RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 169178 (13) B1 (2 1) Numer zgłoszenia 289953 Urząd Patentowy (22) Data zgłoszenia 19.04.1991 Rzeczypospolitej Polskiej (51) IntCl6 C12N 15/62 C12N 15/17 C12P 21/00 C12R 1:465 (54) Sposób wytwarzania fuzji białkowych (30) Pierwszeństwo: 21.04.1990,DE,P 4012818.0 (73) Uprawniony z patentu: Hoechst Aktiengesellschaft, Frankfurt nad Menem, DE (43) Zgłoszenie ogłoszono: 04.11.1991 BUP 22/91 (72) Twórcy wynalazku: Klaus-Peter Koller, Bad Soden, DE Günther Rieb, Frankfurt nad Menem, DE (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 28.06.1996 WUP 06/96 (74) Pełnomocnik: Gugała Barbara, PATPOL Spółka z o. o. (57) Sposób wytwarzania fuzji białkowych, znamienny tym, ze gen strukturalny pożądanego białka sprzęga się z kodonami sekwencji sygnałowej i kodonami około dziesięciu pierwszych aminoterminalnych aminokwasów sekwencji łącznikowej, tę strukturę genu wprowadza się do wektora Streptomycetes, ten wektor-hybryd doprowadza się do ekspresji w komórce gospodarza Streptomycetes i wydzielaną fuzję białkową izoluje się z podłoża, przy czym sekwencje genów odcinka łącznikowego (Tendamistat) mogą być modyfikowane. PL 169178 B1
Sposób wytwarzania fuzji białkowych Zastrzeżenie patentowe Sposób wytwarzania fuzji białkowych, znamienny tym, że gen strukturalny pożądanego białka sprzęga się z kodonami sekwencji sygnałowej i kodonami około dziesięciu pierwszych aminoterminalnych aminokwasów sekwencji łącznikowej, tę strukturę genu wprowadza się do wektora Streptomycetes, ten wektor-hybryd doprowadza się do ekspresji w komórce gospodarza Streptomycetes i wydzielaną fuzję białkową izoluje się z podłoża, przy czym sekwencje genów odcinka łącznikowego (Tendamistat) mogą być modyfikowane. * * * Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania fuzji białkowych. Z europejskiego zgłoszenia patentowego opublikowanego pod numerem (EP-A) 0 289 936 wiadomo, że fuzje białkowe wytwarza się w ten sposób, że gen strukturalny pożądanego białka sprzęga się na końcu 3' kodującej nici ewentualnie zmodyfikowanego genu odcinka łącznikowego (Tendamistat-Gen), tę strukturę genową doprowadza się do ekspresji w Streptomycetes jako komórce gospodarza i wydzielaną fuzję białkową izoluje się z podłoża. Wyróżnia się sposób, w którym gen odcinka łącznikowego (Tendam istat-gen) zostaje skrócony na końcu 3'. Celem skrócenia ustala się miejsca cięcia dla enzymów restrykcyjnych w zakresie trypletu 31 i 32 dla BstEII, w zakresie trypletu 43 i 44 dla StuI oraz w zakresie trypletu 52 i 53 dla Sau3A. Rozwijając dalej koncepcję tego wynalazku zakłada się, aby wytwarzać fuzję białkową, w której po części łącznikowej (Tendamistat-Anteil) następuje skrócona proinsulina, której łańcuch C składa się tylko z jednej lub dwu reszt lizyny ( miniproinsulina ). Jako dalsze rozwinięcie założono, ze w tego rodzaju fuzjach białkowych również część łącznikowa (Tendamistat-Anteil) jest skrócona (zgłoszenie patentowe opublikowane 9.5.1990, EP-A 0 367 163). Obecnie stwierdzono nieoczekiwanie, że fuzje białkowe z bardzo krótką częścią łącznikową (Tendamistat-Anteil) w komórkach Streptomycetes są stabilne i są wyrzucane do podłoża. Tak otrzymane fuzje białkowe, z powodu bardzo krótkiego łańcucha łącznikowego (Tendamistat- Kette), zachowują się jak dojrzałe białka i występują w podłożu ogólnie biorąc we właściwej strukturze trzeciorzędowej. Sposób wytwarzania fuzji białkowych według wynalazku charakteryzuje się tym, że gen strukturalny pożądanego białka sprzęga się z kodonami sekwencji sygnałowej i kodonami około dziesięciu pierwszych aminoterminalnych aminokwasów sekwencji łącznikowej (Tendamistat), tę strukturę genu wprowadza się do wektora Streptomycetes, ten wektor-hybryd doprowadza się do ekspresji w komórce gospodarza Streptomycetes i wydzielaną fuzję białkową izoluje się z podłoża, przy czym sekwencje genów odcinka łącznikowego (Tendamistat) mogą być modyfikowane. Ze zgłoszenia patentowego EP-A 177 827 znana jest syntetytczna sekwencja sygnałowa dla transportu białek w układach ekspresji, która odznacza się, że DNA zasadniczo odpowiada naturalnej sekwencji sygnałowej, ale wykazuje jedno lub więcej miejsc cięcia dla endonukleaz, których nie zawiera naturalny DNA. Jeśli z taką sekwencją DNA sprzęgnie się gen białka, które ma podlegać transportowi, a następnie ten fuzyjny gen wbuduje się do wektora, którym transformuje się komórkę gospodarza i tak wytworzone białko transportuje z cytoplazmy można w komórkach prokariotycznych i eukariotycznych wytwarzać białka eukariotów, prokariotów i wirusów. Na przykładzie penplazmatycznej fosfatazy zasadowej wykazano, że przy ekspresji w E. coli jest korzystne na końcu presekwencji umieścić kodony dla około 40 pierwszych aminokwasów fosfatazy zasadowej, przed genem strukturalnym pożądanego białka. W wielu przypadkach wystarcza jednak mniejsza liczba dodatkowych aminokwasów, na przykład około 10, korzystnie około 5. Odpowiednia fuzja białkowa z proinsuliną małpią jest transportow ana do około 90% do przestrzeni periplazmatycznej.
169 178 3 Z aproponow ano ju z także (zgłoszenie patentow e US 07/399,874 z 29.8.1989; PCT/US 90/04840 z 28.8.1990) aby wytwarzać fuzje białkowe w ten sposób, ze konstruuje się mieszany oligonukłeotyd kodujący część balastową fuzji białkowej, ten oligonukleotyd wprowadza się do wektora tak, ze jest on funkcjonalnie sprzężony z regionem regulatorowym i genem strukturalnym pożądanego białka, przy pomocy tak otrzymanej populacji plazmidów transformuje się odpowiednie komórki gospodarza i selekcjonuje się ich klony o wysokiej wydajności kodowanej fuzji białkowej. Oligonukleotyd składa się przy tym przeważnie z 4 do 12 trypletów, w szczególności 4 do 8. Zbadano już także wytwarzanie fuzji białkowych z krótką częścią balastową. Na przykład wytworzono fuzję genową kodującą fuzję białkową z 10 pierwszych aminokwasów β -galaktozydazy i somatostatyny. Okazało się jednak, że ten krótki fragment β -galaktozydazy nie wystarczył aby ochronić fuzję białkową przed rozłożeniem przez proteazy gospodarza (zgłoszenie patentowe US-A 4 366 246, kolumna 15, akapit 2). W związku z tym w zgłoszeniu patentowym EP-A 0 290 005 i 0 292 763 opisano fuzje białkowe których część balastowa fragmentu β -galaktozydazy zawiera więcej niż 250 aminokwasów. Nieoczekiwanie jednak, obecnie stwierdzono, że fuzje białkowe z około 10 pierwszych aminoterminalnych aminokwasów sekwencji łącznikowej (Tendamistat) i pożądanego białka, na przykład proinsuliny, są w komórkach Streptomycetes jako gospodarzu stabilne i są wydzielane do podłoża z którego można je otrzymać z wysoką wydajnością. Niespodziewanie dotyczy to także względnie małych białek jak mini-proinsulina. Około 10 am inokwasów oznacza przy tym, że wchodzi w grę także mniejsza liczba am inokwasów, na przykład pierwszych 7 N-końcowych aminokwasów sekwencji łącznikowej (Tendamistat), ale w szczególności nie więcej niż 10. Szczególnie korzystne są fuzje białkowe, które w swojej części łącznikowej (Tendamistat-Anteil) mają w pozycji 7 i/lu b 9 prolinę (jak w sekwencji naturalnej). Oczywiście jest również możliwe, zgodnie z już znanymi lub proponowanymi sposobami wytwarzania, dobrać większą część balastową sekwencji łącznikowej (Tendamistat), przy czym naturalnie traci się korzyść wynikającą z niewielkiego balastu. Jest możliwe a nawet korzystne zmieniać naturalną kolejność aminokwasów w sekwencji łącznikowej (Tendamistat), także wymieniać i usuwać aminokwasy, albo wprowadzać aminokwasy nie występujące w naturalnej sekwencji. Jest dalej możliwe zmieniać sekwencję aminokwasów w peptydzie sygnałowym. Szczególnie pomyślne konstrukcje fuzji białkowych można, znając myśl wynalazku, łatwo ustalić w doświadczeniach wstępnych. M ożna również zrealizować ideę wynalazku w innych G ram-dodatnich kom órkach bakteryjnych, na przykład w komórkach Bacillus lub Staphylococcus, stosując sekwencje sygnałowe które są rozpoznawane przez tych gospodarzy. Fuzje białkowe otrzymano według wynalazku występują w podłożu w postaci rozpuszczonej, co daje szereg korzyści przy dalszej obróbce i oczyszczaniu. Tak na przykład dalsza obróbka enzymatyczna z odszczepieniem części balastowej może nastąpić bezpośrednio w stosunku od produktu wydzielania, bez konieczności obróbki wstępnej, jak to ma miejsce w przypadku fuzji białkowych nierozpuszczonych. Przed dalszą obróbką może więc nastąpić zatężenie lub oczyszczenie, na przykład przez chrom atografię powinowactwa ale także ultrafiltrację, wytrącanie, chrom a- tografię jonowymienną, chromatografię adsorpcyjną, sączenie molekularne lub wysokociśnieniową chromatografię cieczową. W niżej podanych przykładach wynalazek jest objaśniony bliżej. Materiałem wyjściowym do konstrukcji plazmidów jest plazmid pkk500, podany w opisie patentowym EP-A 0 367 163. Plazmid ten różni się od opisanego w zgłoszeniu patentowym EP- A 0 289 936 plazmidu pkk400 tym, ze gen proinsuliny jest zastąpiony przez gen analogiczny, który zamiast łańcucha C koduje tylko aminokwas lizynę oraz tym, ze sekwencja term inatora jest włączona na końcu tego genu mini-proinsuliny. Tabele I i II w zgłoszeniu patentowym EP- A 0 367 163, w których gen mini-proinsuliny względnie sekwencja term inatora są podane, są jako uzupełnienie załączone do opisu. Plazmidy pkk400 i pkk500 zawierają w sekwencji sygnałowej genu inhibitora α-amylazy miejsce cięcia XmaIII (w zakresie trypletów -5 do -7).
4 169 178 P r z y k ł a d I. Plazmid pk K 500 zostaje otwarty przy pomocy enzymów restrykcyjnych EcoRI i XmaIII i duży fragment oddziela się przez elektroforezę na 0,8% zelu agarozowym, poczem izoluje przez elektroelucję. Ten fragment poddaje się ligacji z fragmentem DNA zsyntetyzowanym metodą fosforaminową (1) (SEQ ID N O :1) i mieszaninę ligacyjną transformuje się w E. coli. -5-1 Ala Gly Pro Ala Ser Ala 5 G GCC GGG CCG GCC TCC GCC 3 CCC GGC CGG AGG CGG (XmaIII) Asp Thr Thr Val Ser Glu Pro GAC ACG ACC GTC TCC GAG CCG 3' CTG TGC TGG CAG AGG CTC GGC TTA A 5' (EcoRI) Otrzymuje się plazmid pkk 510. Koduje on pre-proinsulinę w której po sekwencji sygnałowej odcinka łącznikowego (Tendamistat) następują pierwsze 7 aminokwasów sekwencji łącznikowej (Tendamistat) i łańcuch mini-proinsuliny. P r z y k ł a d II. Analogicznie do opisanego w zgłoszeniu patentowym EP-A 0 289 963 sposobu przeprowadzenia plazmidu pkk400 w plazmid ekspresji pg F 1, plazmid pkk 5 10 przeprowadza się w plazmid ekspresji pk F1: DNA izolowany z plazmidu pkk 5 10 tnie się enzymami restrykcyjnymi SphI i SstI i izoluje się mały fragment z genem fuzji. Dostępny handlowo plazmid ekspresji pij 702 (do nabycia w John Innes Foundation, Norwich, Anglia) tnie się tymi samymi enzymami i izoluje duży fragment. Oba te izolowane fragmenty poddaje się ligacji, mieszaninę ligacyjną transformuje się w S. lividans TK24, i izoluje się plazmid z transform antów opornych na tiostrepton, białych (to znaczy niezdolnych do wytwarzania melaniny). Klony zawierające wprowadzoną insercję bada się w hodowlach wstrząsanych na wytwarzanie fuzji białkowej. Ekspresja kodowanej fuzji białkowej następuje w znany sposób: transformowany szczep inkubuje się w kolbach wstrząsanych przez 4 dni w temperaturze 25 C i grzybnię oddziela się od podłoża hodowlanego przez wirowanie; wytworzoną fuzję białkową w podłożu po elektroforezie 20 μl przesączu podłoża w 15% żelu poliakrylamidowym uwidacznia się przez wybarwienie błękitem rcoomassie jako dodatkowy prążek białkowy, który nie występuje w doświadczeniu kontrolnym, w którym szczep transformuje się tylko p IJ 702. Jeśli przesącz podłoża potraktować endoproteazą lizylową, można wykazać elektroforezę w zelu Des-(B30)-Thr-insulinę, która weryfikuje się w autentycznej kontroli. Następnie można w przesączu podłoża fuzję białkową wykazać przy pomocy przeciwciał przeciw insulinie albo w immunoblot albo w RIA. P r z y k ł a d III. Postępuje się jak w przykładzie I i II, ale syntetyczny fragment (2) umieszcza się z SEQ ID NO:2 i tak otrzymuje się plazmidy pkk320 względnie pkf2. -5-1 Ala Gly Pro Ala Ser Ala 5 ' G GCC GGG CCG GCC TCC GCC 3' CCC GGC CGG AGG CGG (XmaIII) Asp Thr Thr Val Ser Glu Pro Asp Pro GAC ACG ACC GTC TCC GAG CCC GAC CCG CTG TGC TGG CAG AGG CTC GGG CTG GGC TTA A 5' (EcoRI) 3 '
Plazmidy te kodują fuzję białkową, która różni się od tej z przykładu I i II tym, że po pierwszych 7 aminokwasach sekwencji łącznikowej (Tendamistat) następuje asparagina (w miejsce naturalnego aminokwasu alaniny) a po niej dziewiąty aminokwas w sekwencji łącznikowej (Tendamistat) - prolina. Przez wymianę alaniny na asparaginę, do części balastowej fuzji białkowej zostaje wprowadzony dodatkowy ładunek dodatni. Niespodziewanie otrzymuje się wydajność o około 20 do 30% wyższą niż w przykładzie II. P r z y k ła d IV. Postępuje się według przykładu I i II, ale syntetyczny fragment (3) umieszcza się z SEQ ID NO:3 i tak otrzymuje się plazmidy pkk330 względnie pkf3. -5-1 Ala Gly Pro Ala Ser Ala 5 G GCC GGG CCG GCC TCC GCC 3 CCC GGC CGG AGG CGG (XmaIII) 169 178 5 5 Asp Thr Thr Val Ser Glu Pro Ala Pro GAC ACG ACC GTC TCC GAG CCC GCA CCG 3 CTG TGC TGG CAG AGG CTC GGG CGT GGC TTA A 5 Plazmidy te różnią się od tych według przykładu I i II tym, że kodują pierwszych 9 naturalnych aminokwasów sekwencji łącznikowej (Tendamistat). W porównaniu z przykładem II otrzymuje się wydajność o około 10% wyższą. P r z y k ł a d V. Fuzja białkowa kodowana przez pkk500 zawiera między częścią łącznikową (Tendamistat-Anteil) i łańcuchem B proinsuliny sekwencję łączącą która koduje aminokwasy Asn-Ser-Asn-Gly-Lys. Zastąpienie tej stojącej na końcu Lys oraz Lys reprezentującej łańcuch C, przez Arg następuje jak opisano niżej. Posłużono się przy tym pojedynczym miejscem cięcia StyI w zakresie kodonów B30 do Al w sekwencji proinsuliny. DNA izolowany z plazmidu pkk500 tnie się StyI, trawi się nukleazą S1 dla usunięcia wystających końców i nadm iar nukleazy ekstrahuje się fenolem-chloroformem. Linearny plazmid następnie tnie się EcoRI, duży fragment oddziela się elektroforetycznie i izoluje przez elektroelucję. Ten fragment poddaje się ligacji z syntetycznym fragmentem (4) (SEQ ID NO:4) i mieszaninę ligacyjną transformuje się w E. coli. B1 10 Asn Ser Asn Gly Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His AAT TCG AAC GGC CGC TTC GTC AAC CAG CAC CTG TGC GGC TCG CAC (EcoRI) GC TTG CCG GCG AAG CAG TTG GTC GTG GAC ACG CCG ABC GTG Leu Val Glu Ala 20 L eu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe CTC GTG GAG GCC CTC TAC CTG GTG TGC GGG GAG CGC GGC TTC TTC GAG CAC CTC CGG GAG ATG GAC CAC ACG CCC CTC GCG CCG AAG AAG 30 Phe Tyr TAC ATG Thr ACC TGG Pro CCC GGG Lys AAG TTC B30 Thr ACC TGG C(B31) Arg CGC GCG
6 169 178 Pożądane klony sprawdza się analizą restrykcyjną zawartych w nich plazmidów, przy czym używa się nowo powstałego miejsca cięcia SstII. Następnie całkowity fragment SphI-SstI poddaje się sekwencjonowaniu. Dla ekspresji kodowanej fuzji białkowej, fragment sprawdzony analizą sekwencyjną poddaje się ligacji z pociętym tymi samymi enzymami wektorem p I J 702, przy czym powstaje wektor ekspresji pg F4. Badanie kodowanej przez pg F 4 i wydzielanej fuzji białkowej z jednej strony można przeprowadzić testem płytkowym inhibitora α-amylazy (zgłoszenie patentowe EP-A 0 161 629, przykład III), a z drugiej strony można wykonać w podłożu hodowli wstrząsanej analogicznie jak w przykładzie II. Przykład VI. Jeśli analogicznie jak w przykładzie V fragment (4) wbuduje się do wektorów pk K 5 10, 520 i 530, otrzymuje się wektory pkk 610, 620 i 630. W budowanie każdorazowo fragmentów SphI-SstI z sekwencją kodującą fuzje białkowe do wektora p IJ 702 daje wektory ekspresji p K F 11, 12 i 13. Ekspresję wydzielanych fuzji białkowych sprawdza się według przykładu II. Przykład VII. Dla zwiększenia ekspresji pochodnych plazmidu pij 702, usuwa się z niego prom otor melaniny przez trawienie PstI i SphI i zastępuje syntetycznym fragmentem (5) (SEQ ID NO:5). PstI B ci. 10 20 30 40 50 CTGCAGTGAICAGGGGGACCCIIGIGCGAATTTCCGTIACGGGTITGGGTGGTAGGG GACGTCACiUAGICCCCCIGGGAACACGCTIAAAGGCAAIGCCCAAACCCACCAICCC 60 70 80 SphI ACGCACCCGAAGAGGAGGCCCCAGCATGC TGCGTGGGCTTCTCCTCCGGGGTCGTACG Powstaje w ten sposób konstrukcja tandemowa z prom otora syntetycznego i łącznikowego (Tendamistat). Plazmid jest oznaczony p G R 110. Jeśli do pg R 110, po cięciu SphI i SstI, wprowadzi się syntetyczne fragmenty (1), (2) i (3), powstają w wyniku wektory ekspresji pg R200, 210 i 220. Podobnie z fragmentem (4) otrzymuje się wektory ekspresji pgr250, 260 i 270. Przykład VIII. Przy wytwarzaniu ludzkiej insuliny z prekursorów insuliny przez kombinację trypsyny lub innego tak samo działającego enzymu i karboksylopeptydazy B jest korzystne, w przebiegu reakcji rozszczepiania, szybko odszczepić am inoterm inalną część balastową aby promować reakcję rozszczepienia w kierunku B31 (Arg)-insuliny. Do tego odpowiednia jest modyfikacja aminokwasów przed aminokwasem B 1 (Phe): Postępuje się według przykładu I i otwiera się plazmid pkk500 enzymami restrykcyjnymi EcoRI i D raiii. Pierwotny fragment zostaje następnie zastąpiony fragmentem DNA (6) (SEQ ID NO:6) zsyntetyzowanym m etodą fosforaminową B1 Asn Ser Ala Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu 5 ' AAT TCG GCC CGC TTC GTC AAC CAG CAC CTG TGC GGC TCG CAC CTC 3' 3 ' GC CGG GCG AAG CAG TTG GTC GTG GAC ACG CCG AGC GTG 5 (EcoRI) (DraIII)
169 1 78 7 Klonowanie w E. coli i ekspresje Streptomycetes li v dans następują według przykładu I względnie II. W wyniku powstają plazmid pkk640 względnie plazmid ekspresji pkf14. Analogicznie można postępować z plazmidem otrzymanym według przykładu V (po wbudowaniu fragmentu (4)). Otrzymuje się plazmidy pkk650 względnie pkf15. Załącznik z opisu patentowego EP-A 0 367 163. T a b l i c a I ASN SER ASN GLY LYS B1 PHE VAL ASN GLN 10 H IS LEU CYS GLY SER H IS AAT TCG AAC GGC AAG TTC GTC AAC CAG CAC CTG TGC GGC TCG CAC ( E c o R I ) GC TTG CCG TTC AAG CAG TTG GTC GTG GAC ACG CCG AGC GTG LEU VAL GLU ALA 20 LEU TYR LEU VAL CYS GLY GLU ARG GLY PHE CTC GTG GAG GCC CTC TAC CTG GTG TGC GGG GAG CGC GGC TTC TTC GAG CAC CTC CGG GAG ATG GAC CAC ACG CCC CTC GCG CCG AAG AAG 30 PHE TYR THR PRO LYS THR C LYS A1 GLY IL E VAL 40 GLU GLN CYS CYS THR SER TAC ACC CCC AAG ACC AAG GGC ATC GTG GAG CAG TGC TGT ACG TCC ATG TGG GGG TTC TGG TTC CCG TAG CAC CTC GTC ACG ACA TGC AGG IL E CYS SER LEU 50 TYR GLN LEU GLU ASN TYR CYS ASN STP STP ATC TGC TCC CTC TAC CAG CTC GAG AAC TAC TGC AAC TAG TAA TAG ACG AGG GAG ATG GTC GAG CTC TTG ATG ACG TTG ATC ATT GTC GAC CTG CAG CCA CAG CTG GAC GTC GGT TCG A S a l I ( H in d I I I ) TABLICA I I 5 ' -CGATAAACCGATACAATTAAAGGCTCCTTTTGGAGCCTTTTTTTTTGGAGATTTTCAACGTGGATC GCTATTTGGCTATGTTAATTTCCGAGGAAAACCTCGGAAAAAAAAACCTCTAAa AGTTGCACCTAG-5
169 178 Departament Wydawnictw UP RP Nakład 90 egz. Cena 2,00 zł