UNIWERSYTET PRZYRODNICZY WE WROCŁAWIU ZAKŁAD FITOPATOLOGII pl. Grunwaldzki 24 a Wrocław tel , Raport

Transkrypt

1 UNIWERSYTET PRZYRODNICZY WE WROCŁAWIU ZAKŁAD FITOPATOLOGII pl. Grunwaldzki 24 a Wrocław tel , Raport z badań nad możliwością wzrostu na farbach: akrylowych - CT 42, CT 44; silikatowych - CT 54, CT 55 i silikonowej - CT 48, pięciu powszechnie występujących w budynkach gatunków grzybów pleśniowych Zleceniodawca: Henkel Polska sp. z o.o. Zakład Produkcyjny Stąporków Stąporków Wrocław,

2 Metody badań 1. Przedmiot badania Badano farby: a.) akrylowe - CT 42 i CT 44; b.) silikatowe - CT 54 i 55; c.) silikonową - CT 48. Farby zostały naniesione w laboratorium badawczym na płytki szklane o wymiarach 0,1 x 3 x 4 cm. Kontrolnie, po 10 dniowym okresie inkubacji, w celu sprawdzenia czystości mikrobiologicznej farb, na pożywkę PDA wyłożono po 30 próbek pokrytych każdą z badanych farb oraz płytki nie pokryte farbą. 2. Kultury grzybów Do testowania podatności farb na przerastanie przez grzyby wybrano 5 najczęściej występujących na powierzchniach murów gatunków: Alternaria alternata (Fr.) Keissler (KF 2005/30), Aspergillus fumigatus Fresen. (KF 2006/231), Cladosporium cladosporioides (Fresen.) G.A. de Vries (KF 2005/543), Penicillium notatum Westling (KF 2005/112), Penicillium waksmani Zaleski (KF 2004/56). Grzyby pochodziły z kolekcji kultur Zakładu Fitopatologii Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu (w nawiasie obok nazw gatunkowych podano nr. katalogowe izolatów), zostały wyosobnione w 2005 i 2006 r. z powierzchni materiałów budowlanych, podczas badań nad zasiedlaniem pomieszczeń mieszkalnych i użyteczności publicznej przez grzyby pleśniowe. W doborze gatunków kierowano się: kosmopolitycznym występowaniem gatunku, częstością jego występowania, wynikami ekspertyz wykonywanych przez Polskie Stowarzyszenie Mykologów Budownictwa, wynikami badań epidemiologicznych oraz potencjalnym zagrożeniem dla zdrowia człowieka (Zarys Mikologii Lekarskiej pod red. Eugeniusza Barana. Wrocław, Volumed 1998). Grzyby hodowano na agarze glukozowo-ziemniaczanym (PDA) firmy Diffco, zakwaszonym kwasem tartarowym do ph 5,7. 3. Badanie podatności farb na rozwój grzybów Oceny podatności farb wykonano następującymi metodami: A. Posiew zarodników na materiał badawczy Zarodniki powstałe w 14 dniowych kulturach grzybów spłukiwano do kolby z 0,2 % wodnym roztworem PDA. Tak uzyskana zawiesinę zarodników rozcieńczano do uzyskania koncentracji 10 5 zarodników w 1 ml. Tak sporządzoną zawiesinę, nanoszono sterylną pipeta, w ilości 0,2 ml na środkową część płytek w liczbie po 50 dla każdej z badanych farb, z podziałem na pięć 10 szalkowych powtórzeń. W celu zapewnienia optymalnych dla wzrostu grzybów warunków, farby umieszczano w wilgotnej komorze z wilgotnością względną powietrza 95-98% i t 22 o C. Po

3 20 dniowym okresie inkubacji, badany materiał poddano powierzchniowej 12 godzinnej sterylizacji za pomocą lampy Philips TUV, emitującej promieniowanie ultrafioletowe (UV- C) o długości fali w zakresie nm, z maksimum (95% energii) przy długości fali 253,7nm. Lampę umieszczono w odległości 1 m od powierzchni farby. Po naświetlaniu, w celu ponownej hodowli grzybów ewentualnie zasiedlających wnętrze powłoki malarskiej, próbki wyłożono na agar glukozowo-ziemniaczany PDA. Kontrolę stanowiły próbki farby niepokryte zawiesiną zarodników grzybów oraz podłoże szklane. B. Posiew grzybów na szalki Do podłoża PDA, na szalce o średnicy 9 cm wprowadzano 1 ml zawiesiny zawierającej 10 2 zarodników. W przypadku każdego z badanych gatunków grzybów, w środku szalki, w 150 powtórzeniach, umieszczano po jednej płytce szklanej, pomalowaną powierzchnią w stronę pożywki. Kontrolnie, na pożywkę wykładano płytki bez farby, po 10 szt. dla każdego gatunku grzyba. Po 14 dniach oceniano stopień pokrycia szalek przez kolonie grzybów. Mierzono strefę wolnej od grzybów pożywki wokół próbek farby. Następnie 50 próbek sterylizowano światłem UV; 50 - odkażano powierzchniowo 2% roztworem H 2 O 2 przez 10 sekund; kolejne 50 odkażano 0,5% podchlorynem sodu, nanosząc NaClO atomizerem (rozpylaczem) w ilości 0,2 ml/cm 2 powłoki malarskiej, po czym płytki przetrzymywano przez 60 sekund w szczelnie zamkniętym naczyniu. Po odkażaniu próbki wyłożono na agar glukozowo-ziemniaczany PDA. Wyrastające kolonie liczono. C. Wykładanie płytek z farbą na rozwinięte kolonie grzybów Płytki z farbami odkażano lampa UV (jak w punkcie 3A). Po czym, po powierzchniowym zwilżeniu sterylną wodą, rozpylaczem, w ilości 0,1ml, owijano szczelnie połowę ich powierzchni parafilmem, tak by możliwe było ewentualne boczne wrastanie grzybni w strukturę farby. Po czym umieszczano na rosnącej w centrum szalki kolonii grzybów, w ten sposób by połowa, nie przykrytej parafilmem powierzchni farby, przykryła kolonię. Po 14 dniowej inkubacji cześć nie pokrytą parafilmem odkażano w 0,5% podchlorynie sodu przez 10 sekund, parafilm odwijano, a próbki wykładano na podłoże PDA, zaznaczając ewentualną obecność kolonii na każdej z polówek badanej powłoki malarskiej. Wyniki badań Przygotowane do badań farby wraz z podłożem, praktycznie nie wykazywały zasiedlenia przez grzyby. Uzyskane pojedyncze kolonie grzybów rodzaju Penicillium dostały się na powierzchnię materiału podczas przechowywania próbek. Zbadane farby akrylowe - CT 42 i CT 44; silikatowe - CT 54 i CT 55 oraz silikonowa - CT 48 przetrzymywane w warunkach prowokacyjnych wyjątkowo sprzyjających rozwojowi grzybów - wykazywały wysoką, całkowitą odporność na przerastanie przez grzyby pleśniowe. Zarówno w próbach, w których nanoszono zawiesinę zarodników (tab.1a,b), jak również po wykładaniu farb na rosnące na pożywce grzyby, po powierzchniowym odkażeniu materiału, uzyskiwano pojedyncze kolonie grzybów (tab. 2 i 3). Te sporadycznie uzyskane kolonie były efektem kontaminacji biologicznej pojawiającej się podczas operowania materiałem biologicznym, zdolnym do wytwarzania ogromnej liczby zarodników na niewielkich

4 powierzchniach. W tego typu badaniach jest to zjawisko powszechnie obserwowane i nie świadczy o zdolności penetracji grzybni w badanych strukturach. Tab. 1.Kolonie grzybów uzyskane z farb pokrytych zawiesiną zarodników, odkażanych po inkubacji promieniowaniem UV a. akrylowe Gatunek grzyba Liczba izolatów CT 42 CT 44 podłoże Alternaria alternata 1 Aspergillus fumigatus Cladosporium cladosporioides Penicillium notatum Penicillium waksmani razem kolonii na 50 prób b. silikatowe i silikonowa Gatunek grzyba Liczba izolatów silikatowa silikonowa CT CT 54 CT podłoże Alternaria alternata Aspergillus fumigatus Cladosporium cladosporioides Penicillium notatum Penicillium waksmani 1 razem kolonii na 50 prób

5 Tab. 2. Wielkość strefy inhibicyjnej oraz liczba kolonii grzybów uzyskanych z farb akrylowych CT 42 i CT 44 poddanych inokulacji grzybami, a następnie odkażanych powierzchniowo Obszar strefy Liczba kolonii gatunek grzyba inhibicyjnej, średnia z Po odkażaniu 50 powtórzeń (cm) UV H 2 O NaClO CT42 CT44 CT42 CT44 CT42 CT44 CT42 CT44 Alternaria alternata 0,4 0,6 Aspergillus fumigatus 1,7 1,8 1 Cladosporium cladosporioides 0,3 0,4 1 Penicillium notatum 1,5 1,6 Penicillium waksmani 1,3 1,2 2 razem kolonii Tab. 3. Wielkość strefy inhibicyjnej oraz liczba kolonii grzybów uzyskanych z farb silikatowych - CT 54, CT 55 i silikonowej CT 48 poddanych inokulacji grzybami, a następnie odkażanych powierzchniowo Obszar strefy Liczba kolonii gatunek grzyba inhibicyjnej, średnia z 50 Po odkażaniu powtórzeń (cm) UV H 2 O NaClO CT54 CT55 CT48 CT54 CT55 CT48 CT54 CT55 CT48 CT54 CT 55 CT48 Alternaria alternata 0,6 0,8 0,5 1 Aspergillus fumigatus 1.9 1,6 1,7 3 Cladosporium cladosporioides 0,2 0,5 0,3 1 1 Penicillium notatum 1,2 0,9 1,4 Penicillium waksmani 0,9 0,9 1,2 1 razem kolonii

6 Tab. 4. Wielkość strefy inhibicyjnej oraz liczba kolonii grzybów uzyskanych z podłoża szklanego poddanego inokulacji grzybami, a następnie odkażanego powierzchniowo Gatunek grzyba Liczba kolonii Obszar strefy inhibicyjnej, Odkażanie średnia z 50 powtórzeń (cm) UV H 2 O 2 NaClO Alternaria alternata 0 Aspergillus fumigatus 0 Cladosporium cladosporioides 0 Penicillium notatum 0 Penicillium waksmani 0 razem kolonii Tab. 5. Liczba kolonii grzybów na odkażanych i nieodkażanych - wcześniej pokrytych parafilmem, powierzchniach farb akrylowych - CT 42 i CT 44 CT 42 CT 44 gatunek grzyba wzrost grzybni na wzrost grzybni na części części części części odkażanej pokrytej odkażanej pokrytej parafilmem parafilmem Alternaria alternata 2 Aspergillus fumigatus Cladosporium cladosporioides 1 Penicillium notatum 1 Penicillium waksmani razem kolonii Tab. 6. Liczba kolonii grzybów na odkażanych i nieodkażanych - wcześniej pokrytych parafilmem, powierzchniach farb silikatowych - CT 54, CT 55 i silikonowej - CT 48 gatunek grzyba CT 54 CT 55 wzrost grzybni na wzrost grzybni na części części odkażanej odkażanej części odkażanej części pokrytej parafilmem Alternaria alternata Aspergillus fumigatus 1 Cladosporium cladosporioides Penicillium notatum Penicillium waksmani razem kolonii

7 Tab. 7. Liczba kolonii grzybów na odkażanej i nieodkażanej - wcześniej pokrytej parafilmem, powierzchni farby silikonowej - CT 48 gatunek grzyba CT 48 wzrost grzybni na części odkażanej części pokrytej parafilmem Alternaria alternata 2 Aspergillus fumigatus Cladosporium cladosporioides Penicillium notatum Penicillium waksmani razem kolonii 0 2 Fot. 1. Brak kolonii grzybów na powłokach malarskich i agarze glukozowo-ziemniaczanym po powierzchniowym odkażeniu CT 44 światłem UV. Płytki z farbą wcześniej inokulowane Alternaria alternata (A.a.) i Cladosporium cladosporioides (Cl.cl.) Fot. 2. Brak kolonii grzybów na powłokach malarskich i agarze glukozowo-ziemniaczanym po powierzchniowym odkażeniu CT 48 światłem UV. Płytki z farbą wcześniej inokulowane Penicillium waksmani

8 Fot. 3. Strefa inhibicyjna nieporośnięta grzybnią Cladosporium cladosporioides wokół próbek farb CT 44 i CT 48 Fot. 4. Strefa inhibicyjna nieporośnięta grzybnią Penicillium notatum wokół próbek farb CT 44 i CT 48 Fot. 5. Strefa inhibicyjna nieporośnięta grzybnią Aspergillus fumigatus wokół próbki farby CT 44

9 Fot. 6. Asymetryczny wzrost grzybni Cladosporium cladosporioides w kierunku pożywki, powodowany obecnością środka biobójczego w farbie CT 44. Brak wzrostu w kierunku płytki Fot. 7. Asymetryczny wzrost grzybni Alternaria alternata w kierunku pożywki, powodowany obecnością środka biobójczego w farbie CT 54. Brak wzrostu w kierunku płytki Stwierdzono, że materiały i substancje zastosowane w procesie produkcji farb zapobiegają zarówno rozwojowi powierzchniowemu grzybów jak również ich wnikaniu w strukturę farby (tab. 2,3). Po 20 dniowej próbie hodowli grzybów, na powierzchni ocenianych powłok malarskich, nie zaobserwowano widocznych niezbrojnym okiem kolonii grzybów, jak również trwale związanych z powierzchnią farb struktur grzybów (fot. 1, 2). Zastosowane w procesie produkcji farb akrylowych - CT 42, 44; silikatowych CT 54, 55 oraz silikonowej - CT 48 substancje biocydowe bardzo dobrze zabezpieczały powłoki malarskie przed rozwojem badanych mikroorganizmów. Działanie tych substancji było dobrze widoczne podczas wzrostu grzybów na szalkach, na które nanoszono zawiesinę zarodników. Tworzące się, wyraźnie widoczne czasem kilkucentymetrowe strefy inhibicyjne świadczą o skuteczności zastosowanych preparatów chroniących przez grzybami (tab. 2 i 3) (fot. 3-5). Stosując metodę opisana w punkcie 3C sprawdzono, że grzybnie nie maja możliwości przerastania powierzchni wszystkich badanych farb. Potwierdzono tym samym wyniki uzyskane podczas inokulacji (wprowadzania żywych struktur grzybów) innymi sposobami (tab. 5, 6 i 7). W przypadku niesymetrycznego wykładania płytek z farbą bezpośrednio na

10 kolonie grzybów (3C) zaobserwowano wyraźne zahamowanie wzrostu grzybni, oraz w niektórych przypadkach, nietypowy dla hodowli szalkowych, niesymetryczny rozwój kolonii w kierunku pożywki PDA (fot. 6 i 7). dr inż. Krzysztof Matkowski mikolog