Tytuł rozprawy na stopień doktora nauk medycznych:

Wielkość: px

Rozpocząć pokaz od strony:

Download "Tytuł rozprawy na stopień doktora nauk medycznych:"

Adam Walczak
7 lat temu
Przeglądów:

1 Instytut Pomnik Centrum Zdrowia Dziecka Zakład Patologii Pracownia Medycyny Mitochondrialnej Al. Dzieci Polskich Warszawa Tytuł rozprawy na stopień doktora nauk medycznych: Ocena parametrów stresu oksydacyjnego w fibroblastach pacjentów z deficytami mitochondrialnego łańcucha oddechowego.( Evaluation of the oxidative stress parameters in the fibroblasts of patients harboring defects in the mitochondrial respiratory chain ). Promotor: dr hab. n. med. Maciej Pronicki Zakład Patologii Instytut Pomnik Centrum Zdrowia Dziecka Przewód doktorski przeprowadzany w Centrum Biostruktury Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego, ul. Chałubińskiego 5, Warszawa.

2 Ocena parametrów stresu oksydacyjnego w fibroblastach pacjentów z deficytami mitochondrialnego łańcucha oddechowego. STRESZCZENIE W niniejszej pracy dokonano kompleksowych badań funkcjonowania mitochondrialnego łańcucha oddechowego i związanych z nim innych parametrów, które mogą być odpowiedzialne lub zaangażowane w nieprawidłowe funkcjonowanie komórki z defektem mitochondrialnym. Największą uwagę poświęcono parametrom bioenergetycznym i określeniu produkcji reaktywnych form tlenu w liniach fibroblastów uzyskanych od pacjentów ze zdefiniowanymi defektami mitochondrialnymi, oraz ocenie stanu enzymatycznej obrony antyoksydacyjnej w tych komórkach. W pracy wykorzystano 22 linie fibroblastów z określonymi mutacjami w mtdna i ndna będącymi przyczyną dysfunkcji mitochondriów. Z wykorzystaniem odpowiednich sond fluorescencyjnych w badanych komórkach przeprowadzono pomiar potencjału mitochondrialnego i aktywności mitochondrialnego łańcucha oddechowego, jak również zbadano poziom takich reaktywnych form tlenu jak nadtlenek wodoru i anionorodnik ponadtlenkowy powstający w cytozolu oraz macierzy mitochondrialnej. Określono także poziom podstawowych enzymów antyoksydacyjnych: dysmutaz ponadtlenkowych, katalazy, reduktazy i peroksydazy glutationowej. Na podstawie otrzymanych wyników stwierdzono, że w każdej z badanych grup fibroblastów występują odchylenia od wartości kontrolnych w zakresie poszczególnych parametrów, przy czym amplituda, kierunek zmian oraz rodzaj parametru, który uległ zmianie dla każdej z grup jest bardzo charakterystyczny. Poziom potencjału mitochondrialnego jest obniżony w większości badanych komórek (największe obniżenie potencjału stwierdzono w przypadku zaburzeń środowiska lipidowego błon mitochondrialnych), z wyjątkiem komórek z mutacjami w genie MTATP6, w których zaobserwowano niewielką hiperpolaryzację mitochondriów, oraz w liniach z mutacjami w genach SURF1 i SCO2, w których parametr ten jest zbliżony do wartości kontrolnych. Aktywność oddechowa mitochondriów jest podwyższona w fibroblastach z mutacjami w

3 genie SCO2 i genach MTND, natomiast obniżona w przypadku pozostałych linii z mutacjami w mtdna, oraz genach TAZ i SERAC1. Największy wzrost produkcji badanych RFT oznaczono w przypadku komórek z mutacjami w genach mtdna kodujących podjednostki kompleksu I mitochondrialnego łańcucha oddechowego, oraz w komórkach z mutacjami w genach SCO2 i SURF1. We wszystkich badanych liniach komórkowych z defektami mitochondrialnymi poziom enzymów antyoksydacyjnych jest różny od poziomu określonego dla linii kontrolnych. Szczególnie wyraźny wzrost poziomu dysmutazy Cu/ZnSOD zaobserwowano w komórkach z mutacjami w genach MTND i MTATP6, oraz genie SCO2, natomiast poziom MnSOD jest znacząco wysoki w liniach z mutacjami w genie SURF1 i w komórkach z mutacją w G3316GA w genie MTND1. Z wyjątkiem linii fibroblastów z mutacjami w genie TAZ i trna Leu poziom katalazy jest obniżony we wszystkich badanych komórkach. Największe zmiany w poziomie peroksydazy glutationowej stwierdzono w komórkach z mutacjami w genach białek składania oksydazy cytochromu c, oraz z mutacjami w genie podjednostki a syntazy ATP. Stwierdzono także, że różne mutacje w tym samym genie związane są z innym patomechanizmem dysfunkcji komórki, szczególnie widoczne było to w przypadku komórek z różnymi mutacjami w genie MTATP6 i genach składania kompleksu IV mitochondrialnego łańcucha oddechowego. Parametrem, którego poziom w zdecydowanej większości (poza z mutacją w genie trna Leu ) był zaburzony (znacząco podniesiony) była produkcja anionorodnika ponadtlenkowego w macierzy mitochondrialnej, co bezsprzecznie wskazuje na obecność stresu oksydacyjnego w badanych komórkach ze zdefiniowanymi defektami mitochondrialnymi. Szczegółowa analiza statystyczna wykazała, że każda z badanych grup komórek ze zdefiniowanym defektem mitochondrialnym charakteryzuje się określonym/unikalnym profilem parametrów bioenergetycznych i produkcji RFT, oraz enzymów antyoksydacyjnych.

4 Evaluation of the oxidative stress parameters in the fibroblasts of patients harboring defects in the mitochondrial respiratory chain SUMMARY The study covers the comprehensive examination of the mitochondrial respiratory chain parameters as well as other parameters that can be responsible or involved in malfunction of the cell harboring mitochondrial defect. The greatest attention was devoted to bioenergetic parameters and determining reactive oxygen species production in fibroblasts obtained from patients with defined mitochondrial defects, and for evaluation of the enzymatic antioxidant defense state in these cells. Twenty two lines of fibroblasts with defined pathogenic mutations in mtdna and ndna, leading to mitochondrial dysfunction, have been studied. With the use of suitable fluorescent dyes the measurements of the mitochondrial membrane potential as well as the ability of rezazurine reduction by the mitochondrial respiratory chain has been performed. Moreover, the level of reactive oxygen species as hydrogen peroxide and mitochondrial and cytosolic superoxide production has been studied in patient fibroblasts. The level of antioxidant enzymes like superoxide dismutases, catalase, and glutathione reductases and peroxidases has been determined. Based on the obtained results it has been found, that in all examined groups of fibroblasts deviations from the control values in the individual parameters are observed. In addition, the amplitude, direction of changes and the kind of the parameter which has been changed is characteristic for the individual fibroblast group. The level of mitochondrial membrane potential is decreased in the majority of studied cell lines (the highest decrease was observed in lipid membranes environment defect), except for cells with the MTATP6 gene mutations, where the slight hyperpolarization was observed. In fibroblasts with SURF1 and SCO2 genes mutations this parameter was similar to the control values. The rate of rezazurine reduction by the mitochondrial respiratory chain was increased in fibroblasts with mutations in the SCO2 and MTND genes. However, it has been lower in case of remaining cell lines with mutations in mtdna, TAZ and

5 SERAC1 genes. The greatest increase of examined ROS production was revealed in the fibroblasts with mutations in mtdna genes encoding subunits of the mitochondrial respiratory complex I and in the cells with mutations in SCO2 and SURF1 genes. In all examined cell lines harboring mitochondrial defects the pattern of antioxidant enzymes was different from control values. Particularly, a distinct increase in the level of Cu/ZnSOD dismutase has been observed in fibroblasts with mutations in MTND, MTATP6 and SCO2 gens. However the level of MnSOD is considerably high in cell lines with SURF1 gene mutations and in cells with G3316GA mutation in MTND1 gene. Except fibroblasts with mutations in the TAZ gene and trna Leu, the level of catalase is decreased in all examined cell lines. Most evident changes in the glutathione peroxidase has been found in cells with mutations in genes encoding proteins involved in the cytochrome c oxidase folding and with mutations in the gene of the ATP synthase subunit a. It has been also found, that different mutations in the same gene are associated with different cellular dysfunction pathomechanism. Particularly, this is visible in the case of fibroblasts with different mutations in the MTATP6 gene and genes involved in the complex IV of mitochondrial respiratory chain assembly. The mitochondrial superoxide production has been increased (considerably raised) in all cell lines (except fibroblasts harboring mutation in the trna Leu gene). This can indicate the presence of the oxidative stress in all examined cells harboring defined mitochondrial defects. Detailed multiparameter statistical analysis showed, that each examined group of cells with defined mitochondrial defects can be characterized by a particular/unique profile of bioenergetic parameters, ROS production, and antioxidant enzymes pattern. Detailed multiparameter statistical analysis showed, that each examined group of cells with defined mitochondrial defects can be characterized by a particular/unique profile of bioenergetic parameters, ROS production, and antioxidant enzymes pattern.

Podobne dokumenty

oraz stężenie ceruloplazminy (CER)), stresu oksydacyjnego ((stężenie dialdehydu malonowego (MDA), stężenie nadtlenków lipidowych (LPH) i całkowity

oraz stężenie ceruloplazminy (CER)), stresu oksydacyjnego ((stężenie dialdehydu malonowego (MDA), stężenie nadtlenków lipidowych (LPH) i całkowity STRESZCZENIE Pola elektromagnetyczne może prowadzić do powstania w organizmie żywym stresu oksydacyjnego, który powoduje wzrost stężenia reaktywnych form tlenu, zmianę aktywności układów antyoksydacyjnych,