RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 209415 (21) Numer zgłoszenia: 371806 (22) Data zgłoszenia: 10.03.2003 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: 10.03.2003, PCT/HU03/000020 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: 18.09.2003, WO03/076667 (13) B1 (51) Int.Cl. C12Q 1/70 (2006.01) C12Q 1/68 (2006.01) Opis patentowy przedrukowano ze względu na zauważone błędy (54) Mieszanina starterów do amplifikacji, jej zastosowanie, sposób wykrywania genotypów HPV i zestaw odczynników do wykrywania i typowania HPV (30) Pierwszeństwo: 14.03.2002, HU, P0200981 (43) Zgłoszenie ogłoszono: 27.06.2005 BUP 13/05 (73) Uprawniony z patentu: GENOID KFT, Budapeszt, HU (72) Twórca(y) wynalazku: CSABA JENEY, Budapeszt, HU TIBOR TAKÁCS, Pilisjászfalu, HU (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 31.08.2011 WUP 08/11 (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Sulima Zofia SULIMA GRABOWSKA SIERZPUTOWSKA BIURO PATENTÓW I ZNAKÓW TOWAROWYCH spółka jawna PL 209415 B1
2 PL 209 415 B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest mieszanina starterów do amplifikacji, jej zastosowanie, sposób wykrywania jednego lub większej liczby genotypów HPV w próbkach biologicznych i zestaw odczynników do wykrywania i typowania HPV. Ustalono wiele sekwencji wirusa brodawczaka, patrz publikacje przytoczone tu jako pozycje literaturowe: HPV-6: de Villiers i in., J. Virology, 40 (1981); HPV-11: Dartmann i in., Virology 151, 124-130 (1986); HPV-16: Seedorf i in., Virology 145, 181-185 (1985); HPV-18: Cole i Danos, Journal of Molecular Biology 93, 599-608 (1987); HPV-31: Goldsborough i in., Virology 171, 306-311 (1989); HPV-33: Cole i Streeck, J. Virology, 58, 991-995 (1986); HPV-54: Favre i in., J. Cancer 45, 40-46 (1990); HPV- -56: Lörincz, J. Gen. Virol. 70, 3099 (1989). Wykrywanie i typowanie HPV opisano w kilku publikacjach, przy czym oprócz metody Southerna i innych technik hybrydyzacyjnych, najszerzej stosowanymi technikami są metody oparte na PCR, gdyż te metody równocześnie zapewniają wysoką czułość, specyficzność i elastyczność testu, co zapewnia większą kontrolę spełniania wymagań analitycznych. Ludzki wirus brodawczaka, członek rodziny Papillomaviridae, jest onkogennym wirusem DNA, o kolistym genomie wielkości 8000 pz. Wirus wykazuje silny tropizm nabłonkowy i proliferuje tylko w zróżnicowanych komórkach nabłonka. Wirus brodawczaka jest podejrzewany o odgrywanie roli etiologicznej w wielu różnych chorobach ludzi, np. różnych chorobach skóry, czyli w brodawkach, kłykcinie kończystej i nowotworach skóry oraz innych stanach, takich jak rak szyjki macicy, raki odbytowo-płciowe, rak krtani. Istnieją dowody, że ludzki wirus brodawczaka wykazuje silną korelację z występowaniem tych nowotworów i jest to nawet prawdziwe w przypadku zmian przedrakowych (CIN, VIN, VAIN, PIN, PAIN). HPV można wykryć u 99% pacjentek z rakiem szyjki macicy. Ta ścisła zależność statystyczna jest prawdopodobnie wywołana przyczynową rolą HPV w tworzeniu raka szyjki macicy. Na podstawie danych epidemiologicznych, pacjentki zakażone różnymi genotypami HPV nie mają takiego samego poziomu ryzyka rozwinięcia raka szyjki macicy. Zgodnie z tymi odkryciami genotypy sklasyfikowano na klasy niskiego ryzyka, średniego ryzyka i wysokiego ryzyka, a oprócz nich istnieją także niesklasyfikowane genotypy. Ze względu na to, że ryzyko różni się w dużym stopniu i częstość zakażenia HPV jest bardzo wysoka, określenie genotypu ma duże znaczenie. Wirus HPV nie może być hodowany. Diagnoza serologiczna zakażenia HPV jest ograniczona do wykrycia wystawienia na działanie wirusa (zakażenia w przeszłości lub obecnie), ale nie jest w stanie dokładnie zdefiniować genotypu, a jej rola jest głównie ograniczona do badań epidemiologicznych. W przypadku wirusów brodawczaka nie istnieje dokładna klasyfikacja serologiczna (serotypowanie) i genotypowanie jest powszechnie zaakceptowaną metodą klasyfikacji. Można je podzielić na dwie grupy, zależnie od tego czy wykrycie jest poprzedzane przez amplifikację, czy nie. W jednej postaci tej ostatniej metody stosuje się sondy pełnej długości genomowego RNA do wykrycia genomów HPV w zdenaturowanych DNA, a heterodupleks wykrywa się za pomocą specyficznych przeciwciał (Hybrid Capture-Digene). Zgodnie z inną metodą, do wykrywania i genotypowania genotypów HPV stosuje się metodę Southerna. Te metody są niekorzystne gdyż są stosunkowo nieczułe i częściowo niespecyficzne. W przypadku metody Hybrid Capture wiele publikacji opisuje różne reakcje krzyżowe, powodujące fałszywe dodatnie wyniki w warunkach klinicznych. Autorzy opisali, że reakcje krzyżowe były akceptowalne tylko przy kontrolnym odcięciu wysokiego stężenia DNA (1 ng/ml), co podkreśla niepożądane sprzężenie pomiędzy czułością a specyficznością. W przypadku metod amplifikacji ten problem nie istnieje, gdyż reakcję odpowiedzialną za czułość (amplifikację) prowadzi się osobno. Ogólnie techniki amplifikacji różnią się pod względem wybranego amplifikowanego segmentu genomu, liczby starterów i zastosowanej techniki wykrywania. Najczęściej stosowanymi starterami są GP5+ - GP6+, MY9-MY11 oraz różne reakcje PCR specyficzne dla typu. Najczęściej stosowanymi technikami wykrywania są hybrydyzacja specyficzna dla sekwencji, polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP) i test z sondą liniową (LiPA, ang. line probe assay). Oprócz tych testów wykorzystuje się także, ale rzadziej, sekwencjonowanie amplikonów i rozkład tymidyny w wyniku wbudowania dutp. Charakterystyka analityczna technik amplifikacji różni się w szerokim zakresie. Metody można scharakteryzować uwzględniając amplifikowane genotypy, czułość analityczną amplifikacji genotypu oraz specyficzność i wiarygodność wykrywania. Pod tym względem układ zdegenerowanych starterów MY9-MY11 uważa się za reakcję odniesienia. W przypadku układu MY9-MY11 istnieje system wykry-
PL 209 415 B1 3 wania przez hybrydyzację LiPA (Innogenetics). Główną wadą układu MY9-MY11 jest to, że trudno jest kontrolować syntezę zdegenerowanych starterów, toteż względny stosunek rodzajów starterów wytworzonych w syntezie zmienia się z syntezy na syntezę, co może powodować nieprzewidywalne zmiany w analitycznym przebiegu reakcji PCR; po drugie reakcja ta może zamplifikować najmniejszą liczbę typów w porównaniu z innymi szeroko stosowanymi reakcjami. Dobrze wiadomo z literatury, że układ może zamplifikować genotyp 51 tylko w tym przypadku, gdy startery specyficzne dla genotypu 51 HPV zostaną dodane do reakcji. Przy zastosowaniu syntezy zdegenerowanych starterów względny stosunek rodzajów starterów nie może być zmieniony i nie jest możliwe dopasowanie stosunku starterów, aby osiągnąć lepszą sprawność analityczną i zrównoważoną amplifikację genotypów. Reakcja GP5+ - GP6+ rozwiązuje ten problem tylko dzięki użyciu dwóch par starannie dobranych starterów - optymalizowanych dla sekwencji płciowych HPV - układy dwóch starterów są łatwe w obsłudze, jednak elastyczność układu jest niższa. Układ GP5+ - GP6+ może amplifikować wiele znanych genotypów HPV, ale cechy analityczne układu nie są optymalne (czułość nie jest zrównoważona dla różnych genotypów), a podejście z użyciem dwóch starterów jest ograniczone pod względem optymalizacji, np. zrównoważenie czułości wykrywania dla poszczególnych genotypów jest bardzo problematyczne (za wyjątkiem ograniczonej optymalizacji temperatury topnienia i stężenia MgCl 2 ). Trudno jest dostosować układ GP5+ - GP6+ do amplifikacji innych genotypów, co w każdym przypadku wpłynie na jego przyszłe stosowanie, gdyż stale pojawia się potrzeba wykrywania nowych genotypów. Identyfikacja genotypów nie jest prawidłowo rozwiązana. Inną szeroko znaną metodą amplifikacji specyficzną dla genotypu jest metoda L1C: układ dwustarterowy, w dwóch wersjach, w jednej stosuje się (ze starterem LC1) starter L1C2 lub nowy L1C2, do amplifikacji kolejnych genotypów. Szczegółowy opis amplikonu L1C można znaleźć w literaturze [Jpn. J. Cancer Research 82, 524-531 (1991)]. Zasadniczo dwa kryteria muszą zostać spełnione w przypadku wykrywania sposobami postamplifikacyjnymi: możliwość zastosowania w rutynowej diagnostyce (łatwość, koszty, czas) oraz wymaganie odpowiedniego poziomu zdolności rozróżniania. Znacząca liczba metod nie jest odpowiednia w odniesieniu do zdolności rozróżniania. Zatem zastosowanie RFLP jest ograniczone, ponieważ ze względu na krótkie amplifikowane regiony liczba diagnostycznych miejsc restrykcyjnych nie jest wystarczająca, a zatem często genotypy można sklasyfikować tylko na grupy. W innym przykładzie, w technice SSCP trudno jest odnieść złożone wzory SSCP do genotypów, a ponadto pewność tej reakcji nie jest zadowalająca. Zdolność rozróżniania jest szczególnie ważna z punktu widzenia diagnostyki, aby spełniać wymagania ustawodawców. Pod względem prostoty i zdolności rozróżniania sekwencjonowanie jest idealnym rozwiązaniem, gdyż zostało ono zautomatyzowane i można w ten sposób wykryć wiele genotypów (lub nawet ich podtypów), jeżeli próbka nie stanowi mieszaniny genotypów. Jednak w praktyce nie jest ono szeroko stosowane, gdyż jest drogie i czasochłonne, jego stosowanie w rutynowych laboratoriach diagnostycznych jest nie do zaakceptowania, a w przypadku mieszanych próbek nie można określić żadnego z genotypów. Zaletą metod hybrydyzacyjnych jest możliwość łatwego zmieniania ich zdolności rozróżniania lub ostrości warunków, gdyż kilka parametrów reakcji może się różnić w szerokim zakresie oraz pewne rozwiązania można łatwo zautomatyzować, reakcja jest mniej kosztowna, a w przypadku równoległego wprowadzania (dla niektórych postaci) nawet wymagany czas nie jest znaczący. Zatem, istnieje potrzeba opracowania nowego sposobu amplifikacji/wykrywania HPV, który eliminowałaby wady obecnych metod oraz był tani, łatwy do powtórzenia i zautomatyzowania. Wynalazek umożliwia przeprowadzenie testu polegającego na amplifikacji i hybrydyzacji, w którym startery stanowią niezależnie zsyntetyzowane cząsteczki tak, że ich względny stosunek można łatwo kontrolować i optymalizować, a amplifikacja ma zrównoważoną czułość. Reakcje hybrydyzacji prowadzi się w dużym stopniu w podobny sposób spełniający kryterium taniej, szybkiej, elastycznej i dającej się zautomatyzować reakcji. Obecnie opracowano ulepszony sposób wykrywania i genotypowania ludzkiego wirusa brodawczaka (HPV). Zdefiniowano regiony genomowe HPV, które są odpowiednie do projektowania sond oligonukleotydowych specyficznych dla rodzaju HPV i specyficznych dla genotypu HPV oraz dogodnie znajdują się blisko siebie oraz w jednym amplikonie. Ujawniono sekwencje sond specyficznych dla rodzaju i specyficznych dla genotypu. Opracowano również zoptymalizowany zestaw preparatu odczynników oraz sposób, odpowiednie do amplifikacji i wykrywania poszerzonego zestawu genotypów HPV ( zestawu ).
4 PL 209 415 B1 Wynalazek dotyczy mieszaniny starterów do amplifikacji, zawierającej startery L1C1, L1C2, nowy L1C2 o SEQ ID NO: 73-75, SEQ ID NO: 37-40 i SEQ ID NO: 35 oraz ewentualnie co najmniej jeden starter wybrany z grupy obejmującej startery SEQ ID NO: 70-72 oraz SEQ ID NO: 1-34 i 36. Wynalazek dotyczy także zastosowania mieszaniny starterów zdefiniowanej powyżej do amplifikacji genotypów 3, 4, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 18, 20, 24, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 39, 40, 41, 42, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 59, 60, 61, 66, 67, 68, 72, 74 i 77 ludzkiego wirusa brodawczaka. Wynalazek dotyczy również sposobu wykrywania jednego lub większej liczby genotypów HPV w próbkach biologicznych, obejmującego etapy, w których: a) przygotowuje się jeden lub większą liczbę amplikonów z użyciem mieszaniny starterów zdefiniowanej w zastrz. 1, z cząsteczek kwasów nukleinowych wyekstrahowanych z próbki biologicznej; oraz b1) hybrydyzuje się amplikon otrzymany w (a) w ostrych warunkach z sondą do hybrydyzacji specyficzną dla rodzaju genotypu; oraz ewentualnie b2) hybrydyzuje się amplikon otrzymany w (a) w ostrych warunkach z sondą specyficzną dla rodzaju HPV. Korzystnie, sondę specyficzną dla rodzaju HPV stanowi: i) konsensusowa sonda lub starter dla HPV hybrydyzujący z sekwencją SEQ ID NO: 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108 lub 110; ii) sonda komplementarna do sondy w (i); albo iii) sekwencja wybrana spośród SEQ ID NO: 41-49. Korzystnie, sondę do hybrydyzacji specyficzną dla genotypu stanowi: i) sonda specyficzna dla genotypu HPV hybrydyzująca z sekwencją SEQ ID NO: 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109 lub 111; ii) sonda komplementarna do sondy w (i); albo iii) sekwencja wybrana spośród SEQ ID NO: 50-57. Korzystnie, sposobem wykrywa się grupy genotypów HPV niskiego i wysokiego ryzyka. Korzystnie, sposób obejmuje ponadto wykrywanie syntetycznego oligonukleotydu jako wzorca wewnętrznego. Korzystnie, jako wzorzec wewnętrzny stosuje się sekwencję SEQ ID NO: 68, a do jej wykrywania stosuje się SEQ ID NO: 69 jako sondę do hybrydyzacji. Wynalazek dotyczy ponadto zestawu odczynników do wykrywania i typowania HPV zawierającego: i) mieszaninę starterów zdefiniowaną w zastrz. 1; ii) ewentualnie oligonukleotyd jako wzorzec wewnętrzny, korzystnie o SEQ ID NO: 68; iii) sondy do hybrydyzacji zawierające lub hybrydyzujące z sekwencją SEQ ID NO: 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109 lub 111 oraz ewentualnie z sekwencją SEQ ID NO: 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108 lub 110; oraz iv) ewentualnie sondy do hybrydyzacji, korzystnie o SEQ ID NO: 69, wykrywające wzorzec wewnętrzny. W niniejszym opisie ujawniono regiony genomowe ludzkiego wirusa brodawczaka, które znajdują się w konsensusowym amplikonie (czyli w regionie, który można amplifikować przy użyciu starterów wiążących się z konserwowanymi sekwencjami flankującymi amplikon), przy czym te regiony genomowe charakteryzują się tym, że zawierają sekwencję DNA specyficzną dla genotypu, która jest przydatna do projektowania sond do hybrydyzacji specyficznych dla genotypu. W opisie ujawniono także inny region genomowy HPV w tym amplikonie konsensusowym, przy czym te regiony genomowe charakteryzują się tym, że zawierają konserwowaną sekwencję DNA, specyficzną dla rodzaju HPV, która jest przydatna do projektowania sond do hybrydyzacji specyficznych dla rodzaju. Zasadniczym elementem rozwiązania według wynalazku jest obecność dwóch segmentów genomowych wewnątrz jednego konsensusowego amplikonu, który jest odpowiedni do zaprojektowania sond do hybrydyzacji specyficznych dla rodzaju oraz genotypu. Ogólnie, sposób według wynalazku można stosować do amplifikacji/wykrycia danej grupy genotypów HPV, co prowadzi do wykrycia genomowego DNA HPV za pomocą sond specyficznych względem rodzaju oraz zbiorowego (grupowego) lub indywidualnego genotypowania genomów HPV. Sposób ten można stosować do określenia ryzyka lub ustalenia tych osobników, u których istnieje ryzyko
PL 209 415 B1 5 wystąpienia późniejszych stanów lub chorób, wywołanych przez wirusy HPV lub związanych z wirusami HPV znalezionymi u pacjentów, w danym momencie, a w szczególności z ich wykryciem specyficznym względem typu. Sposób według wynalazku jest także odpowiedni do przesiewowego zbadania danej populacji pod względem obecności HPV, a także wzmocnienia, wsparcia lub potwierdzenia diagnozy cytologicznej u danego osobnika (badanie przesiewowe). Aby ułatwić lepsze zrozumienie wynalazku poniżej zdefiniowano kilka określeń. Określenia kwas nukleinowy i oligonukleotyd dotyczą sond, starterów i innych krótkich DNA, RNA, PNA (peptydowy kwas nukleinowy) oraz innych oligomerów chemicznych, które są zdolne do specyficznego względem sekwencji wiązania matrycy (cząsteczki docelowej) DNA, RNA lub PNA. Określenie hybrydyzacja dotyczy specyficznego względem sekwencji wiązania dwóch sekwencji kwasu nukleinowego. Stosowane warunki w znacznym stopniu determinują ostrość hybrydyzacji, tak więc hybrydyzacja może zachodzić w mniej ostrych warunkach, nawet jeżeli kwasy nukleinowe nie są dokładnie komplementarne. W niektórych przypadkach konieczne może być, aby sonda kwasu nukleinowego wiązała się z grupą sekwencji, które są bliżej lub dalej ze sobą spokrewnione. Fachowcy w dziedzinie technologii kwasów nukleinowych mogą określić warunki, przy spełnieniu których wiązanie będzie wystarczająco specyficzne lub aspecyficzne. Określenie sonda dotyczy zestawu oligonukleotydów, które wykazują hybrydyzację specyficzną względem sekwencji w obecności komplementarnych lub częściowo komplementarnych kwasów nukleinowych. Strukturę oligonukleotydów można zmodyfikować, aby umożliwić zajście etapów występujących po hybrydyzacji lub zmienić ich właściwości hybrydyzacyjne. Określenie sonda specyficzna względem typu dotyczy zestawu oligonukleotydów, które w ostrych warunkach wiążą się tylko z docelowym regionem, który jest do nich dokładnie komplementarny. Warunki hybrydyzacji odpowiednie do spełnienia tego wymogu są dobrze znane (patrz np. Sambrook i in., 1985, Molecular Cloning Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. USA). Ogólnie, ostre warunki wybiera się jako temperaturę o około 5 C niższą niż temperatura topnienia (Tm) specyficznej sekwencji przy określonej sile jonowej i wartości ph. Tm jest temperaturą (przy określonej sile jonowej i ph), w której 50% sondy jest związane w obecności odpowiedniej komplementarnej cząsteczki docelowej. Złagodzenie ostrości warunków hybrydyzacji (np. zwiększenie stężenia soli lub obniżenie temperatury) pozwoli na związanie się niedokładnie komplementarnych sekwencji. W przypadku niedokładnie komplementarnej matrycy, nukleotydy, które nie mogą związać się z matrycowym kwasem nukleinowym w matrycy są niedopasowanymi nukleotydami. Określenie starter dotyczy nukleotydów, które mogą działać jako punkt inicjacji syntezy DNA (startu) w warunkach, w których synteza produktu wydłużania startera komplementarnego do nici kwasu nukleinowego jest indukowana na matrycy kwasu nukleinowego, czyli w obecności czterech różnych trifosforanów nukleozydów i środka polimeryzującego (czyli polimerazy DNA lub odwrotnej transkryptazy) w odpowiednim buforze i w odpowiedniej temperaturze. Starterem jest korzystnie jednoniciowa cząsteczka DNA. Odpowiednia długość startera zazwyczaj wynosi 15-40 nukleotydów. Starter nie musi odzwierciedlać dokładnej sekwencji matrycy, a zatem przez zmianę temperatury wiązania (reakcji) grupa podobnych cząsteczek docelowych może służyć za matrycę dla syntezy (konsensusowy amplikon). Grupy chemiczne o pewnych korzystnych cechach można zastosować do znakowania oligonukleotydu startera, aby umożliwić jego wiązanie z fazą stała lub w innych celach. Określenie starter w niniejszym opisie dotyczy także grupy sekwencyjnie pokrewnych oligonukleotydów, przy czym grupa oligonukleotydów jest w stanie zainicjować syntezę (jak to opisano powyżej) na pewnej grupie sekwencji matrycowych. Ponadto, członkowie grupy mogą obejmować oligonukleotydy, które mogą tworzyć niedopasowania z niektórymi lub wszystkimi członkami danego zestawu matrycowych kwasów nukleinowych. Jednakże, w odpowiednich warunkach te startery mogą także uczestniczyć w inicjowaniu syntezy. Określenie startery konsensusowe dotyczy startera lub grupy starterów, które można stosować do zainicjowania syntezy pewnych regionów pokrewnych matrycowych kwasów nukleinowych. Cechą charakterystyczną tych regionów jest to, że ich zmienność jest znacznie niższa niż zmienność całego kwasu nukleinowego, czyli są one konserwowane, a zatem na tych sekwencjach wybrane startery konsensusowe mogą inicjować syntezę dla całej grupy sekwencji matrycowych kwasów nukleinowych. Starter konsensusowy nie musi być pojedynczym starterem, może stanowić grupę starterów. Określenie termostabilny enzym polimeraza dotyczy enzymu, który jest stosunkowo stabilny w 95 C i katalizuje polimeryzację trifosforanów nukleozydów z wytworzeniem produktów wydłużania startera, które są komplementarne do jednej z nici kwasu nukleinowego sekwencji docelowej. Oczysz-
6 PL 209 415 B1 czony termostabilny enzym polimeraza opisano w opisie patentowym US nr 4 889 818, który przytacza się tu jako pozycję literaturową i jest on dostępny w handlu np. z Applera. Zgodnie z wynalazkiem, amplifikację DNA prowadzi się drogą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), ujawnionej w opisach patentowych US nr 4 683 195, 4 683 202 i 4 965 188. Zgodnie z wynalazkiem, opracowano zoptymalizowane warunki PCR dla celów amplifikacji większej liczby różnych genotypów HPV z optymalizacją stężeń starterów, sekwencji starterów i warunków cykli temperaturowych. W pierwszej części amplifikacji zachodzi amplifikacja przy stale rosnącej ostrości, w tym celu, że amplifikacja genotypów, dla których startery zawierają więcej niedopasowanych nukleotydów, może zacząć następować z taką samą wydajnością jak w przypadku innych genotypów, ale później wzrastająca temperatura wiązania przesuwa reakcję w kierunku wykorzystywania tych starterów, które występują w większych ilościach. Przy zoptymalizowanej mieszaninie starterów ten proces teoretycznie będzie przesuwać wiązanie starterów do sekwencji w kierunku sekwencji konsensusowej, w ten sposób stwarzając możliwość amplifikacji genotypów ze zrównoważoną czułością. Choć reakcja łańcuchowa polimerazy jest korzystną metodą amplifikacji, wspomniane regiony genomowe i oligonukleotydy można stosować w jakiejkolwiek znanej metodzie. Przykładowo, reakcja łańcuchowa ligazy (Wu i Wallace 1989, Genomics 4: 560-569), układ amplifikacji TAS (Kwoh i in., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173-1177) oraz samopodtrzymująca się replikacja sekwencji (Guatelli i in., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874-1878) mogą być także odpowiednie do prawidłowej amplifikacji docelowej sekwencji. Podobnie, w układzie z Q-β-replikazą (Kramer i Lizardi, 1989, Nature 339: 401-402) można amplifikować sondy specyficzne względem sekwencji. Zgodnie z wynalazkiem, startery wybiera się z grupy w większym lub mniejszym stopniu komplementarnych sekwencji odpowiednich do amplifikacji konsensusowych amplikonów HPV. Skuteczne inicjowanie syntezy osiąga się w obecności niedopasowanego nukleotydu stosując dokładnie dobraną temperaturę hybrydyzacji i względne stężenia starterów. W korzystnej postaci wynalazku, startery według wynalazku (SEQ ID NO: 1-40, 70-72) stosuje się ze znanymi starterami (SEQ ID NO: 73-75) w postaci odpowiednich odczynników. Umożliwia to wykrycie poszerzonego zestawu genotypów HPV, przynajmniej 47 znanych genotypów. Z przykładu 4 wynika, że amplifikację genotypu HPV-35 zgodnie z wynalazkiem można przeprowadzić włączając do reakcji starter o SEQ ID NO: 37. Bez tego startera i w obecności w reakcji tylko znanych starterów, genotyp HPV-35 nie jest amplifikowany. Inna postać wynalazku dotyczy starterów specyficznych względem typu dla genu HPV L1, które obejmują sekwencje nukleotydów opisane w sekwencjach SEQ ID NO: 1-36. W innej postaci wynalazek dotyczy mieszaniny starterów obejmującej startery L1C1, L1C2 lub nowy L1C2 i startery wybrane z SEQ ID NO: 1-40, 70-72. Ponadto wynalazek dotyczy zastosowania takiej mieszaniny starterów do amplifikacji genotypów HPV 3, 4, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 18, 20, 24, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 39, 40, 41, 42, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 59, 60, 61, 66, 67, 68, 72, 74 lub 77. W wyniku amplifikacji z użyciem wspomnianej mieszaniny starterów według wynalazku wytwarzane są amplikony. Zasadniczym elementem rozwiązania według wynalazku jest obecność w amplikonach segmentów genomowych specyficznych dla rodzaju i dla typu. Te segmenty genomowe umożliwiają realizację wysoce specyficznej hybrydyzacji i wykrywania. Charakteryzują się one genotypowo- -specyficznym, zmiennym wydłużeniem segmentu genomowego na 3'-końcu amplikonu (w kierunku 3'-5') od -80 pz do -30 pz. Te segmenty genomowe o długości około 40 pz, są dwuniciowymi sekwencjami DNA, przedstawionymi w sekwencjach SEQ ID NO: 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111. Wykrywanie umożliwia także obecność innego segmentu genomowego amplikonów, rozciągającego się od 3'-końca amplikonu (w kierunku 3'-5') od -150 pz do -105 pz i charakteryzującego się mało złożonymi, wysoce konserwowanymi pomiędzy genotypami sekwencjami, które wykazują specyficzność względem rodzaju HPV. Te segmenty genomowe są dwuniciowym DNA, zazwyczaj zawierają 23 pz, a ich górna nić ma następujące sekwencje: SEQ ID NO: 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110. Podczas hybrydyzacyjnego wykrywania amplikonów stosuje się sondy rodzajowe lub specyficzne dla typu, zaprojektowane dla wyżej wspomnianych segmentów genomowych. Rodzajowe sondy oligonukleotydowe mają ogólne zastosowanie do wykrywania amplikonu HPV, czyli zamplifikowanego DNA HPV, podczas gdy sondy specyficzne dla typu można stosować do dalszego ich typowania, czyli
PL 209 415 B1 7 wykrywania poszczególnych genotypów. Obydwie sondy hybrydyzacyjne mogą mieć naturę DNA, RNA lub PNA. Sondy rodzajowe stosowane w sposobie według wynalazku mają podobne właściwości do konsensusowych starterów, z tą różnicą, że 5'-koniec nie jest preferowany jako pozycja źle dopasowanej pary nukleotydów. W wynalazku stosuje się je jako sondy, przy czym te sondy rodzajowe można stosować zarówno jako sondy hybrydyzacyjne, jak i startery. Rodzajowymi (konsensusowymi) sondami hybrydyzacyjnymi lub starterami są oligonukleotydy, które zawierają jedną z sekwencji wymienionych w sekwencjach SEQ ID NO: 41-49 W korzystnym sposobie według wynalazku jako sondy rodzajowe stosuje się następujące sondy: SEQ ID NO: 41-49. W przypadku sond specyficznych dla typu, sondy są w 100% komplementarne do sekwencji odpowiadającego genotypu. Podczas ich projektowania ważne jest wykluczenie możliwości, że inne genotypy wykazują wysoki stopień komplementarności z sondą lub jej częścią. Ponieważ segment specyficzny dla typu ma długość około 40 pz w amplikonach według wynalazku, możliwe jest wybranie nawet nachodzących na siebie sekwencji sond, które są najbardziej odpowiednie zarówno teoretycznie, jak i doświadczalnie. W przykładzie 5 wykazano, że można zaprojektować i stosować odpowiednie sondy, które mają wysoką specyficzność (w porównaniu z badanymi 70 genotypami) i zachowują swoją specyficzność nawet przy stosowaniu hybrydyzacji w warunkach temperatury pokojowej. Ponieważ hybrydyzacja sond jest dogodnie specyficzna w identycznych warunkach hybrydyzacji, można stosować mieszaninę sond. Zatem z praktycznego punktu widzenia można stosować bardziej równomierne warunki reakcji. Tak więc, w celu realizacji wynalazku ujawniono sekwencje sond specyficznych dla typu, które można stosować w amplifikacji oraz testach wykrywania i genotypowania HPV, przy czym obejmują one sekwencje podane w SEQ ID NO: 50-67. Chociaż wynalazek dotyczy dowolnej postaci hybrydyzacji, w warunkach przemysłowych korzystna jest hybrydyzacja na fazie stałej. W tak zwanej hybrydyzacji na fazie stałej (do przodu) wiąże się sondy z unieruchomionym docelowym kwasem nukleinowym (amplikonem), podczas gdy w odwrotnej hybrydyzacji wiąże się docelowy kwas nukleinowy (amplikon) z unieruchomionymi sondami. W tym procesie niezwiązane produkty reakcji usuwa się za pomocą różnych roztworów przemywających. W pierwszym przypadku sonda musi być odpowiednio znakowania do dalszego wywołania, podczas gdy w postaci odwrotnej znakowany jest amplikon. Obydwa sposoby można realizować na płytkach do mikromianowania. Ponieważ zdolność do unieruchomienia jest ograniczona, w przypadku wynalazku sposób hybrydyzacji do przodu jest korzystny, ze względu na stosowanie dużej liczby poszczególnych sond tworzących mieszaninę sond. Przydatny może być także sposób opisany w opisie patentowym US nr 6 214 979, w którym sondy dodaje się do reakcji podczas amplifikacji. Podczas procesu aktywność 5'-3' egoznu - kleazowa polimeraza Taq powoduje rozkład sond i wykrywanie wytworzonych produktów rozkładu można zastosować do wykrycia obecności docelowego kwasu nukleinowego. Jednakże, znane są także inne, w większości przypadków oparte na hybrydyzacji, tak zwane systemy detekcji w czasie rzeczywistym, ale różnią się one tylko sposobem realizacji i detekcji, ale nie teoretycznie inną realizacją specyficznego dla sekwencji wiązania sonda-amplikon. W celu unieruchomienia amplikony mogą być znakowane. Z różnych możliwości w przypadku wynalazku korzystne jest znakowanie starterów biotyną i wykorzystanie znakowanego startera w reakcjach amplifikacji. W obecności awidyny lub streptawidyny zaadsorbowanych na fazie stałej, biotyna powoduje unieruchomienie amplikonu, w wyniku wysoce specyficznego i bardzo stabilnego wiązania awidyna-biotyna. W danej reakcji tylko startery hybrydyzujące do jednej lub drugiej nici są biotynylowane tak, że drugą nić można usunąć przed hybrydyzacją. Dla celów wykrywania sondy mogą być znakowane, przy czym znaczniki można wykrywać różnymi metodami, np. metodami detekcji opartymi na fluorescencji, radioaktywności, kolorymetrii, dyfrakcji rentgenowskiej, absorpcji, magnetyzmie, aktywności enzymatycznej, itd. Zatem, odpowiednie znakowanie może obejmować, ale nie jest ograniczone do następujących: fluorofory, chromofory, izotopy, substancje o dużej gęstości elektronowej, enzymy lub ligandy zdolne do tworzenia specyficznego wiązania. Można także stosować połączenia tych wyżej wspomnianych metod. Można stosować specyficzne wiązanie fluoresceiny z przeciwciałem przeciw fluoresceinie- HRPO, które jest wykrywane w reakcji utlenienia przez peroksydazę chrzanową w obecności substra-
8 PL 209 415 B1 tu HPPA i H 2 O 2 (patrz przykład 2). Można również stosować biotynylowane startery do przodu lub do tyłu. Zarówno znakowane sondy, jak i przeciwciało przeciw fluoresceinie-hrpo są dostępne w handlu. Odczynniki chemiczne potrzebne do przemywania i różne roztwory są także ogólnie dostępne. Można także wytworzyć lub zastosować układ wykorzystujący fosfatazę alkaliczną lub jakikolwiek inny enzym, którego aktywność może być wykryta. Ponadto dopuszczalnymi metodami detekcji do stosowania w diagnostyce medycznej są także luminometria z detekcją fluorescencji lub kolorymetria. Włączenie wzorca wewnętrznego podczas diagnostycznego stosowania sposobu według wynalazku umożliwia rozpoznanie fałszywych negatywnych reakcji i jest korzystne z diagnostycznego punktu widzenia. Różne DNA pochodzenia sztucznego i naturalnego można stosować jako wzorzec wewnętrzny. Korzystne są te układy, które nie zwiększają liczby starterów stosowanych w reakcji, a ilość i właściwości analityczne docelowego kwasu nukleinowego jako wzorca wewnętrznego są dogodnie znormalizowane. Zgodnie z wynalazkiem sztuczną sekwencję kwasu nukleinowego (SEQ ID NO: 68) dodaje się do próbki w postaci rekombinowanego plazmidu (przykład 6). Zgodnie z wynalazkiem wykrywanie wzorca wewnętrznego prowadzi się równolegle z hybrydyzacyjnym wykrywaniem DNA HPV i tylko wywołanie substratów jest rozdzielone. Sonda jest znakowana digitoksygeniną (SEQ ID NO: 69) i wykrywana za pomocą przeciwciała przeciw digitoksygeninie sprzężonego z fosfatazą alkaliczną. Jednak, inne metody wykrywania są także odpowiednie do wykrywania wewnętrznej sondy. Jednak, wykrywanie wzorca wewnętrznego można także przeprowadzić na podstawie różnic w ruchliwości stosując elektroforezę w żelu agarozowym lub inne odpowiednie metody. W przypadku amplifikacji i wykrywania DNA HPV sposób według wynalazku jest odpowiedni do otrzymania zharmonizowanej jednostki odczynników (zestawu). W tej postaci zestaw może zawierać wszystkie następujące odczynniki lub dowolne ich połączenie oraz inne odczynniki: startery, mieszaninę starterów, bufory, termostabilną polimerazę, DNA HPV jako pozytywną kontrolę, DNA nie-hpv, DNA jako wzorzec wewnętrzny, sondy lub mieszaninę sond, koniugat przeciwciało-enzym. Opis sekwencji starterów i sond według wynalazku jest jedynie przykładowy. Fachowiec może zaprojektować wiele wariantów sond rodzajowych, jak i specyficznych dla typu, z wykorzystaniem rodzajowego lub specyficznego dla typu regionu genomowego HPV, a zatem zakresem wynalazku są objęte warianty, pod warunkiem, że są wybrane z regionu genomowego ujawnionego w opisie. Wynalazek przedstawiono bardziej szczegółowo w poniższych przykładach ilustrujących wynalazek. Jakkolwiek sposób, który stanowi podstawę wynalazku, jest przydatny do amplifikacji jakiegokolwiek genomu HPV, w poniższych przykładach zastosowano tylko genomy płciowych HPV, które mają większe znaczenie medyczne. P r z y k ł a d 1. Synteza starterów oligonukleotydowych Startery oligonukleotydowe stosowane w sposobie według wynalazku otrzymano ze źródła handlowego (IDT, USA). Startery zsyntetyzowano z 5'-grupą aminową. NHS-ester zastosowano do znakowania biotyną, fluoresceiną i digitoksygeniną. Znakowane nukleotydy oczyszczono metodą HPLC. P r z y k ł a d 2. Obróbka próbek, preparowanie DNA Próbki pobrane przez ginekologów za pomocą szczoteczki typu Cytobrush transportowano w roztworze PBS (10 mm sól fizjologiczna buforowana fosforanami, ph = 7,4, Sigma, NaCl 138 mm, KCl 2,7 mm). Wstępną obróbkę próbek wykonywano w probówkach testowych: przed lizą próbki odwirowano (2000 g, 10 minut), supernatanty odrzucono i dodano 1 ml roztworu PBS, zwirowano w aparacie vortex i ponownie odwirowano odrzucając supernatrant. Na koniec, do próbek dodano 250 μl roztworu lizującego (0,5 mg/ml proteinazy-k, 0,01 M TRIS-HCl ph = 8, 0,001 M EDTA ph = 8, w wodzie destylowanej), przy czym roztwór ten zawierał wzorzec wewnętrzny dla testu HPV (SEQ ID NO: 68), roztwór zwirowano w aparacie vortex i inkubowano przez 30 minut w 56 C. Od tego momentu wszystkie operacje na próbkach w stanie ciekłym wykonywano w robocie TECAN RSP150,: dodano 200 μl roztworu wiążącego (5,5 M GUSCN, 20 mm EDTA, 10 mm TRIS-HCl ph = 6,5, 65 mm ditiotreitol, 40 g/l krzemionki, SIGMA nr katalogowy: 28,851-3, woda destylowana) i krzemionkę oddzielono przez filtrację próżniową od rozpuszczalnych składników. Ponownie przeprowadzono filtrację dla dwukrotnego przemycia krzemionki 200 μl roztworu wiążącego bez krzemionki (5,5 M GUSCN, 20 mm EDTA, 10 mm TRIS-HCl ph = 6,5, 65 mm ditiotreitol, woda destylowana) oraz dwukrotnie użyto 200 μl roztworu przemywającego (25% alkohol izopropylowy, 25% 96% etanolu, 50% wody destylowanej, 0,1M NaCl), ostatecznie użyto 200 μl 96% etanolu.
PL 209 415 B1 9 Po wysuszeniu krzemionki na powietrzu DNA wyeluowano 200 μl roztworu 10 mm TRIS ph = 8,0. Wyeluowany DNA przechowywano w stanie zamrożonym w -20 C do dalszego stosowania. P r z y k ł a d 3. Ogólny opis wykrywania HPV Amplifikacja Całkowita objętość mieszaniny reakcyjnej wynosiła 25 μl, przy czym zawierała ona następujące składniki: 10 μl DNA, 2,5 μl 10 x buforu do polimerazy (końcowe stężenie: 10 mm TRIS-HCl (ph = 9,0), 50 mm KCl, 0,1% Triton X-100 (Promega)), 2 mm MgCl 2, 250 μm każdy dntp (ATP, CTP, GTP, TTP), 4 μm mieszanina starterów: SEQ ID NO: 35, 37-40, 73-75 i 1U polimerazy DNA Taq (Promega). Reakcję przeprowadzono w termocyklerze GeneAmp 9700 PCR przy następujących parametrach: cykl 1: 4 minuty w 95 C; cykle 2-40: 30 s w 94 C, 1 minuta w 48 C i 45 s w 72 C; cykl 41: 3 minuty w 72 C. Hybrydyzacja i wykrywanie Hybrydyzację przeprowadzono na fazie stałej. 24 godziny wcześniej, czarne, 96-studzienkowe płytki polistyrenowe (Costar) powleczono streptawidyną (0,02 mg/ml streptawidyny w roztworze PBS). Płytki inkubowano w temperaturze pokojowej i w 24 godziny później płytki przemyto 250 μl roztworu przemywającego [25 mm TRIS ph = 7,5, 125 mm NaCl, 20 mm MgCl 2, 3% Tween-20]. 20 μl produktu reakcji PCR rozcieńczono 140 μl wody destylowanej i 5 μl tego roztworu zmieszano z 45 μl buforu do wiązania [25 mm TRIS ph = 7,5, 125 mm NaCl, 5 mm EDTA-Na 2, 5 x roztwór Denhardta, 0,1% Tween-20] i rozdzielono do studzienek płytki powleczonej streptawidyną. Mieszaninę reakcyjną inkubowano w temperaturze pokojowej przez 30 minut w trakcie stałego wytrząsania. Następnie do mieszaniny dodano 50 μl buforu wymywającego [100 mm NaOH, 300 mm NaCl], inkubowano przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i płytki przemyto trzykrotnie 250 μl roztworu przemywającego [25 mm TRIS ph = 7,5, 125 mm NaCl, 20 mm MgCl 2, 3% Tween-20]. Po przemyciu do studzienek dodano 50 μl buforu do hybrydyzacji (5 x SSC (0,3M cytrynian Na, ph = 7, 3 M NaCl), 1 x roztwór Denhardta, 0,1% SDS], zawierającego sondy znakowane fluoresceiną (5 nm na sondę). Mieszaninę inkubowano przez 30 minut w 50 C w trakcie stałego wytrząsania i przemyto sześciokrotnie 250 μl roztworu przemywającego o wysokiej ostrości [0,05 x SSC, 0,3% Tween-20]. Następnie, dodano 50 μl buforu do sprzęgania [25 mm TRIS ph = 7,5, 125 mm NaCl, 2 mm MgCl 2, 0,3% Tween-20, 1% BSA] zawierającego przeciwciało anty-fluorescence-pod (Roche) (0,0015 E/reakcję). Płytki inkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej w trakcie stałego wytrząsania i przemyto sześciokrotnie 250 μl roztworu przemywającego o wysokiej ostrości [25 mm TRIS ph = 7,5, 125 mm NaCl, 20 mm MgCl 2, 3% Tween-20]. W celu wywołania dodano 135 μl roztworu substratu (5 objętości [45 mm kwas hydroksyfenylopropionowy (HPPA), rozpuszczony w 0,1M buforze TRIS-HCl ph = 9,0] + 1 objętość [0,6 g/litr H 2 O 2 w 20 mm buforze cytrynianowo-fosforanowym]). Aby przerwać reakcję po 20 minutach do mieszaniny reakcyjnej dodano 65 μl roztworu stop [0,75M glicyna, ph = 10,3]. Sygnał fluorescencji zmierzono za pomocą fluorymetru do płytek Spectra- Max przy 324/410 nm. Próbki uważano za pozytywne, gdy ich wartość była wyższa niż trzykrotność wartości średniej z trzech równoległych negatywnych próbek kontrolnych. P r z y k ł a d 4. Badanie porównawcze amplifikacji Do próbek dodano 10 ng/reakcję plazmidów zawierających sklonowany region HPV L1 z różnych genotypów i stosowano do amplifikacji i wykrywania DNA HPV sposobem według wynalazku. Reakcję PCR i hybrydyzację przeprowadzono w sposób opisany w przykładzie 3, z tym, że zmieniono skład starterów. Reakcja bez L1F2 (SEQ ID NO: 37) nie spowodowała amplifikacji genotypu HPV 35, podczas gdy starter L1F2 zapewniał skuteczne wykrycie genotypu HPV 35. P r z y k ł a d 5. Wykrywanie kilku genotypów HPV Do próbek dodano 10 ng/reakcję plazmidów zawierających sklonowany region HPV L1 z różnych genotypów i stosowano do amplifikacji i wykrywania DNA HPV sposobem według wynalazku. Reakcję PCR i hybrydyzację przeprowadzono w sposób opisany w przykładzie 3. Wykonano próby amplifikacji i typowania następujących genotypów HPV: 1-24, 26-42, 45, 47- -68, 72-74, 76-77, 86. Amplifikację następujących genotypów wykazano metodą elektroforezy w żelu agarozowym: 3, 6-7, 10-11, 13-14, 16, 18, 20, 24, 26, 29, 30-36, 39-40, 42, 45, 51, 52-55, 58-62, 66-68, 72. Przy użyciu mieszaniny sond hybrydyzacyjnych specyficznych względem rodzaju SEQ ID NO: 41-49 (w warunkach opisanych w przykładzie 3) można było wykryć następujące genotypy: 3-4, 6-7, 9-14, 16, 18, 20, 24, 26, 29, 30-37, 39-42, 45, 51, 52-55, 58-62, 66-68, 72, 74, 77. Dane wykazują, że część genotypów może być tylko wykryta przez hybrydyzację, co nie jest zaskakujące, gdyż hybrydyzacja jest około 10-100 razy bardziej czuła niż elektroforeza w żelu agaro-
10 PL 209 415 B1 zowym. Z danych tych wynika także, że hybrydyzacja specyficzna dla rodzaju umożliwia wykrycie wszystkich genotypów pozytywnych w elektroforezie w żelu agarozowym, co wskazuje na jej rzeczywiście specyficzną dla rodzaju naturę. P r z y k ł a d 6. Wykrywanie typu HPV-35 Do próbek dodano 10 ng/reakcję plazmidów zawierających sklonowany region HPV L1 z różnych genotypów i stosowano do amplifikacji i wykrycia DNA HPV sposobem według wynalazku. Reakcje PCR i hybrydyzację przeprowadzono w sposób opisany w przykładzie 3. Sondę do hybrydyzacji stanowił oligonukleotyd zaprojektowany dla genotypu HPV 35 (SEQ ID NO: 58). Przeprowadzono próby wykrycia następujących amplikonów: 3-4, 6-7, 9-14, 16, 18, 20, 24, 26, 29, 30-37, 39-42, 45, 51, 52-55, 58-62, 66-68, 72, 74, 77. Sonda wykrywała tylko amplikon odpowiadający genotypowi HPV 35. P r z y k ł a d 7. Wykrywanie HPV z wzorcem wewnętrznym Wykrywanie dla próbek przygotowanych zgodnie z przykładem 2 przeprowadzono zgodnie z przykładem 3, z tym, że sondę wzorca wewnętrznego znakowaną digitoksygeniną (jej ilość była taka sama jak sond specyficznych dla typu) zastosowano z sondami specyficznymi dla typu, a w etapie sprzęgania były równocześnie obecne przeciwciała przeciw fluoresceinie-pod i przeciw alp-alp [1: 2000, Jackson Immuno Research]. Po wywołaniu reakcji POD (patrz przykład 2), przeprowadzono wywołanie ALP w następujący sposób: roztwór substratu zawierał 6,25 mg/100 ml fosforanu 4-metyloumbeliferylu w buforze 100 mm i TRIS ph = 9,0, 0,5 mm MgCl 2. Po wywołaniu HPPA płytkę do mikromianowania przemyto jednorazowo [25 mm TRIS ph = 7,5, 125 mm NaCl, 20 mm MgCl 2, 3% Tween-20] i do każdej studzienki reakcyjnej dodano 150 μl roztworu substratu. Po 30 minutach inkubacji sygnał fluorescencji zmierzono za pomocą fluorymetru do płytek SpectraMax przy 355/460 nm. Próbki uznano za pozytywne, gdy ich wartość była wyższa niż trzykrotność wartości średniej z trzech równoległych negatywnych próbek kontrolnych. Sondy specyficzne dla typów wykryły tylko odpowiednie typy. Wykrywanie kontroli wewnętrznej było pozytywne w każdej reakcji, za wyjątkiem tych reakcji, w których wystąpiło silne współzawodnictwo pomiędzy amplifikacją HPV a kontrolą wewnętrzną. Nie było zahamowanych reakcji (DNA HPV lub DNA kontroli wewnętrznej zamplifikował się we wszystkich próbkach). Kontrola wewnętrzna odpowiednio wykluczyła możliwość wyników fałszywych negatywnych.
PL 209 415 B1 11
12 PL 209 415 B1
PL 209 415 B1 13
14 PL 209 415 B1
PL 209 415 B1 15
16 PL 209 415 B1
PL 209 415 B1 17
18 PL 209 415 B1
PL 209 415 B1 19
20 PL 209 415 B1
PL 209 415 B1 21
22 PL 209 415 B1
PL 209 415 B1 23
24 PL 209 415 B1
PL 209 415 B1 25
26 PL 209 415 B1
PL 209 415 B1 27
28 PL 209 415 B1
PL 209 415 B1 29
30 PL 209 415 B1
PL 209 415 B1 31
32 PL 209 415 B1
PL 209 415 B1 33
34 PL 209 415 B1
PL 209 415 B1 35
36 PL 209 415 B1 Zastrzeżenia patentowe 1. Mieszanina starterów do amplifikacji, znamienna tym, że zawiera startery L1C1, L1C2, nowy L1C2 o SEQ ID NO: 73-75, SEQ ID NO: 37-40 i SEQ ID NO: 35 oraz ewentualnie co najmniej jeden starter wybrany z grupy obejmującej startery SEQ ID NO: 70-72 oraz SEQ ID NO: 1-34 i 36. 2. Zastosowanie mieszaniny starterów zdefiniowanej w zastrz. 1 do amplifikacji genotypów 3, 4, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 18, 20, 24, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 39, 40, 41, 42, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 59, 60, 61, 66, 67, 68, 72, 74 i 77 ludzkiego wirusa brodawczaka. 3. Sposób wykrywania jednego lub większej liczby genotypów HPV w próbkach biologicznych, znamienny tym, że obejmuje etapy, w których: a) przygotowuje się jeden lub większą liczbę amplikonów z użyciem mieszaniny starterów zdefiniowanej w zastrz. 1, z cząsteczek kwasów nukleinowych wyekstrahowanych z próbki biologicznej; oraz b1) hybrydyzuje się amplikon otrzymany w (a) w ostrych warunkach z sondą do hybrydyzacji specyficzną dla rodzaju genotypu; oraz ewentualnie b2) hybrydyzuje się amplikon otrzymany w (a) w ostrych warunkach z sondą specyficzną dla rodzaju HPV. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że sondę specyficzną dla rodzaju HPV stanowi: i) konsensusowa sonda lub starter dla HPV hybrydyzujący z sekwencją SEQ ID NO: 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108 lub 110; ii) sonda komplementarna do sondy w (i); albo iii) sekwencja wybrana spośród SEQ ID NO: 41-49. 5. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że sondę do hybrydyzacji specyficzną dla genotypu stanowi: i) sonda specyficzna dla genotypu HPV hybrydyzująca z sekwencją SEQ ID NO: 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109 lub 111; ii) sonda komplementarna do sondy w (i); albo iii) sekwencja wybrana spośród SEQ ID NO: 50-67. 6. Sposób według zastrz. 3 albo 4, albo 5, znamienny tym, że wykrywa się grupy genotypów HPV niskiego i wysokiego ryzyka. 7. Sposób według zastrz. 3 albo 4, albo 5, albo 6, znamienny tym, że obejmuje ponadto wykrywanie syntetycznego oligonukleotydu jako wzorca wewnętrznego. 8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że jako wzorzec wewnętrzny stosuje się sekwencję SEQ ID NO: 68, a do jej wykrywania stosuje się SEQ ID NO: 69 jako sondę do hybrydyzacji.
PL 209 415 B1 37 9. Zestaw odczynników do wykrywania i typowania HPV, znamienny tym, że zawiera: i) mieszaninę starterów zdefiniowaną w zastrz. 1; ii) ewentualnie oligonukleotyd jako wzorzec wewnętrzny, korzystnie o SEQ ID NO: 68; iii) sondy do hybrydyzacji zawierające lub hybrydyzujące z sekwencją SEQ ID NO: 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109 lub 111 oraz ewentualnie z sekwencją SEQ ID NO: 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108 lub 110; oraz iv) ewentualnie sondy do hybrydyzacji, korzystnie o SEQ ID NO: 69, wykrywające wzorzec wewnętrzny.
38 PL 209 415 B1 Departament Wydawnictw UP RP Cena 7,38 zł (w tym 23% VAT)