dr n. med Anna Nogalska

Imię i nazwisko: dr n. med Anna Nogalska Katedra i Zakład Biochemii Gdański Uniwersytet Medyczny ul. Dębinki 1 80-211 Gdańsk AUTOREFERAT Posiadane dyplomy/stopnie naukowe: 2003 r. stopień doktora nauk medycznych w zakresie biologii medycznej uzyskany w Katedrze i Zakładzie Biochemii Gdańskiej Akademii Medycznej na podstawie pracy pt. Zależne od wieku zmiany ekspresji genów kodujących leptynę i syntazę kwasów tłuszczowych w tkance tłuszczowej szczurów, promotor: prof. dr hab. Julian Świerczyński. 1996 r. tytuł magistra biologii specjalizacja biologia molekularna uzyskany w Katedrze Mikrobiologii Uniwersytetu Gdańskiego. Dotychczasowe zatrudnienie: od 1996 r. - Asystent w Katedrze i Zakładzie Biochemii Akademii Medycznej w Gdańsku/Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego; od lutego 2004 r. na bezpłatnym urlopie naukowym. 02. 2004-04.2014 - Research Associate, Neuromuscular Center, Department of Neurology, University of Southern California, Los Angeles, Kalifornia, USA od 05. 2014 r. - Research Laboratory Specialist, Department of Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, University of Southern California, Los Angeles, Kalifornia, USA 1. WYKAZ PUBLIKACJI STANOWIĄCYCH OSIĄGNIĘCIE NAUKOWE, O KTÓRYM MOWA W ART. 16 UST. 2 USTAWY A) Tytuł osiągnięcia naukowego: Rola stresu retikulum endoplazmatycznego w patogenezie wtrętowego zapalenia mięśni. B) Publikacje wchodzące w skład osiągnięcia naukowego: 1. Askanas V, Engel WK, Nogalska A. Inclusion body myositis: a degenerative muscle disease associated with intra-muscle fiber multi-protein aggregates, proteasome inhibition, 1

endoplasmic reticulum stress and decreased lysosomal degradation. Brain Pathol 19:493 506, 2009. (IF: 5.903; MNiSW: 32; cytowania: 56) Mój wkład w powstanie tej pracy polegał na pisaniu i redakcji tekstu, opracowaniu i przygotowaniu Tabeli 1. Mój udział procentowy szacuję na 30%. 2. Nogalska A, Engel WK, McFerrin J, Kokame K, Komano H, Askanas V. Homocysteineinduced endoplasmic reticulum protein (Herp) is up-regulated in sporadic inclusion-body myositis and in endoplasmic reticulum stress-induced cultured human muscle fibers. J Neurochem, 96:1491-9, 2006. (IF: 4.260; MNiSW: 24; cytowania: 30) Mój wkład w powstanie tej pracy polegał na opracowaniu koncepcji badań, zaplanowaniu i wykonaniu doświadczeń (z wyjątkiem hodowli włókien mięśniowych prowadzonych przez J. McFerrin), analizie statystycznej i interpretacji wyników badań, napisaniu wstępnej wersji manuskryptu i redakcji tekstu. Mój udział procentowy szacuję na 70%. 3. Nogalska A, Wojcik S, Engel WK, McFerrin J, Askanas V. Endoplasmic reticulum stress induces myostatin precursor protein and NF-kappaB in cultured human muscle fibers: relevance to inclusion body myositis. Exp Neurol, 204:610-8, 2007. (IF: 3.982; MNiSW: 20; cytowania: 24) Mój wkład w powstanie tej pracy polegał na opracowaniu koncepcji badań, zaplanowaniu i wykonaniu doświadczeń (z wyjątkiem Western blotów miostatyny i kaspazy-3 wykonanych przez S. Wójcika oraz hodowli włókien mięśniowych prowadzonych przez J. McFerrin), analizie statystycznej i interpretacji wyników badań, napisaniu wstępnej wersji manuskryptu i redakcji tekstu. Mój udział procentowy szacuję na 70%. 4. Nogalska A, D Agostino C, Engel WK, Davies KJ, Askanas V. Decreased SIRT1 deacetylase activity in sporadic inclusion-body myositis muscle fibers. Neurobiol Aging. 31:1637-1648, 2010 (IF: 6.634; MNiSW: 32; cytowania: 12) Mój wkład w powstanie tej pracy polegał na opracowaniu koncepcji badań, zaplanowaniu i wykonaniu doświadczeń (z wyjątkiem części Western blotów acetylowanych białek p65, p53 i H4 wykonanych przez C. D Agostino), analizie statystycznej i interpretacji wyników badań, napisaniu wstępnej wersji manuskryptu i redakcji tekstu. 2

Mój udział procentowy szacuję na 70%. 5. Nogalska A, Engel WK, Askanas V. Increased BACE1 mrna and non-coding BACE1- antisense transcript in sporadic inclusion body myositis muscle fibers possibly caused by endoplasmic reticulum stress. Neurosci Lett, 47(3):140-143, 2010. (IF: 2.055; MNiSW: 20; cytowania: 11) Mój wkład w powstanie tej pracy polegał na opracowaniu koncepcji badań, zaplanowaniu i wykonaniu wszystkich doświadczeń, analizie statystycznej i interpretacji wyników badań, napisaniu wstępnej wersji manuskryptu i redakcji tekstu. Mój udział procentowy szacuję na 85%. 6. Nogalska A, D Agostino C, Terracciano C, Engel WK, Askanas V. Impaired autophagy in sporadic inclusion-body myositis muscle fibers and in endoplasmic reticulum stressprovoked cultured human muscle fibers. Am J Pathol. 177(3):1377-1387, 2010. (IF: 5.673; MNiSW: 32; cytowania: 29) Mój wkład w powstanie tej pracy polegał na opracowaniu koncepcji badań, zaplanowaniu i wykonaniu doświadczeń (z wyjątkiem części Western blotów wykonanych przez C. D Agostino oraz części Western blotów kinazy ps70 wykonanych przez przez C. Terracciano), interpretacji wyników badań, analizie statystycznej wyników, napisaniu wstępnej wersji manuskryptu i redakcji tekstu. Mój udział procentowy szacuję na 70%. Sumaryczny IF publikacji tworzących osiągnięcie naukowe 28.507, punktacja MNiSzW: 160; Łączna liczba cytowań: 162 C) Omówienie celu naukowego ww. prac i osiągniętych wyników wraz z omówieniem ich ewentualnego wykorzystania. Wtrętowe zapalenie mięśni (WZM)(ang. sporadic inclusion-body myositis, s-ibm) jest najczęstszym zwyrodnieniowym schorzeniem mięśni szkieletowych występującym u osób po 50-tym roku życia (Dimachkie and Barohn, 2013; Engel and Askanas, 2006). Choroba postępuje powoli, ale systematycznie i zazwyczaj w ciągu 10 lat od diagnozy pacjent przestaje chodzić (Weihl and Pestronk, 2010). Obraz kliniczny obejmuje osłabienie i atrofię mięśni czworogłowego uda i pośladkowego wielkiego, oraz zginaczy głębokich palców oraz grzbietowych stopy (Dimachkie and Barohn, 2013; Engel and Askanas, 2006). W obrazie 3

histopatologicznym biopsji mięśniowej charakterystyczne dla wtrętowego zapalenia mięśni są naciek zapalny z CD8-pozytywnymi limfocytami T, a także, wewnątrz włókien mięśniowych, obecność wakuoli oraz białkowych złogów o charakterze amyloidu (Ryc. 1) (Askanas et al., 2012b; Dalakas, 2012; Dimachkie and Barohn, 2013; Engel and Askanas, 2006; Weihl and Pestronk, 2010). Te wielobiałkowe wtręty zawierają między innymi białko prekursora β- amyloidu (AβPP)/β-amyloid, hiperfosforylowane białko tau (p-tau) czy α-synukleinę - białka charakterystyczne dla chorób degeneracyjnych mózgu takich jak choroba Alzheimera czy Parkinsona (Askanas et al., 2012b; Iqbal et al., 2010; LaFerla, 2010; Selkoe, 2011; Weihl and Pestronk, 2010). Na poziomie molekularnym wyróżnić można dwa rodzaje wtrętów: blaszki (ang. plaques) zawierające głównie β-amyloid i szereg innych białek wiążących się doń, oraz złogi włókienkowate (ang. squiggles) zbudowane przede wszystkim z fosforylowanego białka tau, które łaczy się w helikalne podwójne filamenty, dodatkowo zawierające białko sekwestosom 1/p62 i szereg innych (Askanas and Engel, 2006; Askanas and Engel, 2007; Askanas et al., 2012a). Ryc. 1. Charakterystyczne cechy biopsji mięśniowej we wtrętowym zapaleniu mięśni. A) włókna mięśniowe z wakuolami (barwienie trójbarwne zmodyfikowaną metodą Gomoriego), B) zapalny naciek komórek jednojądrzastych pomiędzy włóknami mięśniowymi (barwienie trójbarwne zmodyfikowaną metodą Gomoriego), C) różowe wtręty amyloidu (barwienie fioletem krystalicznym), D) parzyste helikalnie skręcone włókienka (ang. paired helical filaments, PHFs) zawierające fosforylowane białko tau (immnohistochemiczne barwienie z zastosowaniem przeciwciał rozpoznajacych białko p62, integralny składnik PHFs). Patogeneza wtrętowego zapalenia mięśni jest złożona i wieloczynnikowa, a pierwotna przyczyna wywołująca proces chorobowy wciąż pozostaje nieznana. Dwa mechanizmy odgrywają kluczową rolę, a są to degeneracja włókien mięśniowych oraz proces zapalny (Askanas and Engel, 2011; Askanas et al., 2012b; Dalakas, 2008). Jakkolwiek odpowiedź immunologiczna przyczynia się do postępującego osłabienia mięśni, leczenie chorych na 4

WZM kortykosteroidami i plazmaferezą nie przynosi poprawy (Dalakas, 2011; Dimachkie and Barohn, 2013; Engel and Askanas, 2006). Coraz więcej wyników badań sugeruje, że główną przyczyną degeneracji włókien mięśniowych we WZM jest patologiczne gromadzenie się wewnątrz włókien mięśniowych, w formie złogów, białka prekursora β-amyloidu (AβPP)/βamyloidu oraz innych białek wskutek: a) zwiększonej transkrypcji, b) zaburzeń modyfikacji post-tranlacyjnych i c) zaburzeń procesów degradacji tychże białek, czemu sprzyja klimat starzenia się mięśni. Zidentyfikowano szereg wewnątrzkomórkowych procesów odgrywających ważną rolę w patogenezie wtrętowego zapalenia mięśni takich jak stres oksydacyjny, obniżenie aktywności protesomów, stres retikulum endoplazmatycznego i obniżenie aktywności lizosomów (Askanas et al., 2012a; Lloyd, 2010). Szczegółowy opis zwyrodnieniowego aspektu wtrętowego zapalenia mięśni, białek wchodzących w skład cytoplazmatycznych wtrętów oraz postulowanych mechanizmów ich powstawania opublikowaliśmy w Brain Pathology (2009) (praca nr 1). Retikulum endoplazmatyczne pełni, między innymi, istotną rolę w procesie nadawania prawidłowej konformacji nowosyntetyzowanym białkom (Roussel et al., 2013). Szereg białek opiekuńczych zlokalizowanych w świetle retikulum endoplazmatycznego czuwa nad prawidłowym przebiegiem tego procesu (Mori, 2000; Walter and Ron, 2011). Wiele różnych czynników zaburzających homeostazę retikulum endoplazmatycznego może prowadzić do nagromadzenia się niezwiniętych lub nieprawidłowo pofałdowanych białek w jego świetle, co wywołuje stres retikulum endoplazmatycznego (stres ER)(ang. endoplasmic reticulum stress) (Mori, 2000; Roussel et al., 2013; Zhang and Kaufman, 2008). W reakcji na ten stres, jako mechanizm samoobrony, komórka uruchamia system odpowiedzi na obecność niesfałdowanych białek (UPR)(ang. unfolded protein response). Jego zadaniem jest zapobieganie dalszemu gromadzeniu się nieprawidłowo sfałdowanych białek w retikulum endoplazmatycznym, a w razie niepowodzenia doprowadzenie do apoptozy komórki (Mori, 2000; Roussel et al., 2013; Zhang and Kaufman, 2008). Herp, białko retikulum endoplazmatycznego indukowane homocysteiną (ang. homocysteineinduced endoplasmic reticulum protein), zlokalizowane w błonie retikulum endoplazmatycznego, pod wpływem stresu ER ulega najintensywniejszej ekspresji ze 5

wszystkich białek odpowiedzi na nieprawidłowo złożone białka (Kokame et al., 2000; Yamamoto et al., 2004). Odgrywa ono istotną rolę w degradacji białek związanych z ER (ang. ER-associated degradation, ERAD), utrzymywaniu homeostazy wapniowej i regulacji apoptozy (Chan et al., 2004; Hori et al., 2004; Yamamoto et al., 2004). W pracy opublikowanej w Journal of Neurochemistry (2006)(praca nr 2) wykazaliśmy, że w porównaniu do osób kontrolnych we włóknach mięśniowych pacjentów z WZM ilość mrna i białka Herp jest znacząco zwiększona. W cytoplazmie 70-80% zwakuolizowanych włókien mięśniowych WZM białko Herp gromadziło się w formie wtrętów różnej wielkości, gdzie współwystępowało z ubikwityną, AβPP/β-amyloidem, GRP78 oraz podjednostką β2 proteasomu. Podobnych Herp-pozytywnych inkluzji nie wykryliśmy w biopsjach pacjentów zdrowych czy cierpiących na inne choroby nerwowo-mięśniowe. Wyniki te wskazują na istotną rolę stresu ER i aktywacji szlaków odpowiedzi na nieprawidłowo złożone białka we WZM. W badaniach nad molekularnymi mechanizmami patogenetycznymi wtrętowego zapalenia mięśni niezastąpione są hodowle ludzkich włókien mięśniowych poddawane traktowaniu związkami chemicznymi indukującymi odpowiednie szlaki sygnalizacyjne. W opisywanej pracy użyliśmy epoksymicynę inhibitor aktywności proteosomów (Meng et al., 1999) oraz tunikamycynę lub tapsigarginę - dwa znane induktory stresu ER (Back et al., 2005; Lee, 2005) tworząc nowy eksperymentalny model WZM. Eksperymentalnie wywołany stres ER indukował ekspresję Herp, o czym świadczy wzrost ilości białka oraz mrna Herp, podczas gdy zahamowanie aktywności proteasomów skutkowało wzrostem ilości białka bez jednoczesnych zmian ilości mrna Herp. W hodowlach traktowanych epoksymicyną zaobserwowaliśmy ponadto powstawanie ubikwitynowanych Herp-pozytywnych złogów. Przedstawione wyniki sugerują, że obserwowany we wtrętowym zapaleniu mięśni wzrost Herp może być następstwem stresu ER oraz obniżonej aktywności proteasomów, podkreślając znaczenie tych mechanizmów w patogenezie WZM. Miostatyna, należąca do nadrodziny transformujących czynników wzrostu β (ang. transforming growth factor, TGF-β) jest negatywnym regulatorem masy mięśniowej (Gonzalez-Cadavid and Bhasin, 2004; Joulia-Ekaza and Cabello, 2006). Myszy z naturalną mutacją w genie kodującym miostatynę, myszy transgeniczne w wyciszoną ekspresją tego 6

genu lub nadprodukujące białka hamujące działanie miostatyny charakteryzują się zwiększoną masą mięśniową (Gonzalez-Cadavid and Bhasin, 2004). Dlatego też miostatyna jest kuszącym celem w poszukiwaniu skutecznych terapii wielu chorób nerwo-mięśniowych. We włóknach mięśniowych pacjentów z WZM zaobserwowano wzrost ilości białka prekursora oraz dimeru miostatyny, ich gromadzenie się w postaci złogów wspólnie z AβPP/Aβ i postulowano, że te białka wiążąc się ze sobą mogą napędzać wzajemną agregację i tworzenie struktur amyloidowych typu β-harmonijki (Wojcik et al., 2005). W pracy opublikowanej w Experimental Neurology (2007)(praca nr 3) zastosowaliśmy opisany powyżej model WZM z indukowanym stresem ER i pokazaliśmy, że tunikamycyna i tapsigargina wywołują stres ER i indukują odpowiedź na nieprawidłowo złożone białka w hodowlach ludzkich włókien mięśniowych, potwierdzając użyteczność tego modelu w badaniach potencjalnych mechanizmów patogenezy WZM. Następnie wykazaliśmy jako pierwsi, że stres ER zwiększa ekspresję prekursora miostatyny i jego mrna. Wyjaśniliśmy też, że mechanizm działania obejmuje indukowaną stresem ER aktywację czynnika transkrypcyjnego NF-κB, i jest odmienny od mechanizmu zależnej od stresu ER indukcji Herp and GRP78, typowych białek odpowiedzi na nieprawidłowo złożone białka (UPR). Ponadto wykazaliśmy zwiększone wiązanie NF-κB do DNA w biopsjach pacjentów z WZM i postulowaliśmy, że stres ER może być jedną z przyczyn aktywacji NF-κB, który w konsekwencji może indukować ekspresję miostatyny i prowadzić do atrofii włókien mięśniowych. Nasze wyniki wskazują na nowe cele terapeutyczne we WZM i możliwe, że także innych chorobach nerwo-mięśniowych. W pracy opublikowanej w Neurobiology of Aging (2010)(praca nr 4) poszukując przyczyn zwiększonej aktywacji NF-κB we wtrętowym zapaleniu mięśni zbadaliśmy ekspresję SIRT1, białka należącego do rodziny NAD + -zależnych deacetylaz histonów/białek (Haigis and Guarente, 2006; Michan and Sinclair, 2007). Znanym substratem SIRT1 jest NF-κB, którego acetylacja/obniżona deacetylacja powoduje zwiększenie aktywności (Yeung et al., 2004). W tej publikacji wykazaliśmy, że we WZM ilość mrna i białka SIRT1 jest zwiększona, ale jednocześnie aktywność enzymatyczna deacetylazy jest obniżona. Konsekwentnie zaobserwowaliśmy wzrost acetylowanych białek: histonu 4, podjednostki p65 czynnika transkrypcyjnego NF-κB oraz białka p53, głównych substratów SIRT1 (Vaquero et al., 2007; Vaziri et al., 2001; Yeung et al., 2004). Chociaż SIRT1 jest białkiem przede wszystkim 7

wykrywanym w jądrach komórkowych (Haigis and Guarente, 2006; Michan and Sinclair, 2007), w biopsjach pacjentów z WZM ilość białka SIRT1 w ekstraktach jądrowych była niższa w porównaniu z kontrolami, a w cytozolu wykryliśmy SIRT1-pozytywne wtręty, które często zlokalizowane były w pobliżu jąder komórkowych. Możliwe jest, że uwięzienie SIRT1 w cytoplazmatycznych wtrętach uniemożliwia jej transport do jąder komórkowych i odpowiada za obniżoną aktywność enzymatyczną SIRT1. W celu wyjaśnienia czy indukowana stresem ER aktywacja NF-κB może zależeć od aktywności SIRT1 zastosowaliśmy eksperymentalny model WZM z wywołanym tunikamycyną stresem ER. Okazało się, że stress ER prowadził do wzrostu ilości mrna i białka SIRT1, obniżenia aktywności enzymatycznej deacetylazy i w konsekwencji wzmożonej acetylacji podjednostki p65 NF-κB (wzrostu aktywności NF-κB). Wyniki te pokazują, że eksperymentalnie wywołany stres ER prowadzi do zaburzeń SIRT1 podobnych do tych zachodzących w biopsjach pacjentów z WZM. Nieprawidłowe funkcjonowanie SIRT1 może mieć poważne reperkusje. Aktywacja NF-κB poprzez upośledzenie zależnej od SIRT1 deacetylacji może wywoływać proces zapalny oraz podwyższać miostatynę i prowadzić do atrofii włókien mięśniowych. Ponieważ opisywano, że w różnych modelach eksperymentalnych SIRT1 ma też działąnie ochronne przed toksycznością β-amyloidu (Qin et al., 2006), możliwym jest, że obniżona aktywność tego enzymu może częściowo przyczyniać się do opisywanych we WZM zaburzeń przemian β- amyloidu oraz jego prekursora. Nasze wyniki sugerują, że znane aktywatory SIRT1 (np. resveratrol, polifenol, którego naturalnym źródłem są winogrona, czarne jagody czy czerwone wino (Cucciolla et al., 2007)), mogłyby znaleźć zastosowanie w leczeniu chorych z wtrętowym zapaleniem mięśni. BACE1 jest śródbłonową proteazą aspartylową pełniącą między innymi rolę β-sekretazy w amyloidogennej proteolizie białka prekursora β-amyloidu (Stockley and O'Neill, 2008). We wtrętowym zapaleniu mięśni opisano zwiększenie ilości białka BACE1 oraz jego akumulację w złogach zawierających również białko prekursora β-amyloidu/β-amyloid (Vattemi et al., 2001; Vattemi et al., 2003; Wojcik et al., 2007). Na podstawie tych badań zaproponowano rolę BACE1 w inicjacji procesu powstawania toksycznego β-amyloidu we WZM. Podobnie wykazano, że ilość białka BACE1 była zwiększona w hodowlach ludzkich włókien mięśniowych z wywołanym stresem ER (Wojcik et al., 2007). Moja praca opublikowana w 8

Neuroscience Letters (2010)(praca nr 5) sugeruje mechanizm mogący odpowiadać za opisane zmiany ekspresji BACE1. BACE1 jest enzymem ograniczającym szlaku amyloidogennej proteolizy białka prekursora β-amyloidu (Stockley and O'Neill, 2008). Jednym z czynników regulujących ekspresję BACE1 jest odkryty niedawno długi niekodujący antysensowny transkrypt BACE1 (BACE1-AS), komplementarny do mrna BACE1 (Faghihi et al., 2008). Wykazano, że wzrost ilości transkryptu BACE1-AS powoduje wzrost ilości mrna i białka BACE1 (Faghihi et al., 2008). W naszej pracy przedstawiliśmy wzrost mrna BACE1 oraz transkrypu BACE1-AS w biopsjach pacjentów z wtrętowym zapaleniem mięśni w porównaniu z biopsjami pobranymi od osób kontrolnych. Ponadto, po raz pierwszy udokumentowaliśmy, że stres ER wywołuje wzrost transkryptu BACE1-AS i prowadzi do zwiększenia ilość mrna BACE1 w hodowlach ludzkich włókien mięśniowych. Wyniki te wskazują, że BACE1-AS, podwyższony wskutek stresu ER, może być przyczyną obserwowanego we WZM wzrostu ilości mrna i białka BACE1 i prowadzić do wzmożonej produkcji β-amyloidu. Obniżanie BACE1, poprzez celowane obniżenie transkryptu BACE1-AS lub redukcję stresu ER może w przyszłości znaleźć zastosowanie w leczeniu pacjentów cierpiących na WZM. Mimo, że obecność autofagicznych wakuoli we włóknach mięśniowych pacjentów z WZM jest oczywista (Carpenter et al., 1978; Engel and Askanas, 2006; Kumamoto et al., 2004; Tsuruta et al., 2001), mechanizmy prowadzące do ich powstawania nie są znane. W pracy opublikowanej w American Journal of Pathology (2010)(praca nr 6) podjęliśmy próbę ich wyjaśnienia. Autofagia, to proces degradacji uszkodzonych lub niepotrzebnych składników struktur komórkowych, makrocząsteczek i organelli, z zaangażowaniem układu endosomalnolizosomalnego (Martinez-Vicente and Cuervo, 2007; Nixon, 2007; Shacka et al., 2008). W makroautofagii materiał komórkowy przeznaczony do degradacji dostarczany jest do lizosomów przy udziale autofagosomów (Martinez-Vicente and Cuervo, 2007; Nixon, 2007; Shacka et al., 2008). Główną rolę w regulacji makroautofagii odgrywa kinaza ssaczy gen rapamycyny (ang. mammalian target of rapamycin, mtor), a najlepszym markerem ilości autofagosomów i autofagolizosomów w komórkach jest białko LC3-II, powstające wskutek konwersji białka LC3 z rozpuszczalnej postaci LC3-I do lipofilnej formy LC3-II wbudowywanej w błony nowopowstających autofagosomów (Klionsky et al., 2012; Nixon, 2007; Shacka et al., 2008). W opisywanej pracy wykazaliśmy, że we włóknach mięśniowych 9

pacjentów z wtrętowym zapaleniem mięśni zachodzi zwiększone formowanie i dojrzewanie autofagosomów, ponieważ w porównaniu do kontroli zaobserwowaliśmy w nich wzrost ilości LC3-II oraz obniżenie zależnej od mtor fosforylacji kinazy p70s6. Ponadto jako pierwsi opisaliśmy, że pomimo wzrostu ilości białka katepsyn B i D, głównych proteaz lizosomalnych, ich aktywność enzymatyczna była znacząco niższa niż u kontroli. Wyniki te wskazują na niewydolność procesu autofagii we WZM. Dla porównania użyliśmy biopsje pacjentów z zapaleniem wielomięśniowym (ZWM) (ang. polymyositis), inną miopatią zapalną, i wykazaliśmy, że w ZWM ilość białka LC3-II była również zwiększona, ale aktywność katepsyny D była porównywalna do kontroli, a katepsyny B była znacząco podwyższona. Nasze badania morfologiczne wykazały, że białko LC3 we włóknach mięśniowych pacjentów z WZM gromadziło się w cytoplazmie w formie dużych agregatów, często w pobliżu wakuoli, podczas gdy w biopsjach z ZWM formowało drobne złogi w niewielkiej ilości włókien. W transportowaniu ubikwitynowanych białek przeznaczonych do degradacji uczestniczy białko sekwestosom 1/p62, które ma zdolność wiązania LC3-II (Bjorkoy et al., 2005; Komatsu et al., 2007). We włóknach mięśniowych WZM, chociaż białka te były zlokalizowane blisko siebie, nie kolokalizowały ściśle i nie wiązały się ze sobą, wskazując na możliwe upośledzenie procesu dostarczania białek do autofagosomów. Nasze wyniki wskazują na aktywację makroautofagii we WZM, jednakże wskutek upośledzenia aktywności lizosomów wydajność procesu degradacji białek jest wyraźnie obniżona, co może być przyczyną powstawania wakuoli oraz aggregatów białkowych we włóknach mięśniowych. W celu zidentyfikowania mechanizmów, które mogą odgrywać rolę w obniżaniu wydajności lizosomów, w omawianej pracy zastosowaliśmy hodowle ludzkich włókien mięśniowych z eksperymentalnie wywołanym stresem ER lub zahamowaną aktywnością proteasomów. Dla porównania użyliśmy też hodowle traktowane chlorokiną lub bafilomycyną, znanymi inhibitorami lizosomów podwyższającmi lizosomalne ph (Shacka et al., 2006). Zahamowanie aktywności lizosomów w hodowlach ludzkich włókien mięśniowych powodowało wzrost ilości LC3-II oraz obniżało ilość fosforylowanej kinazy p70s6. Podobny efekt zaobserwowaliśmy w obu modelach eksperymentalnych. Zgodnie z mechanizmem działania, w hodowlach traktowanych chlorokiną czy bafilomycyną, aktywność enzymatyczna katepsyny D i B była zahamowana. Obniżenie aktywności katepsyny D i B wykazaliśmy także w hodowlach z wywołanym stresem ER, podczas gdy inhibitor aktywności proteasomów nie 10

miał wpływu na aktywność katepsyny D. Analiza morfologiczna za pomocą mikroskopii świetlnej i elektronowej hodowli z wywołanym stresem ER wykazała charakterystyczne dla hodowli z zahamowaną aktywnością lizosomów zmiany w postaci wakuoli wypelnionych niezdegradowanym materiałem pochodzenia lizosomalnego. Ponadto opisaliśmy wyraźne obniżenie ilości białka VMA21 w naszym eksperymentalnym modelu stresu ER w porównaniu do hodowli kontrolnych. Ponieważ białko to pełni istotną rolę w składaniu V-ATPazy odpowiedzialnej za utrzymanie ph w lizosomach (Ramachandran et al., 2013), zaproponowaliśmy, że niedobór VMA21 indukowany stresem ER może być przyczyną obniżenia aktywności enzymów lizosomalnych. Praca niniejsza stanowi istotny wkład w wyjaśnienie mechanizmów biorących udział w patogenezie wtrętowego zapalenia mięśni. Strategie terapeutyczne ukierunkowane na odblokowanie niewydolnych procesów degradacji białek mogą być nadzieją dla pacjentów z wtrętowym zapaleniem mięśni. W pracach stanowiących osiągnięcie naukowe wykazałam wraz z zespołem: a) Nieprawidłowości ekspresji białka Herp w biopsjach pacjentów z WZM, oraz stosując modele eksperymentalne wskazaliśmy stres ER oraz zahamowanie aktywności proteasomów jako potencjalne mechanizmy indukujące te zmiany; b) Stres ER jako mechanizm indukujący ekspresję miostatyny w hodowlach ludzkich włókien mięśniowych prawdopodobnie poprzez zależną od stresu ER aktywację czynnika transkrypcyjnego NF-κB; c) Obniżoną aktywność SIRT1 w biopsjach pacjentów z WZM oraz w hodowlach ludzkich włókien mięśniowych z wywołanym stresem ER i zaproponowaliśmy, że może ona odpowiadać za nadmierną aktywację NF-κB. d) Stres ER jako czynnik wywołujący wzrost transkryptu BACE1-AS oraz mrna BACE1 w hodowlach ludzkich włókien mięśniowych, oraz wzrost mrna BACE1 oraz transkrypu BACE1-AS w biopsjach pacjentów z wtrętowym zapaleniem mięśni. e) Upośledzenie procesu autofagii w biopsjach pacjentów z WZM, wskutek obniżenia aktywności lizosomalnych proteaz katepsyny D i B, a także udokumentowaliśmy zachodzenie podobnych nieprawidlowości tego procesu w hodowlach z wywołanym stresem ER. 11

Podumowując przedstawione powyżej wyniki, otrzymane z biopsji mięśniowych pacjentów cierpiących na wtrętowe zapalenie mięśni oraz z hodowli ludzkich włókien mięśniowych można stwierdzić, że stres ER, oprócz indukowania UPR jako mechanizmu obronnego, może też prowadzić do zaburzeń szeregu procesów wewnątrzkomórkowych i przez to odgrywać istotną rolę w patogenezie WZM (Ryc. 2). Zrozumienie konsekwencji stresu ER we włóknach mięśniowych może przyczynić się do opracowania nowych strategii terapeutycznych w leczeniu wtrętowego zapalenia mięśni. Ryc. 2 Proponowane skutki stresu ER w patogenezie wtrętowego zapalenia mięśni Piśmiennictwo: Askanas, V., Engel, W. K., 2006. Inclusion-body myositis: a myodegenerative conformational disorder associated with Abeta, protein misfolding, and proteasome inhibition. Neurology. 66, S39-48. Askanas, V., Engel, W. K., 2007. Inclusion-body myositis, a multifactorial muscle disease associated with aging: current concepts of pathogenesis. Curr Opin Rheumatol. 19, 550-9. Askanas, V., Engel, W. K., 2011. Sporadic inclusion-body myositis: Conformational multifactorial ageing-related degenerative muscle disease associated with proteasomal and lysosomal inhibition, endoplasmic reticulum stress, and accumulation of amyloid-beta42 oligomers and phosphorylated tau. Presse Med. 40, e219-35. Askanas, V., et al., Pathogenesis of sporadic inclusion-body myositis; role of ageing and muscle-fibre degeneration, and accumulation of the same proteins as in Alzheimer and Parkinson brains. In: V. Askanas, W. K. Engel, (Eds.), Muscle Ageing, Inclusion-Body Myositis and Myopathies Wiley-Blackwell, Oxford, UK, 2012a, pp. 111-145. Askanas, V., et al., 2012b. Pathogenic considerations in sporadic inclusion-body myositis, a degenerative muscle disease associated with aging and abnormalities of myoproteostasis. J Neuropathol Exp Neurol. 71, 680-93. Back, S. H., et al., 2005. ER stress signaling by regulated splicing: IRE1/HAC1/XBP1. Methods. 35, 395-416. Bjorkoy, G., et al., 2005. p62/sqstm1 forms protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect on huntingtin-induced cell death. J Cell Biol. 171, 603-14. Carpenter, S., et al., 1978. Inclusion body myositis: a distinct variety of idiopathic inflammatory myopathy. Neurology. 28, 8-17. Chan, S. L., et al., 2004. Herp stabilizes neuronal Ca2+ homeostasis and mitochondrial function during endoplasmic reticulum stress. J Biol Chem. 279, 28733-43. Cucciolla, V., et al., 2007. Resveratrol: from basic science to the clinic. Cell Cycle. 6, 2495-510. Dalakas, M. C., 2008. Interplay between inflammation and degeneration: using inclusion body myositis to study "neuroinflammation". Ann Neurol. 64, 1-3. Dalakas, M. C., 2011. Review: An update on inflammatory and autoimmune myopathies. Neuropathol Appl Neurobiol. 37, 226-42. Dalakas, M. C., Inflammatory and autoimmune features of inclusion-body myositis. In: V. Askanas, W. K. Engel, (Eds.), Muscle aging, inclusion-body myositis and myopathies. Wiley-Blackwell, Oxford, UK, 2012, pp. 146-158. Dimachkie, M. M., Barohn, R. J., 2013. Inclusion body myositis. Curr Neurol Neurosci Rep. 13, 321. 12

Engel, W. K., Askanas, V., 2006. Inclusion-body myositis: clinical, diagnostic, and pathologic aspects. Neurology. 66, S20-9. Faghihi, M. A., et al., 2008. Expression of a noncoding RNA is elevated in Alzheimer's disease and drives rapid feed-forward regulation of beta-secretase. Nat Med. 14, 723-30. Gonzalez-Cadavid, N. F., Bhasin, S., 2004. Role of myostatin in metabolism. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 7, 451-7. Haigis, M. C., Guarente, L. P., 2006. Mammalian sirtuins--emerging roles in physiology, aging, and calorie restriction. Genes Dev. 20, 2913-21. Hori, O., et al., 2004. Role of Herp in the endoplasmic reticulum stress response. Genes Cells. 9, 457-69. Iqbal, K., et al., 2010. Alzheimer's disease neurofibrillary degeneration: pivotal and multifactorial. Biochem Soc Trans. 38, 962-6. Joulia-Ekaza, D., Cabello, G., 2006. Myostatin regulation of muscle development: Molecular basis, natural mutations, physiopathological aspects. Exp Cell Res. 312, 2401-2414. Klionsky, D. J., et al., 2012. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy. Autophagy. 8, 445-544. Kokame, K., et al., 2000. Herp, a new ubiquitin-like membrane protein induced by endoplasmic reticulum stress. J Biol Chem. 275, 32846-53. Komatsu, M., et al., 2007. Homeostatic levels of p62 control cytoplasmic inclusion body formation in autophagy-deficient mice. Cell. 131, 1149-63. Kumamoto, T., et al., 2004. Expression of lysosome-related proteins and genes in the skeletal muscles of inclusion body myositis. Acta Neuropathol. 107, 59-65. LaFerla, F. M., 2010. Pathways linking Abeta and tau pathologies. Biochem Soc Trans. 38, 993-5. Lee, A. S., 2005. The ER chaperone and signaling regulator GRP78/BiP as a monitor of endoplasmic reticulum stress. Methods. 35, 373-81. Lloyd, T. E., 2010. Novel therapeutic approaches for inclusion body myositis. Curr Opin Rheumatol. 22, 658-64. Martinez-Vicente, M., Cuervo, A. M., 2007. Autophagy and neurodegeneration: when the cleaning crew goes on strike. Lancet Neurol. 6, 352-61. Meng, L., et al., 1999. Epoxomicin, a potent and selective proteasome inhibitor, exhibits in vivo antiinflammatory activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 10403-8. Michan, S., Sinclair, D., 2007. Sirtuins in mammals: insights into their biological function. Biochem J. 404, 1-13. Mori, K., 2000. Tripartite management of unfolded proteins in the endoplasmic reticulum. Cell. 101, 451-4. Nixon, R. A., 2007. Autophagy, amyloidogenesis and Alzheimer disease. J Cell Sci. 120, 4081-91. Qin, W., et al., 2006. Neuronal SIRT1 activation as a novel mechanism underlying the prevention of Alzheimer disease amyloid neuropathology by calorie restriction. J Biol Chem. 281, 21745-54. Ramachandran, N., et al., 2013. VMA21 deficiency prevents vacuolar ATPase assembly and causes autophagic vacuolar myopathy. Acta Neuropathol. 125, 439-57. Roussel, B. D., et al., 2013. Endoplasmic reticulum dysfunction in neurological disease. Lancet Neurol. 12, 105-18. Selkoe, D. J., 2011. Resolving controversies on the path to Alzheimer's therapeutics. Nat Med. 17, 1060-5. Shacka, J. J., et al., 2006. Bafilomycin A1 inhibits chloroquine-induced death of cerebellar granule neurons. Mol Pharmacol. 69, 1125-36. Shacka, J. J., et al., 2008. The autophagy-lysosomal degradation pathway: role in neurodegenerative disease and therapy. Front Biosci. 13, 718-36. Stockley, J. H., O'Neill, C., 2008. Understanding BACE1: essential protease for amyloid-beta production in Alzheimer's disease. Cell Mol Life Sci. 65, 3265-89. Tsuruta, Y., et al., 2001. Expression of the lysosome-associated membrane proteins in myopathies with rimmed vacuoles. Acta Neuropathol. 101, 579-84. Vaquero, A., et al., 2007. NAD+-dependent deacetylation of H4 lysine 16 by class III HDACs. Oncogene. 26, 5505-20. Vattemi, G., et al., 2001. Presence of BACE1 and BACE2 in muscle fibres of patients with sporadic inclusion-body myositis. Lancet. 358, 1962-4. Vattemi, G., et al., 2003. BACE1 and BACE2 in pathologic and normal human muscle. Exp Neurol. 179, 150-8. Vaziri, H., et al., 2001. hsir2(sirt1) functions as an NAD-dependent p53 deacetylase. Cell. 107, 149-59. Walter, P., Ron, D., 2011. The unfolded protein response: from stress pathway to homeostatic regulation. Science. 334, 1081-6. Weihl, C. C., Pestronk, A., 2010. Sporadic inclusion body myositis: possible pathogenesis inferred from biomarkers. Curr Opin Neurol. 23, 482-8. Wojcik, S., et al., 2005. Myostatin is increased and complexes with amyloid-beta within sporadic inclusion-body myositis muscle fibers. Acta Neuropathol. 110, 173-7. Wojcik, S., et al., 2007. NOGO is increased and binds to BACE1 in sporadic inclusion-body myositis and in A beta PPoverexpressing cultured human muscle fibers. Acta Neuropathol. 114, 517-26. Yamamoto, K., et al., 2004. Differential contributions of ATF6 and XBP1 to the activation of endoplasmic reticulum stressresponsive cis-acting elements ERSE, UPRE and ERSE-II. J Biochem 136, 343-50. Yeung, F., et al., 2004. Modulation of NF-kappaB-dependent transcription and cell survival by the SIRT1 deacetylase. EMBO J. 23, 2369-80. Zhang, K., Kaufman, R. J., 2008. From endoplasmic-reticulum stress to the inflammatory response. Nature. 454, 455-62 13

2. OMÓWIENIE POZOSTAŁYCH OSIĄGNIĘĆ NAUKOWO-BADAWCZYCH 1. Nogalska A, D Agostino C, Engel WK, Askanas V. Sodium phenylbutyrate reverses lysosomal dysfunction and decreases amyloid-β42 in an in vitro-model of inclusion-body myositis. Neurobiol Dis. 65:93-101, 2014. 2. Cacciottolo M, Nogalska A, D Agostino C, Engel WK, Askanas V. Dysferlin is a newly identified binding partner of AβPP and it co-aggregates with amyloid-β42 within sporadic inclusion-body myositis (s-ibm) muscle fibers. Acta Neuropathol. 126(5):781-3, 2013. 3. Cacciottolo M, Nogalska A, D'Agostino C, Engel WK, Askanas V. Chaperone-mediated autophagy components are upregulated in sporadic inclusion-body myositis muscle fibres. Neuropathol Appl Neurobiol. 39:750-761, 2013. 4. Klingstedt T, Blechschmidt C*, Nogalska A*, Prokop S, Hggqvist B, Danielsson O, Engel WK, Askanas V, Heppner FL, Nilsson KPR. Luminescent Conjugated Oligothiophenes for Sensitive Fluorescent Assignment of Protein Inclusion Bodies. ChemBioChem 14(5):607-16, 2013 *równorzędne autorki 5. Klionsky DJ, Nogalska A, et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy. Autophagy 8(4):445-544, 2012. 6. Nogalska A, D'Agostino C, Engel WK, Askanas V. Activation of the γ-secretase complex and presence of γ-secretase-activating protein may contribute to Aβ42 production in sporadic inclusion-body myositis muscle fibers. Neurobiol Dis. 48(1):141-9, 2012. 7. Askanas V, Engel WK, Nogalska A. Pathogenic considerations in sporadic inclusion-body myositis, a degenerative muscle disease associated with aging and abnormalities of myoproteostasis. J Neuropathol. Exp. Neurol. 71(8):680-93, 2012. 8. D'Agostino C, Nogalska A, Cacciottolo M, Engel WK, Askanas V. Abnormalities of NBR1, a novel autophagy-associated protein, in muscle fibers of sporadic inclusion-body myositis. Acta Neuropathol. 122(5):627-36, 2011. 9. Nogalska A, D'Agostino C, Engel WK, Askanas V. Novel demonstration of conformationally modified tau in sporadic inclusion-body myositis muscle fibers. Neurosci Lett. 503(3):229-33, 2011. 10. D'Agostino C, Nogalska A, Engel WK, Askanas V. In sporadic inclusion body myositis muscle fibres TDP-43-positive inclusions are less frequent and robust than p62 inclusions, 14

and are not associated with paired helical filaments. Neuropathol Appl Neurobiol. 37(3):315-320, 2011. 11. Nogalska A, D'Agostino C, Engel WK, Klein WL, Askanas V. Novel demonstration of amyloid-β oligomers in sporadic inclusion-body myositis muscle fibers. Acta Neuropathol. 120(5):661-666, 2010. 12. Terracciano C, Nogalska A, Engel WK, Askanas V. In AbetaPP-overexpressing cultured human muscle fibers proteasome inhibition enhances phosphorylation of AbetaPP751 and GSK3beta activation: effects mitigated by lithium and apparently relevant to sporadic inclusion-body myositis. J Neurochem. 112(2):389-396, 2010. 13. Nogalska A, Terracciano C, D Agostino C, Engel WK, Askanas V. p62/sqstm1 is increased and prominently accumulated in inclusions of sporadic inclusion-body myositis muscle fibers, and can help differentiating it from.polymyositis and dermatomyositis. Acta Neuropathol 118(3):403-413, 2009 14. Vattemi G, Nogalska A, Engel WK, D Agostino C, Checler F, Askanas V. Amyloid-β42 is preferentially accumulated in muscle biopsies of patients with sporadic inclusion-body myositis. Acta Neuropathol 117(5):569-74, 2009. 15. Nogalska A, Stelmanska E, Sledzinski T, Swierczynski J. Surgical removal of perirenal and epididymal adipose tissue decreases serum leptin concentration and increases lipogenic enzymes activities in remnant adipose tissue of old rats. Gerontology 55:224-228, 2009. 16. Terracciano C, Nogalska A, Engel WK, Wojcik S, Askanas V. In inclusion-body myositis muscle fibers Parkinson-associated DJ-1 is increased and oxidized. Free Radical. Biol. Med, 45:773-779, 2008. 17. Wojcik S, Nogalska A, Engel WK, Askanas V. Myostatin and its precursor protein are increased in the skeletal muscle of patients with Type-II muscle fiber atrophy. Folia Morphol, 67:8-14, 2008. 18. Szolkiewicz M, Chmielewski M, Nogalska A, Stelmanska E, Swierczynski J, Rutkowski B. The potential role of sterol regulatory element binding protein transcription factors in renal injury: J Ren Nutr, 17:62-5, 2007. 19. Wojcik S, Nogalska A, McFerrin J, Engel WK, Oledzka G, Askanas V. Myostatin precursor protein is increased and associates with amyloid-b precursor protein in inclusionbody myositis culture model. Neuropathol Appl Neurobiol, 33:238-42, 2007. 15

20. Sledzinski T, Nogalska A, Hebanowska A, Klimek J, Swierczynski J. Gender- and agerelated changes in 6-phosphogluconate dehydrogenase gene expression in white adipose tissue of rats (Rattus norvegicus) are not related to serum testosterone concentration. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol, 144:70-6, 2006. 21. Nogalska A, Sucajtys-Szulc E, Swierczynski J. Leptin decreases lipogenic enzyme gene expression through modification of SREBP-1c gene expression in white adipose tissue of aging rats. Metabolism, 54:1041-7, 2005. 22. Korczynska J, Stelmanska E, Nogalska A, Szolkiewicz M, Goyke E, Swierczynski J, Rutkowski B. Upregulation of lipogenic enzymes genes expression in white adipose tissue of rats with chronic renal failure is associated with higher level of sterol regulatory element binding protein-1. Metabolism, 53:1060-5, 2004. 23. Nogalska A, Swierczynski J. Potential role of high serum leptin concentration in agerelated decrease of fatty acid synthase gene expression in rat white adipose tissue. Exp Gerontol, 39:147-50, 2004. 24. Pankiewicz A, Sledzinski T, Nogalska A, Swierczynski J. Tissue specific, sex and agerelated differences in the 6-phosphogluconate dehydrogenase gene expression. Int J Biochem Cell Biol. 35:235-45, 2003. 25. Nogalska A, Pankiewicz A, Goyke E, Swierczynski J. The age-related inverse relationship between ob and lipogenic enzymes genes expression in rat white adipose tissue. Exp Gerontol. 38:415-22, 2003. 26. Nogalska A, Swierczynski J. The age-related differences in obese and fatty acid synthase gene expression in white adipose tissue of rat. Biochim Biophys Acta. 1533:73-80, 2001. Powyższe moje prace, nie wchodzące w skład osiągnięcia naukowego z pkt 1, można podzielić na następujące grupy tematyczne: a) Rola autofagii w patogenezie wtrętowego zapalenia mięśni b) Diagnostyczne markery wtrętowego zapalenia mięśni c) Zaburzenia metabolizmu białka prekursora β-amyloidu/ β-amyloidu we wtrętowym zapaleniu mięśni i ich konsekwencje d) Rola miostatyny w atrofii włókien mięśniowych e) Zmiany ekspresji genów kodujących leptynę i enzymy lipogenne w tkankach szczurów. 16

Rola autofagii w patogenezie wtrętowego zapalenia mięśni Moje badania ostatnich kilku lat skierowane są na poznanie roli zaburzeń autofagii w patogenezie WZM. Przemyślenia i rozważania dotyczące zaburzeń mioproteostazy we wtrętowym zapaleniu mięśni w oparciu o uzyskane w naszym laboratorium wyniki oraz o eksperymentalne modele WZM, a także proponowane strategie terapeutyczne opisane zostały w pracy poglądowej, której jestem współautorem. Ponadto, brałam udział w badaniach mających na celu scharakteryzowanie we wtrętowym zapaleniu mięśni zaburzeń drugiego, obok p62, receptora wiążącego białka przeznaczone do degradacji - zwanego NBR1 (ang. neighbour of the BRCA1 gene) (Johansen and Lamark, 2011; Lamark et al., 2009). Podobnie jak p62 białko to ma zdolność wiązania LC3-II i pełni rolę transportera ubikwitynowanych białek do proteasomów lub autofagosomów (Kirkin et al., 2009). Wykazaliśmy zwiększoną ekspresję NBR1 oraz jego obecność w cytoplazmatycznych złogach zawierających również białka p62 i LC3. W przeciwieństwie do p62, białko NBR1 wiązało LC3, zaproponowaliśmy więc, że NBR1 może ulegać nadekspresji we wtrętowym zapaleniu mięśni, żeby zrekompensować brak wiązania pomiędzy białkami LC3 i p62. Uczestniczyłam też czynnie w projekcie dotyczącym funcjonowania autofagii zależnej od czaperonów (CMA, ang. chaperone-mediated autophagy) we wtrętowym zapaleniu mięśni. CMA to mechanizm dostarczania białek przeznaczonych do degradacji, a zawierających w swoim łańcuchu pięcioaminokwasowy motyw KFERQ, do lizosomów za pomocą białek LAMP2a i Hsc70 (Cuervo, 2010; Dice, 1990; Kaushik and Cuervo, 2012). Jako pierwsi opisaliśmy zwiększenie LAMP2a i Hsc70 we włóknach mięśniowych w biopsjach pacjentów z WZM. Ponadto wykazaliśmy wzajemne wiązanie tych białek do siebie oraz do α-synukleiny, najlepiej poznanego substratu CMA (Kaushik and Cuervo, 2012; Li et al., 2011). Wyniki nasze wskazują na próbę aktywacji autofagii zależnej od czaperonów, aby najprawdopodobniej usprawnić usuwanie między innymi nieprawidłowo zwiniętych białek z cytozolu. Jednakże w świetle naszych wcześniej uzyskanych wyników opisujących obniżenie aktywności lizosomów we WZM wydaje się, że proces ten nie jest skuteczny. (prace 2.3, 2.7, 2.8) Moja najnowsza praca z tego cyklu tematycznego opisuje bardzo ważne z punktu widzenia terapeutycznego wyniki. Pokazaliśmy w niej wpływ 4-fenylomaślanu sodu (NaPB), który ma właściwości chemicznych czaperonów (Cuadrado-Tejedor et al., 2011; Iannitti and Palmieri, 2011, Papp and Csermely, 2006), na hodowle ludzkich włókien mięśniowych z 17

farmakologicznie wywołanym obniżeniem aktywności lizosomów. NaPB odwracał wszystkie szkodliwe efekty zahamowania aktywności lizosomów: obniżał poziom białek LC3-II, p62 i NBR1, zmniejszał ilość autofagosomów i wakuoli. Ponadto w hodowlach traktowanych NaPB aktywność γ-sekretazy, enzymu odpowiedzialnego za produkcję β-amyloidu (De Strooper, 2010), była obniżona, co korelowało z mniejszą ilością β-amyloidu 42 oraz jego oligomerów w tych hodowlach. Nasze wyniki wskazują, że NaPB może znaleźć zastosowanie w leczeniu pacjentów z wtrętowym zapaleniem mięśni. (praca 2.1) Ze względu na posiadane doświadczenie w temacie autofagii zostałam zaproszona wraz z innymi ekspertami w tej dziedzinie do współautorstwa pracy zawierającej szczegółowe wytyczne dotyczące eksperymentalnego studiowania mechanizmów autofagii. (praca 2.5) Diagnostyczne markery wtrętowego zapalenia mięśni Bardzo ważnym naszym odkryciem, zyskującym coraz większe uznanie w diagnostyce wtrętowego zapalenia mięśni, okazało się wykazanie obecności p62, białka uczestniczącego w kierowaniu przeznaczonych do degradacji białek do proteasomów lub autofagosomów (Bjorkoy et al., 2005; Seibenhener et al., 2004), w złogach zawierających fosforylowane białko tau. Proste immnohistochemiczne barwienie umożliwia specyficzną detekcję p62- pozytywnych inkluzji w biopsjach pacjentów z wtrętowym zapaleniem mięśni i ułatwia postawienie diagnozy poprzez odróżniennie WZM od innych miopatii zapalnych: zapalenia wielomięśniowego i zapalenia skórno-mięśniowego. Użyteczność i wyższość p62 jako biomarkera wtrętowego zapalenia mięśni potwierdziliśmy w kolejnej pracy, porównując ilość wykrywanych na danym przekroju biopsji mięśniowej p62-pozytywnych wtrętów z częstotliwością wykrywania wtrętów zawierających białko TDP-43, inny proponowany marker WZM. We współpracy z Uniwersytetem w Linkoping ze Szwecji przebadaliśmy też użyteczność nowych związków tzw. luminescencyjnych sprzężonych oligotiofenów (LCOs, ang. luminescent conjugated oligothiophenes) (Klingstedt and Nilsson, 2011) do wykrywania białkowych złogów we wtrętowym zapaleniu mięśni. Wykazaliśmy, że pftaa, pentameryczny LCO, rozpoznawał agregaty białkowe zawierające białko p62, a ponadto z dużą czułością uwidaczniał nawet drobne złogi białkowe, niemożliwe do wykrycia tradycyjnymi metodami np. barwieniem czerwienią Kongo. (prace 2.4, 2.10, 2.13) 18

Zaburzenia metabolizmu białka prekursora β-amyloidu/ β-amyloidu we wtrętowym zapaleniu mięśni i ich konsekwencje Pomimo, iż przyczyna wtrętowego zapalenia mięśni nie jest jednoznacznie ustalona, wyniki badań z zastosowaniem myszy transgenicznych oraz hodowli ludzkich włókien mięśniowych z wywołanymi WZM-podobnymi zmianami wskazują, że gromadzenie się wewnątrz włókien mięśniowych złogów zbudowanych z białka prekursora β-amyloidu (AβPP) oraz powstającego w wyniku jego proteolizy β-amyloidu (Aβ) odgrywa bardzo ważną rolę w patogenezie WZM (Askanas et al., 1997; Askanas et al., 1996; Fukuchi et al., 1998; Jin et al., 1998; Kitazawa et al., 2006; Kitazawa et al., 2008; Terracciano et al., 2010). W wyniku proteolitycznego cięcia AβPP przez β- i γ- sekretazy powstają różnej długości cząsteczki Aβ różniące się właściwościami (De Strooper, 2010). Aβ42 zbudowany z 42 aminokwasów, jest najbardziej toksyczny, łatwo też oligomeryzuje i tworzy włókna (De Strooper, 2010). Uważa się, że niskocząsteczkowe oligomery i protofibryle Aβ są najbardziej toksyczne (De Strooper, 2010; El-Agnaf et al., 2000; LaFerla et al., 2007). Badania, w których brałam udział wykazały, że dominującą we WZM formą β-amyloidu jest Aβ42, oraz że wykrywane Aβ42-pozytywne złogi mają charakter amyloidu. Kontynuując te badania jako pierwsi wykazaliśmy obecność niskocząsteczkowych oligomerów Aβ (dimerów, trimerów oraz tetramerów) w biopsjach pacjentów z WZM. Mają one właściwości ligandów będących pochodnymi Aβ (ang. ADDLs, Aβ-derived diffusible ligands)(klein et al., 2004; Lambert et al., 1998). Ostatnio pokazaliśmy, że dysferlina, białko zlokalizowane w plazmalemmie włókien mięśniowych (Barthélémy et al., 2011), we wtrętowym zapaleniu mięśni zamiast w błonie zlokalizowana jest w cytoplazmatycznych złogach zawierających Aβ42 i fizycznie oddziaływuje z AβPP. Zbadaliśmy też ekspresję i aktywność γ-sekretazy we WZM i wykazaliśmy, że poszczególne białka kompleksu γ-sekretazy (presenilina-1, nikastryna oraz białko PEN-2) są nadprodukowane we WZM, jak również aktywność enzymatyczna kompleksu jest podwyższona w porównaniu do kontroli. Odkryliśmy też, że białko GSAP (ang. γ-secretase activating protein), które jak wykazano selektywnie zwiększa produkcję Aβ oddziaływując na AβPP i kompleks γ-sekretazy (He et al., 2010), jest podwyższone we WZM. Wyniki badań, w których brałam udział świadczą też o obecności foforylowanego AβPP we włóknach pacjentów z wtrętowym zapaleniem mięśni. Sugerowano, że fosforylacja AβPP zwiększa jego proteolizę przez β- i γ- sekretazy (Lee et al., 2003; Vingtdeux et al., 2005). Przedstawiliśmy również, że 19

kinaza syntazy glikogenowej-3β (GSK-3β), odgrywająca rolę w fosforylowaniu białka tau oraz AβPP (Anderton et al., 2001; Aplin et al., 1996), jest aktywowana we WZM. Dodatkowo w opisywanych pracach wykazaliśmy na modelach WZM otrzymanych poprzez traktowanie hodowli ludzkich włókien mięśniowych inhibitorami aktywności lizosomów lub proteasomów, że upośledzenie autofagii prowadzi do wzrostu ilości oligomerów Aβ. Ponadto, w modelu tym dominującą formą był Aβ42. Także ilość fosforylowanego AβPP była podwyższona w tych hodowlach i zaobserwowaliśmy w nich jednocześnie podwyższenie aktywności γ-sekretazy. Wyniki uzyskane na hodowlach ludzkich włókien mięśniowych z indukowaną nadprodukcją AβPP i jednocześnie z zahamowaną aktywnością proteasomów pokazały wzrost fosforylowanego AβPP oraz aktywację GSK-3β. Jednocześnie podanie chlorku litu hamowało aktywność GSK-3β i w rezultacie obniżało ilość fosforylowanego AβPP, całkowitego AβPP oraz oligomerów Aβ. Wyniki te stanowią dodatkowe dowody na ważną rolę AβPP i Aβoligomerów w patogenezie wtrętowego zapalenia mięśni. (prace 2.2, 2.6, 2.11, 2.12, 2.14) W patogenezie choroby Alzheimera uważa się, że gromadzenie Aβ poprzedza i wywołuje patologiczne zmiany białka tau (Selkoe et al., 2012). Przypuszcza się, że podobny mechanizm zachodzi także we wtrętowym zapaleniu mięśni, gdzie obecność helikalnych podwójnych filamentów zbudowanych z ufosforylowanego białka tau jest dobrze udokumentowana (Askanas et al., 1994; Mirabella et al., 1996). Niedawno w biopsjach pacjentów z wtrętowym zapaleniem mięśni wykazaliśmy konformacyjne zmiany białka tau obejmujące zmiany strukturalne wewnątrz łańcucha polipeptydowego, ułatwiające formowanie tau w helikalne podwójne filamenty. (praca 2.9) Wspólną cechą wielu chorób neurodegeneracyjnych, w tym choroby Alzheimera i Parkinsona, są stres oksydacyjny i zaburzenia struktury i funkcjonowania mitochondriów (Selfridge et al., 2013). Podobne zaburzenia opisano również we wtrętowym zapaleniu mięśni. Brałam udział w badaniach nad białkiem DJ-1, które w warunkach stresu oksydacyjnego pełni ważną rolę przeciwutleniacza (Canet-Aviles et al., 2004; Taira et al., 2004). Opisaliśmy, że we włóknach mięśniowych pacjentów z WZM ekspresja DJ-1 jest zwiększona oraz, że białko to występuje w mitochondriach. Ponadto wykazaliśmy, że we WZM białko DJ-1 jest karbonylowane, co świadczyć może o jego uszkodzeniu oksydacyjnym. Zaproponowaliśmy, że DJ-1 pełni funkcję ochronną przed skutkami stresu oksydacyjnego we WZM. (praca 2.16) 20