dokonane bez odejścia od ducha i zakresu wynalazku, i że takie zmiany powinny być rozpatrywane jako wchodzące w zakres niniejszego wynalazku tak, jak przedstawiono to w poniższych zastrzeżeniach.
8 PL 209 827 B1
PL 209 827 B1 9 Zastrzeżenia patentowe 1. Zastosowanie oligopeptydu obejmującego sekwencję oligopeptydową wybraną z grupy składającej się z: a) sekwencji oligopeptydowej PRKPKWDK (Sekw. Id. Nr 2) lub LPPDVQRVD (Sekw. Id. Nr 6) b) sekwencji oligopeptydowej o długości 8 do 10 aminokwasów obejmującej sekwencję a); c) sekwencji oligopeptydowej o długości 8 do 10 aminokwasów obejmującej sekwencję oligopeptydową a) lub b), w której jeden lub więcej aminokwasów jest zastąpionych przez aminokwasy o podobnym ładunku, wielkości i /lub cechach hydrofobowości pod warunkiem, że sekwencja oligopeptydowa jest zdolna do blokowania inwazji i przerzutów komórek rakowych; d) sekwencji oligopeptydowej o długości 8 do 10 aminokwasów obejmującej sekwencję oligopeptydową a) do c), w której reszta aminokwasowa przy N- lub C-końcu jest pominięta, pod warunkiem, że sekwencja oligopeptydowa jest zdolna do blokowania inwazji i przerzutów komórek rakowych; e) sekwencji oligopeptydowej obejmującej jedno lub więcej powtórzeń sekwencji oligopeptydowej z a) do d) kowalencyjnie ze sobą związanych; i f) sekwencji oligopeptydowej o długości 8 do 10 reszt aminokwasowych obejmującej sekwencję oligopeptydową dowolną z a) do e) zdolną do indukowania odpowiedzi odpornościowej przeciw białku zawierającemu epitop o sekwencji oligopeptydu do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej, kompozycji diagnostycznej lub szczepionki do zapobiegania lub leczenia raka, chorób zakaźnych, chorób sercowo-naczyniowych, chorób degeneracyjnych lub stanów patologicznych towarzyszących zniszczeniu macierzy zewnątrzkomórkowej przez metaloproteinazy macierzy.
10 PL 209 827 B1 2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że oligopeptyd jest sprzężony z haptenami zwiększającymi odpowiedź odpornościową. 3. Zastosowanie według zastrz. 1 lub 2, znamienne tym, że kompozycja farmaceutyczna jest podawana pacjentowi jako szczepionka, iniekcja, infuzja, inhalacja lub czopek. 4. Zastosowanie według jednego z zastrz. 1 do 3, znamienne tym, że oligopeptyd jest formułowany w stężeniu w zakresie od 1 μm do 500 μm lub 50 μm do 200 μm. 5. Oligopeptyd obejmujący sekwencję oligopeptydową PRKPKWDK (Sekw. Id. Nr: 2) lub LPPDVQRVD (Sekw. Id. Nr: 6), znamienny tym, że sekwencja ma długość 8 do 10 reszt aminokwasowych. 6. Oligopeptyd według zastrz. 5, znamienny tym, że jeden lub więcej aminokwasów jest zastąpionych przez aminokwasy o podobnym ładunku, wielkości i/lub cechach hydrofobowości, pod warunkiem, że sekwencja oligopeptydowa jest zdolna do blokowania inwazji i przerzutów komórek rakowych. 7. Oligopeptyd według zastrz. 5 lub 6, znamienny tym, że reszta aminokwasowa przy N- lub C-końcu jest pominięta, pod warunkiem, że sekwencja oligopeptydowa jest zdolna do blokowania inwazji i przerzutów komórek rakowych. 8. Oligopeptyd według zastrz. 5-7, znamienny tym, że jedno powtórzenie lub więcej powtórzeń sekwencji oligopeptydowej związanych ze sobą kowalencyjnie. 9. Oligopeptyd według zastrz. 5-8, znamienny tym, że jest zdolny do indukowania odpowiedzi odpornościowej przeciw białku obejmującemu epitop o sekwencji oligopeptydowej. 10. Oligopeptyd według zastrz. 5-9, znamienny tym, że jest sprzężony z haptenem w celu zwiększenia odpowiedzi odpornościowej. 11. Oligopeptyd określony w zastrz. 5-10 do zastosowania w kompozycji farmaceutycznej. 12. Oligopeptyd według zastrz. 11, znamienny tym, że kompozycja jest kompozycją diagnostyczną. 13. Oligopeptyd według zastrz. 11, znamienny tym, że kompozycja jest szczepionką.
PL 209 827 B1 11 Rysunki
12 PL 209 827 B1
PL 209 827 B1 13
14 PL 209 827 B1 Departament Wydawnictw UP RP Cena 4,92 zł (w tym 23% VAT)