Podstawowe strategie i narzędzia genetyki molekularnej

Czym jest inżynieria genetyczna? Ang. recombinant DNA manipulacje DNA in vitro } izolacja i amplifikacja DNA i cdna } mapowanie i sekwencjonowanie DNA } tworzenie nowych cząsteczek DNA } przez rekombinację cząsteczek naturalnych } przez syntezę de novo } wprowadzanie konstruktów DNA do komórek i organizmów } modyfikacje syntezy białek } ekspresja heterologiczna } bioinformatyka 2

A co nie jest inżynierią genetyczną? } Inżynieria embrionalna (np. klonowanie) } Tworzenie nowych form organizmów przez selekcję 3

Zastosowania } Badania podstawowe } Biotechnologia Granica między badaniami podstawowymi a stosowanymi jest płynna, stosowane techniki są podobne, różnice dotyczą głównie skali. 4

Podstawowe techniki } Izolacja DNA ze źródeł naturalnych } komórki i tkanki } mikroorganizmy hodowane w laboratorium i występujące naturalnie } antyczny DNA } cdna izolacja RNA i przepisanie na DNA } Chemiczna synteza DNA de novo 5

PCR 6 2005 Prentice Hall Inc. / A Pearson Education Company / Upper Saddle River, New Jersey 07458

Elektroforeza DNA i RNA 2005 Prentice Hall Inc. / A Pearson Education Company / Upper Saddle River, New Jersey 07458 7

Hybrydyzacja } Wykorzystanie komplementarności kwasów nukleinowych do wykrywania określonej sekwencji DNA (Southern) lub RNA (Northern) 8 2005 Prentice Hall Inc. / A Pearson Education Company / Upper Saddle River, New Jersey 07458

Hybrydyzacja Northern } Podstawowa metoda badania poziomu ekspresji genu 9

Podstawowe techniki } Enzymy restrykcyjne } analiza fragmentów DNA (mapowanie) } klonowanie 10

Wektory } Umożliwiają utrzymanie DNA wprowadzonego do komórek (transformacja, transfekcja) } wektory autonomiczne zdolne do replikacji (np. plazmidy, wirusy) } wektory integracyjne } wektory ekspresyjne umożliwiają ekspresję wprowadzonego genu (autonomiczne lub integracyjne) } wektory kierujące rekombinacją (ang. targeting) integracyjne } wektory bifunkcjonalne 11

Typowy wektor } } } } Sekwencje zapewniające replikację (w. autonomiczne) Sekwencje umożliwiające odróżnienie komórek z wprowadzonym wektorem markery selekcyjne Miejsce do wstawienia klonowanego DNA linker Opcjonalnie sekwencje umożliwiające odróżnienie wektora ze wstawką od wektora pustego marker rekombinacji 12

Klonowanie molekularne } Włączenie danego fragmentu DNA (wstawki) do wektora autonomicznego 13

Przyk ady zastosowań } Poznawanie sekwencji DNA (genów, genomów, mutantów) } Diagnostyka molekularna } Ekologia i filogenetyka molekularna } Heterologiczna ekspresja białek (dla celów poznawczych i biotechnologicznych) } Odwrotna genetyka inaktywacja wybranych genów u organizmów modelowych } Terapia genowa 14

Postęp techniczny } 1953 struktura DNA } 1977 sekwencjonowanie DNA (Nobel 1980) } 1987 pierwszy automatyczny sekwenator na rynku } 1995 pierwszy genom wolnożyjącego organizmu bakterii } Od 2004 sekwencjonowanie wysokoprzepustowe 15

Postęp techniczny } Koszt sekwencjonowania między 1999 a 2009 obniżył sie 14 000 razy } Prędkość odczytu sekwencji między 2000 a 2010 r. wzrosła 50 000 razy } Cel: sekwencja genomu jednej osoby za 1000$ osiągalny w ciągu kilku lat } Im więcej znamy sekwencji, tym łatwiej poznajemy kolejne 16

Sekwencjonowanie } Dideoksynukleotydy zatrzymują syntezę na określonych nukleotydach! Matryca 3 ATCGGTGCATAGCTTGT 5!! Produkty reakcji A 5 TAGCCACGTATCGAACA* 3! 5 TAGCCACGTATCGAA* 3! 5 TAGCCACGTATCGA* 3! 5 TAGCCACGTA* 3! 5 TAGCCA* 3! 5 TA* 3! 17

Tradycyjny odczyt sekwencji } Znakowanie radioaktywne, osobne reakcje A T C G 18 +

Sekwencjonowanie CGTAA CGTAAC CGTAACC CGTAACCC CGTAACCCT CGTAACCCTT CGTAACCCTTG CGTAACCCTTGG Obecnie stosuje się dideoksynukleotydy wyznakowane fluorescencyjnie każdy innym kolorem 19

Sekwencjonowanie automatyczne 20

Sekwencjonowanie wysokoprzepustowe } Tzw. deep sequencing } Generowanie w jednym przebiegu milionów niezależnych odczytów } Pojedyncze odczyty krótkie (25-400 bp) } Zastosowania } sekwencjonowanie nowych genomów } resekwencjonowanie } np. analiza zmienności } badanie ekspresji przez sekwencjonowanie cdna 21

Solexa 350 = Solexa Ultrahigh-throughput DNA Sequencing Platform 22

Pirosekwencjonowanie (454) Fragmenty DNA przyłączone do kulek (1 fragment na kulkę), następnie namnożone Kulki z DNA umieszczone w studzienkach Sekwencjonowanie przez syntezę: dodaje się kolejno 4 nukleotydy, gdy dodany nukleotyd komplementarny, to uwoniony pirofosforan daje reakcję z luminescencją Wynik: ~800,000 odczytów po 250-500 bp (~400 megabases) 23 The development and impact of 454 sequencing Jonathan M Rothberg & John H Leamon Nature Biotechnology 26, 1117-1124 (2008)

Solexa (Illumina) 24 Slides from http://www.illumina.com

Solexa (Illumina) 27 Slides from http://www.illumina.com Wynik: 80-100 milionów odczytów po ~50 bp (~4Gb)!

Genomika } Genomika jest dziedziną zajmującą się badaniem całych genomów (kompletu informacji genetycznej) różnych organizmów } Techniki biologii molekularnej + robotyka + informatyka } Sekwencjonowanie i charakteryzowanie genomów } Badanie funkcji zawartych w nich genów 28

Metagenomika } Izolacja DNA ze środowiska i sekwencjonowanie } Jedyny sposób badania mikroorganizmów, które nie dają się hodować 29

Metagenomika } Analiza sekwencji całości DNA wyizolowanego ze zbiorowiska organizmów 30

Odkrycia dzięki sekwencjonowaniu } Tajemnicza UCYN-A } } } } } Sinica (cyjanobakteria) Niewielki genom (1,4mln par zasad, 1200 genów) Brak zdolności fotosyntezy, cyklu Krebsa, syntezy niektórych aminokwasów Zdolność asymilacji azotu Symbioza? tajemnicza ekologia 31

Genom cz owieka 32

33 Craig Venter Francis Collins (NIH)

Czym jest znajomość genomu } Nie jest odczytaniem księgi życia } Sama sekwencja nie daje jeszcze zrozumienia, jak funkcjonują komórki } Ale jest niezwykle cennym narzędziem w badaniach } Sekwencja nie jest lekarstwem } Ale bardzo pomaga w zrozumieniu mechanizmów chorób i wynajdywaniu nowych terapii 35

Co to znaczy? TCACAATTTAGACATCTAGTCTTCCACTTAAGCATATTTAGATTGTTTCCAGTTTTCAGCTTTTATGACTAAATCTTCTAAAATTGTTTTTCCCTAAATGTAT ATTTTAATTTGTCTCAGGAGTAGAATTTCTGAGTCATAAAGCGGTCATATGTATAAATTTTAGGTGCCTCATAGCTCTTCAAATAGTCATCCCATTTTATACA TCCAGGCAATATATGAGAGTTCTTGGTGCTCCACATCTTAGCTAGGATTTGATGTCAACCAGTCTCTTTAATTTAGATATTCTAGTACATACAAAATAATACC TCAGTGTAACCTCTGTTTGTATTTCCCTTGATTAACTGATGCTGAGCACATCTTCATGTGCTTATTGACCATTAATTAGTCTTATTTGTTAAATGTCTCAAAT ATTTTATACAGTTTTACATTGTGTTATTCATTTTTTAAAAAATTCATTTTAGGTTATATGTATGTGTGTGTCAAAGTGTGTGTACATCTATTTGATATATGTA TGTCTATATATTCTGGATACCATCTCTGTTTCATGCATTGCATATATATTTGCCTATTTAGTGGTTTATCTTTTCATTTTCTTTTGGTATCTTTTCATTAGAA ATGTTATTTATTTTGAGTAAGTAACATTTAATATATTCTGTAACATTTAATGAATCATTTTATGTTATGTTTAGTATTAAATTTCTGAAAACATTCTATGTAT TCTACTAGAATTGTCATAATTTTATCTTTTATATACATTGATATTTTTATGTCAAATATGTAGGTATGTGATATTATGCACATGGTTTTAATTCAGTTAATTG TTCTTCCAGATGTTTGTACCATTCCAACATCATTTAAATCATTAAATGAAAAGCCTTTCCTTACTAGCTAGCCAGCTTTGAAAATCCATTCATAGGGTTTGTG TTAATATATTTTTGTTCTTTTTTTTCCTTTCTACTGATCTCTTTATATTAATACCTACTGTGGCTTTATATGAAGTCATGGAATAATACGTAGTAAGCCCTCT AACACTGTTCTGTTACTGTTGTTATTGTTTTCTCAGGGTACTTTGAAATATTCGAGATTTTATTATTTTTTAGTAGCCTAGATTTCAAGATTGTTTTGACGAT CAATTTTTGAATCAATTGTCAATATTTTTAGTAATAAAATGATGATTTTTGATTGGAAATACATTAAATCTATAAGCCAAATTGGAGATTATTGATATATTAA CAAAAATGAGTTTTCCAGTCCATGAATGTATGCACATTATAAAATTCATTCTTAAGTATGTCATTTTTTAAGTTTTAGTTTCAGCAGTATATGTTTGTTACAT AGGTAAACTCCTGTCATGGGGGTTAGTTGTACAGGTTATTTTATCATCCAGGCATAAAGCCCAGTACCCAGTAGTTATCTTTTCTGCTCCTCTCCCTCCTGTC ACCCTCCACTCTCAAGTAGACCCCAGTTTCTGTTGTTCTCTTCTTTGCATTAATGACTTCTCATCATTTAGATTGCACTTGTAAGTGAGAACAGGACGTATGT GGTTTTCTACTCCTGTGTTAGTTTGCTAAGGATAACCACCTCCATCTCCATCCATGTTCCCACAAAAGACATGATCTCCTTTTTTATGGCTGCATATTATTCC ATGGTATATATGTACCACATTTTCTTTATCCAATCTGTCATTGATGGACATTTAGGTTGTTTCCACATCATTGCCGTTGTAAATACTGCTGCAGTGAATATTC GTGTGTATGTCTTTATGGTAGAATGATTTATATTCCTCTGGGTATATTTCCAAGTAATGGGATGGTTGGGTCAAATGGTAATTCTGCTTTTAGCTTTTTGAGG AATTGCCATATTGCCTTTCACAACGGTTGAACTAATTTATACTCCCAAGAGTGTATAAGTTGTTCCTTTTTCTCTGCAACCTCGACATCACCTGTTATTTATG ACTTTTATATAATAGCCATTCTGCTGGTCTGAGATGGTATCTCATTATGATTTTGATTTGCATTTCTCTAATGCTCAGTGATATTGAGCTTGGCTGCATATAT GTCTTCTTTTAAAAATATCTGTTCATGTCCTTTGCCTAATTTATAACGGGGTTGTTTGTTTTTCTCTTGTAAATTTGTTTAAGTTCCTTATAGATTCTAGGTA TTAAACCTTTTTTCAGAGGCGTGGCTTGCAAATATTTTCTCCCATTCTATAGGTTGTCTGTTTATTCTGTTGATAGTTTCCCTTGCTGTGCAGAAGCTCTTAA CTTTAATTAGATCCGACTTGTCAATTTTTGCTTTGGTCGCAATTGCTTTTGATGTTATTGTCGTGAAATCTTTGCTAGTTCTTAGGTCCAGGATGATATTGCC CAAGTTGTCTTCCAGGGCTTTTATAATTTTGGATTTTACATTTAAGTCTTAATATATTTATTAAATTTGTTAGGGTTTCAGGATACAAGGACAATATAGCAGC AAACAATGTAAAAGTAAAATCTGAAAAATAATAGAAAACAGTTTAATTGAACACTTTACCATTATGTAATGCCCTTCTTTGTCTTTCCTGATCTTTGTTGGTT TGAAGTTCAAAAAAGACAAACTTAATGGTACAATAGGTATTGTAGATTTCAGGACTTTCTGTATAAAATATTTTGTATATATGAATAGATCATTTTTTATTTC CAGTCTTTAAACATTTTCTTAACATTTTCTTCTATTGCTTCACTTCACTCGCTAGGACCATCAGGACAGTGTTGAACAGAAATTGTCAGACTGATCATCACAA CTTTTTCTAGATTTTAGAAGGAAATTTTTCTTTATTTCAACATAAAGCAGCATGTTAATGCCAAGTTTTAATATGTGTTATCAGATTGAAATTTTTTTGTATA TTTCTACATTACCAAGAATTTTTAGCAAGAGTTTTTGTTGAGTTTTAATTTAAAAATCATTTGTTAATTTCATCTGATTTTTTTATTTCTCTTTTTACCTTAA GAGATTAAACTGACTACAGATTGAATATAAACAAACAAACAAACAAACAAAAACTCTAAAATGCTGTGGATCAACACCACTTAGTAATTTGTATACTTGGATT CAATTTGCTGAAATTTTGTTAGACATTTTTGCGTCGATATTTATGAGGGATGTTGATCTGTAAAAGTATTAAAATGCCTTTGACAGATAGTGTCACCATATAA AAAACTTTGAACAAAATCAGATTATATCACTGTGGATATTTCTATTTTGAACTAACTTAGATGATAATTTTAATCTATATCCTAGATGAACT 36 Mały fragment chromosomu 21

Co to znaczy? } Bez teorii ewolucji nie mielibyśmy możliwości poznania odpowiedzi na to pytanie } Odszukujemy geny podobne do genów już zbadanych } Możemy badać geny przez odwrotną genetykę tworzenie mutantów u organizmów modelowych } Porównując genomy możemy wnioskować o biologii organizmu 37

Odwrotna genetyka od genu do funkcji Genetyka tradycyjna Genetyka odwrotna Funkcja (mutacja, fenotyp) Gen (z sekwencji całego genomu) Klonowanie genu Inaktywacja genu Analiza sklonowanego genu Analiza uzyskanego fenotypu 38

Odwrotna genetyka inaktywacja przez rekombinację 39

Inaktywacja warunkowa 40

Odwrotna genetyka interferencja RNA Odkrycie roku 2002 regulacyjna rola małych RNA 41 Nagroda Nobla w dziedzinie medycyny 2006, za odkrycie mechanizmu interferencji RNA A. Fire i C. Mello

sirna - jak to dzia a? Efekt degradacja mrna 42 Hannon G.J.: RNA interference, Nature 418, July 11, 2002

Zastosowania sirna } Badanie funkcji genów ( odwrotna genetyka ) - szczególnie skuteczne u nicienia Caenorhabditis, ale działa też w komórkach owadów, ssaków i roślin } Hamowanie wybranych genów jako metoda leczenia (np. zwalczania wirusów czy nowotworów) przykład: obniżenie poziomu receptora LDL ( zły cholesterol ) u myszy 43

Ekspresja heterologiczna Wektor ekspresyjny 44 Oczyszczanie białka

Fuzje bia kowe } Do sekwencji kodującej białko dołącza się inną domenę, np. ułatwiającą wykrycie i/lub oczyszczanie } } znaczniki epitopowe GFP (zielone białko fluorescencyjne) 45

Green Fluorescent Protein- Aequorea victoria 46

GFP 47

Lokalizacja mitochondrialna nadejsprymowanej hpnpazy-myc w komórkach HeLa. MitoTracker anti-c-myc Nałożenie wt hpnpaza -52 hpnpaza 48

Ekspresja heterologiczna w biotechnologii 49

Inżynieria przeciwcia leki przysz ości } W łańcuchach immunoglobulin obszary zmienne odpowiadają za rozpoznawanie różnych antygenów, obszary stałe nadają specyficzność gatunkową } W klasycznych metodach wytwarzania przeciwciał monoklonalnych uzyskiwano przeciwciała zwierzęce } Klonowanie i ekspresja genów kodujących przeciwciała jest alternatywnym sposobem ich uzyskiwania } Możliwe jest uzyskiwanie przeciwciał humanizowanych obszary zmienne z genu przeciwciała zwierzęcego wstawione między obszary stałe przeciwciała ludzkiego } Humanizowane i rekombinowane ludzkie przeciwciała są stosowane w terapii np. nowotworów 50

Terapia genowa } Zastępująca wprowadzenie genu, którego defekt powoduje chorobę } } Trudności z opracowaniem wektorów i zapewnieniem ekspresji, zwłaszcza dla komórek nie dzielących się Stosowana dla chorób związanych z ekspresją genów w komórkach krwi (np. SCID gen ADA) i innych, które łatwo wprowadzić do organizmu (np. makrofagi choroba Gauchera) } Inaktywująca zmniejszenie ekspresji genu, którego ekspresja powoduje chorobę (np. nowotworową) } } 51 Technicznie łatwiejsze i bezpieczniejsze (sirna, modyfikowane oligonukleotydy) Ograniczone zastosowania, pacjent musi ciągle przyjmować kosztowne leki

Literatura } Allison rozdz. 8 i 9 } Brown rozdz. 2 6 52