Odbitka z czasopisma MEDYCYNA DOŚWIADCZALNA I MIKROBIOLOGIA" Nr 4/58 ZYGMUNT F.CKSTEIN, HALINA HALWEG, PAWEŁ KRAKOWKA, TADEUSZ URBAŃSKI O DZIAŁANIU FUNGISTATYCZNYM KWASU 3,4-DWUCHLOROFENOKSYACETOHYDROKSAMOWEGO NA GRZYBY CHOROBOTWÓRCZE IN VITRO* 7. II Katedry Technologii Organicznej Politechniki i z Pracowni Mykologicznej Instytutu Gruźlicy w Warszawie Badania nad działaniem fungistatycznym kwasów hydroksamowych doprowadziły w 1955 r. (Halweg, Krakówka) do wykrycia działania hamującego tych kwasów na wzrost grzybów chorobotwórczych (1, 2). Stwierdzono, że kwas salicylohydroksamovvy (T2), kwas benzohydroksamowy oraz kwas 2-hydroksy-3-naftohydroksamowy (T106) hamują wzrost grzybów z rodzaju Trichophyton. Natomiast związki te nie hamowały wyraźnie wzrostu drożdżowców chorobotwórczych. Alkiewicz (3) stosował kwas salicylohydroksamowy (T2) doustnie w dawkach dziennych 0,5 g u dzieci i 1,0 g u dorosłych w ciągu 10 dni dla leczenia chorych z głębokimi grzybicami głowy i brody i spostrzegał działanie lecznicze tego związku. W 1956 r. Eckstein i Urbański (4) wykazali, że pewne pochodne kwasów aryloksyacetohydroksamowych wykazują zdolność hamowania wzrostu grzybów pasożytujących na roślinach. Autorom niniejszej pracy wydawało się interesujące zbadać niektóre kwasy aryloksyacetohydroksamowe co do ich zdolności hamowania wzrostu grzybów chorobotwórczych. Badania wstępne przeprowadzono metodą cyhnderkową (rye. 1) na grzybach chorobotwórczych Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Trichophyton gypseum, Trichophyton rubrum, Trichophyton violaceum, Trichophyton schoenleini oraz na Pénicillium sp. W metodzie cylinderkowej górną warstwę stanowił 1,75% agar Sabouraud z glikozą, dolną warstwę agar 3,5% ph = 5,0. Na powierzchnię agaru, w którym umocowano cylinderki szklane lub metalowe o średnicy wewnętrznej 0,6 cm, zewnętrznej 0,8 cm i wysokości 1 cm, szczepiono zawiesinę odpowiedniego grzyba w roztworze fizjologicznym NaCl, którą sporządzano w kolbce z perełkami. Następnego dnia po zaszczepieniu grzyba wlewano do cylinderków nasycony roztwór badanego związku w acetonie. ph roztworów wynosiło 5,0. Hodowlę trzymano w temp. 28. Stwierdzono, że kwasy: 2,4-dwuchlorofenoksyacetohydroksamowy, 2,5-dwuchlorofenoksyacetohydroksamowy, 3,4-dwuchlorofenoksyacetohydroksamowy, 5-nitro-2,4-dwuchlorofenoksyacetohydroksamowy, 2-metylo-4-chlorofenokseyacetohydroksamowy, 2-naftoksyacetohydroksamowy i 1-naftoksyacetohydroksamowy hamowały wzrost poszczególnych ga- * Mykologiczna część pracy została wykonana w ramach prac Komitetu antybiotyków Polskiej Akademii Nauk.
488 Z. E C K S T E I N I INNI Nr 4 Rye. 1. Zahamowanie wzrostu Cryptococcus neoformans 38 dookoła cylinderka zawierającego kwas 3,4- dwuchlorofenoksyacetohydroksamowy w stężeniu 1 mg na 1 ml acetonu. Brak zahamowania dookoła cylinderka kontrolnego zawierającego aceton. tunków z rodzaju Trichophyton oraz Pénicillium. Niektóre z nich hamowały wzrost Cryptococcus neoformans. Kwas 3,4-dwuchlorofenoksyacetohydroksamowy hamował wzrost wszystkich badanych grzybów w tym Candida albicans (tabl. 1). Specjalną uwagę zwrócono na kwas 3,4-dwuchlorofenoksyacetohydroksamowy (I) ze względu na jego szeroki zakres działania. Cl ^~ % OCH, COHNOH (I) Kwas (I) jest to biała, krystaliczna substancja o temp. topnienia 143 144, która daje w środowisku wodno-alkoholowym typową reakcję (wiśniowe zabarwienie) z chlorkiem żelazowym oraz tworzy trudno rozpuszczalne, zielono zabarwione połączenia chelatowe z miedzią. Działanie fungistatyczne tego kwasu zbadano na 18 szczepach grzybów chorobotwórczych. W celu określenia najmniejszych stężeń badanej substancji hamującej wzrost badanych grzybów zastosowano metodę rozcieńczeń przy użyciu płynnej pożywki Sabouraud zawierającej 4 /o glikozy i 1% peptonu. Metodę przystosowano do badania wpły w u substancji fungistatycznych w ten sposób, że do probówek o wymiarach 16 x 160 mm wkładano bibułę złożoną w harmonijkę, na powierzchni której umieszczono krążek z twardej bibuły. Do probówek wlewano po 6 ml płynnej pożywki zawierającej różne ilości badanego związku. Badaną substancję rozpuszczano w acetonie ze względu na dobrą
Nr 4 K W A S 3, 4 - D W U C H L O R O F E N O K S Y A C E T O H Y D R O K S A M O W Y Tabela I Wyniki badań wstępnych przeprowadzonych metodą cylinderkową nad wpływem kwasów hydroksamowych na grzyby chorobotwórcze Kuias 2, 4-du uchlorofenoksyacetohydroksamouiy Candida albicans 102 co о 1 8 S д> о О g i «ts о a Л! w u to ~ a 55 *? Ю o С en o w ^ s * a 2 о о -i! 'с.2 s 3 Trichophyton Schoenleini III I F Pénicillium sp. 45 + + + + + + Kuias 2, 5-duJUchIorofenoksyacetohydroksamouiy - + 1 TT + + + Kuias 3, 4-du)ucliIorofenoksyacetohydroksamoujy + + + " + + + + Kuias 2-naft0ksyacetohydroksamouiy Kuias 5-nitro-2, 4-diruchlorofenoksyacetohydroksamouiy Kinas 2-metylo- 4-duiuchlorofenoksyacetohydroksamouiy Kuias 2, 4, 6-trójchlorofenoksyar.etohydroksuniouiy - Kuias 1-naftoksuacetohydroksamouiy - + i + + + - + + + + + + + + + Zahamowanie wzrostu grzyba dookoła cylinderków. Brak działania hamującego. - + + + + w nim rozpuszczalność i w związku z tym łatwość sporządzania rozcieńczeń. 10 ml roztworu dodawano do 190 ml pożywki z buforem (20 ml buforu fosforanowego o ph = 7 na 30 ml pożywki płynnej Sabouraud). Końcowe ph pożywki po dodaniu kwasów hydroksamowych wynosiło około 6. Największe stężenie badanej substancji wynosiło 1 mg na 1 ml pożywki. Dalsze probówki zawierały 0,5, 0,25 mg, 0,125 mg, 0,0625 mg itd. na 1 ml pożywki. Kontrolę stanowiły pożywki płynne z buforem fosforanowym, do których dodawano te same ilości acetonu. Celem odparowania acetonu i dodatkowego wyjałowienia, pożywki zawierające kwasy hydroksamowe jak i pożywki kontrolne poddawano ogrzewaniu w aparacie Kocha w ciągu 30 minut. Probówki szczepiono dając po 1 kropli jednorodnej zawiesiny grzyba w roztworze fizjologicznym NaCl. Badania przeprowadzano wykonując 3 5 doświadczeń dla każdego grzyba. W każdym doświadczeniu nastawiano 3 równoległe szeregi. Czas obserwacji wynosił 14 dni. Jako stężenie hamujące uważano minimalne stężenie badanego związku, które całkowicie hamowało wzrost grzybów w ciągu 14 dni. Hodowla na bibule pozwala na otrzymanie
490 Z. E C K S T E I N I INNI szybko dużego wzrostu grzybów w warunkach z obfitym dostępem tlenu i na szczepienie podłoży małą ilością homogennej zawiesiny grzybów. Wyrastały one na krążkach i na bibule wystającej ponad powierzchnię pożywki (ryc. 2). Rye. 2. Metoda hodowli grzybów na bibułkach. Na krążkach bibuły i na powierzchni wystającej nad powierzchnią pożywki w probówkach 3 i 4 widoczny wzrost grzyba Trichophyton gypseum. W ten sposób hodowano grzyby z rodzaju Trichophyton, Nocardia, Blastomyces dermatiditis, Histoplasma capsulaium, Sporotrichum schenckii. Szczepy należące do rodzaju Candida, Cryptococcus, Geotrichum i Aspergillus hodowano na tej samej pożywce bez bibułek. Stwierdzono całkowite zahamowanie wzrostu grzybów chorobotwórczych przy różnych stężeniach badanej substancji w zależności od rodzaju, gatunku i szczepu badanego grzyba. (Tabl. II). Ponadto stwierdzono, że kwas 3,4-dwuchlorofenoksyacetohydroksa-- mowy hamuje również wzrost różnych bakterii. W badaniach zastosowano metodę cylinderkową przy użyciu agaru bulionowego o ph = 7. Do cylinderków wlewano roztwór kwasu hydroksamowego o stężeniu 1 mg na 1 ml 25% etanolu. ph roztworu wynosiło 6. Dookoła cylinderków stwierdzono strefy zahamowania wzrostu następujących bakterii: Mycobacterium 607, Myc. phlei, Bacillus bodenheimer, B. subtilis 219, B. subtilis 6633, B. subtilis 220, Escherichia coli, Serratia marcescens 182, Staphylococcus aureus 209-P, Staphylococcus oxjord H, Staphylococcus albus, Sarcina lutea. Przeprowadzone badania wskazują na silne działanie fungistatyczne kwasu 3,4-dwuchlorofenoksyacetohydroksarnowego i zdają się wskazywać na wybitne uaktywnienie związku przez wprowadzenie podstaw-
Nr 4 K W A S 3, 4 - D W U C H L O R O F E N O K S Y A C E T O H Y D R O K S A M O W Y 491 Stężenia kwasu Tabela II 3,4-dwuchlorofenoksyacethydroksamowego całkowicie wzrost badanych grzybów w ciągu 14 dni hamujące Badany szczep Stężenie hamujące ujzrost badanych szczepóu) ш mg na 1 ml pożuujki Candida albicans 102... 0,250 Candida albicans К 0,125 0,250 0,250 0,250 Cryptococcus meoformans 38. 0,031 0,062 Cryptococcus neoformans.. 0,125 0,062 0,125 Geotrichum dermatiditis... 0,125-0,250 Blastomyces malatense.... 0,062 0,125* Histoplasma capsulatum.. 0,004-0,008 Sporotrichum shenckii... 0,125-0,250* Nocardia astéroïdes.... 0,250-0,500 0,125-0,250 Trichophyton schoenleini III IF 0,031 0,062* Trichophyton rubrum 3846. 0,062 0,250* Trichophyton violaceum 3905. 0,015 0,031* Trichophyton gypseum 768 0,125-0,250* Aspergillus fumigatus... 0,062 Podano najczęstsze stężenia hamujące całkowicie wzrost badanych grzybów. * Gwiazdkami oznaczono wyniki badań, w których zdarzały się pojedyncze wypadki wzrostu w stężeniach mniejszych i większych od podanych najczęstszych stężeń hamujących. Tabela III Działanie hamujące kwasu 3,4-dwuchlorofenoksyacetohydroksamowego w stężeniu 1 mg na 1 ml 25 /o etanolu N a 7.ШО szczepu Strefy zahamomania myrażone ш mm 1. Mycobacterium 607... 2-5 2. Mycobacterium phlei... 9-13 3. Bacillus bodenheimer... 4 4. Bacillus subtilis 219... 6-8 5. Bacillus subtilis 6633... 0-5 6. Bacillus subtilis 220... 0-5 7. Escherichia coli.... 2-3 8. Serratia marcescens 182. '. 0-4 9. Staphylococcus aureus 209-P 4-6* 10. Staphylococcus Oxford H.. 5-6* 11. Staphylococcus albus.. 6-10* 12, Sarcina lutea... 2-4* częściowe zahamowanie wzrostu.
492 Z. E C K S T E I N I INNI Nr 4 ników w pozycję 3,4 pierścienia benzenowego. Wyjątkowe rozszerzenie zakresu działania fungistatycznego badanych kwasów hydroksamowych przez podstawniki w pozycji 3,4 skłoniło nas do dalszych badań nad rolą różnych podstawników w tym układzie i wyniki tych badań będą przedmiotem oddzielnej publikacji. Szczepy badanych grzybów pochodzą z Pracowni Mykologicznej Instytutu Gruźlicy, Instytutu Pasteura w Paryżu, Kliniki Dermatologicznej w Warszawie, Pracowni Mykologicznej Szpitala Nr 2 w Warszawie i z Instytutu Serologicznego w Kopenhadze, szczepy bakterii z Państwowego Zakładu Higieny w Warszawie. 3. Э к ш T а й H, X. X а л ь в e г, П. К р а к у в к а, Т. У р б а н ь с к и О ФУНГИСТАТИЧЕСКОМ ДЕЙСТВИИ 3,4-ДЙХЛОРФЕНОКСИАПЕ- ТОГИДРОКСАМОЕСИ КИСЛОТЫ НА ПАТОГЕННЫЕ ГРИБКИ IN VITRO Содержание Исследования, проведенные чашечно-цилиндровым методом над восьмью гидроксамовыми кислотами, показали, что 7 из них действует фунгистатическн па патогенные грибки. Наибольшим дианозоном действия обладала 3,4-дихлорфеноксиацетогидроксам вая кислота. Действие этой кислоты исследовалось на 18 патогенных грибках при помощи метода разведений на жидкой среде. Эта кислота задерживала рост исследованных грибков, среди которых были дрожжи, актипомицеты, грибки рода Trichophyton и плесневые грибки. Наиболее сильное действие обнаружено по отношении к Histoplasma capsulatum. Исследованная гидрокслмозая кислота задерживала также рост различных бактерий. Z. Eckstein, H. Halweg, Р. Krakówka, T. U r b a ń s k i THE CYTOSTATIC ACTIVITY OF 3,4-DICHLOROPHENOXYACETOHYDRO- XAMIC ACID ON PATHOLOGIC FUNGI IN VITRO Summary Cup method investigations involving 8 hydroxamic acids showed 7 of these acids to exert cytostatic effects on pathogenic fungi. The widest range of activity was exhibited by 3,4 dlchlorophenoxyacetohydroxam:c acid. The activity of the acid was investigated on 18 pathogenic fungi with the aid of the dilution method in liquid medium. The acid in question inhibited the growth of the fungi including yeasts, actinomyces, Trichophyton variet and moulds. The most potent activity was noted on Histoplasma capsulatum. The hydroxamic acid also inhibited the growth of various bacteria. PIŚMIENNICTWO! 1. Halweg H., Krakówka P.: Bull. Acad. Polon. Sci., Cl. Ill, 1955, 3, 437. 2. Halweg H., Krakówka P.: Gruźlica, 1956, 4, 233. 3. Alkiewicz J., Eckstein Z., Halweg H., Krakówka P., Urbański T.: Nature, 1957, 180, 1204. 4. Eckstein Z., Urbański T.: Bull. Acad. Polon. Sci., Cl. III. 1956, 4, 627. Przemyśl Chemiczny, 1956. 12. 640.