Wpływ ph i temperatury na aktywność enzymów na przykładzie α-amylazy [EC 3.2.1.1.] Szybkość katalizowanej przez enzym przemiany danego substratu w określony produkt jest ściśle uzależniona od stężenia zarówno enzymu, jak i substratu (patrz ćwiczenie 4 i 5). Nie są to jednak jedyne czynniki determinujące przebieg reakcji. na katalityczne działanie enzymów mają również wpływ: stężenia jonów wodorowych (ph), temperatura reakcji, w niektórych przypadkach potencjał redukcyjno - oksydacyjny środowiska, w którym zachodzi reakcja, obecność rozmaitych związków niskocząsteczkowych (koenzymów, aktywatorów, inaktywatorów), a także siła jonowa i stała dielektryczna środowiska. Wpływ ph na aktywność enzymów Enzymy jako białka charakteryzują się określonym stanem jonowym zależnym od pi i ph środowiska. Mogą one występować w formie elektrododatniego kationu, elektroobojętnego amfijonu lub elektroujemnego anionu. Ładunek cząsteczki białka enzymatycznego ma istotny wpływ na jego czynność katalityczną, ponieważ determinuje siłę oddziaływań wodorowych i jonowych, zarówno stabilizujących konformację molekuły, jak i umożliwiających powstanie kompleksu enzym substrat. Zależność V = f(ph) obrazuje krzywa o charakterystycznym dzwonowym kształcie, posiadająca maksimum odpowiadające tzw. optymalnemu ph działania enzymu. Wykres 1. Zależność aktywności enzymu od wartości ph - V = f(ph) W miarę oddalania się od wartości ph optymalnego aktywność enzymu obniża się najpierw na skutek utrudnionego łączenia się enzymu z substratem, w ph ekstremalnych wskutek inaktywacji cząsteczki białka. Wartość ph jest charakterystyczna dla przemiany danego subtratu w określony produkt, katalizowanej przez specyficzny enzym.
Wpływ temperatury na szybkość reakcji enzymatycznej Wzrost temperatury wywołuje wzrost szybkości reakcji każdej reakcji chemicznej, zgodnie z równaniem Arrheniusa: V k[ S], k Ae Temperatura wpływa na wszystkie etapy reakcji enzymatycznej: wzrost temperatury zwiększa kinetyczną energię substancji reagujących, a więc prawdopodobieństwo ich skutecznych, to jest prowadzących do powstania produktu, zderzeń podwyższona temperatura osłabia, a po przekroczeniu pewnej wartości nawet niszczy niektóre słabe oddziaływania (np. wodorowe) w molekule enzymu, co prowadzi do stopniowej denaturacji białka enzymatycznego Te dwa przeciwstawne efekty powodują, że zależność V = f(t) jest obrazowana krzywa dzwonową, posiadającą mniej lub bardziej ostre maksimum, nazywane najczęściej optymalną temperaturą działania enzymu. Wielkość ta nie ma charakteru bezwzględnego: jest zależna od czasu, w jakim zachodzi reakcja enzymatyczna. im czas reakcji krótszy, tym mniej rozległy zasięg zmian denaturacyjnych w białku enzymatycznym poddanym działaniu danej temperatury. Wówczas maksimum krzywej V = f(t) przesuwa się ku wyższym wartościom temperatury. Wykres 2. Zależność aktywności enzymu od temperatury V = f(t) Ea RT Przebieg enzymatycznej hydrolizy skrobi α-amylazy to szeroko rozpowszechnione w przyrodzie enzymy należące do klasy hydrolaz i podklasy hydrolaz glikozydowych. Wytwarzają je liczne drobnoustroje oraz organizmy roślinne i zwierzęce. Ze względu na wartość produkcji i zapotrzebowanie, najważniejszymi przemysłowymi preparatami tego enzymu są α-amylazy bakteryjne, wytwarzane przez szczepy z rodzaju Bacillus oraz roślinna α-amylazy ze słodu. U człowieka enzym amylaza występuje w ślinie, trzustce, surowicy krwi i moczu. Amylaza śliny i trzustki wykazuje aktywność w roztworach lekko zasadowych, obojętnych i słabo kwasowych. Skrobia jest wielkocząsteczkowym polimerem α-d-glukopiranozy. Znane są dwie frakcje skrobi: nierozgałęziona amyloza, w której reszty glukozy połączone są wiązaniami
α-1,4-glikozydowymi w długie łańcuchy oraz amylopektyna, w której oprócz głównych wiązań α-1,4-glikozydowych występują także wiązania rozgałęziające α-1,6-glikozydowe. α-amylaza rozkłada tylko wewnętrzne wiązania α-1,4-glikozydowe, powodując stopniowe rozszczepienie łańcuchów skrobi na coraz krótsze fragmenty, zwane dekstrynami. Przebieg tego etapu degradacji skrobi, zwanego etapem dekstrynowania, można śledzić dzięki barwnej zarówno nierozłożonej skrobi, jak i dłuższych dekstryn z roztworem jodu w jodku potasu. Nierozłożona skrobia w reakcji z tym odczynnikiem zabarwia się na kolor ciemnoniebieski. Nieco krótsze od łańcuchów skrobi, łańcuchy powstałym pod działaniem α-amylazy dekstryn (amylodekstryn) zabarwiają się z I 2 w KI na kolor fioletowy, a jeszcze krótsze produkty hydrolizy erytrodekstryny barwią się podczas wspomnianej reakcji na kolor czerwono-brunatny. α-amylaza degraduje powstające erytrodekstryny do achrodekstryn, których łańcuchy są zbyt krótkie by mogło dojść do ich barwnej reakcji z roztworem jodu w jodku potasu. W drugim etapie hydrolizy, achrodekstryny są rozkładane przez enzym do glukozy, maltozy i mieszaniny oligocukrów redukujących zawierających do 5 reszt glukozy w cząsteczce, które również nie zabarwiają się w reakcji z jodem w jodku potasu. Zasada oznaczania aktywności α-amylazy W celu zaobserwowania przebiegu hydrolizy skrobi pod działaniem α-amylazy wykorzystuje się metody pozwalające na pomiar przyrostu stężenia cukrów redukujących uwalnianych z substratu przez enzym. Są to między innymi metody: Fehlinga, Somogyi - Nelsona, oraz Hagedorna Jensena, w których stężenia cukrów redukujących oznacza się na podstawie ilości Cu 2 O powstającego na skutek redukcji jonów miedziowych przez wolne grupy redukujące cukrów, oraz metoda Millera z kwasem 3,5 -dinitrosalicylowym (DNS) stosowana w niniejszym ćwiczeniu. W metodzie Millera aktywność enzymu oznacza się mierząc przyrost cukrów redukujących uwolnionych w czasie reakcji hydrolizy skrobi katalizowanej przez α-amylazę przebiegającej w przyjętych warunkach temperatury i ph. Cukry te oznacza się ilościowo stosując alkaliczny roztwór kwasu 3,5 -dinitrosalicylowego (DNS). W analogiczny sposób można oznaczyć aktywność dowolnej hydrolazy glikozydowej, stosując odpowiedni dla niej substrat. DNS nie tylko umożliwia oznaczenie stężenia cukrów redukujących, ale także pełni rolę inaktywatora enzymu, hamującego katalizowaną przez niego reakcję. W środowisku alkalicznym i w temperaturze 100 C DNS ulega redukcji pod działaniem cukrów redukujących, dając pochodną aminową, zabarwioną w środowisku alkalicznym na kolor pomarańczowy. Natężenie barwy, o maksimum absorbancji przy długości fali λ = 540 nm, jest proporcjonalne do stężenia cukrów redukujących w badanym roztworze. Stężenie cukrów redukujących w próbie odczytuje się z krzywej wzorcowej A 540 = f(c maltozy ), przygotowanej w warunkach oznaczenia.
Wykres 1. Krzywa wzorcowa. Zależność absorbancji przy λ = 540 nm od stężenia maltozy - A 540 = f(c maltozy ) Literatura: Witwicki J., Ardelt W., Elementy enzymologii, Polskie Wydawnictwo Biochemiczne, 1984 Sivak M.N, Preiss J;. Starch: Basic Science to Biotechnology. Advances in Food and Nutrition Research, vol. 41. New York: Academic Press, 1998 Miller G.L.; Use of dinitriosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar, Anal. Chem., 31, 426 428, 1959 ODCZYNNIKI-MATERIAŁY-SPRZĘT 1% koloidalny roztwór skrobi roztwory buforowe o ph: 3, 4, 5, 6, 7, 8 1% alkaliczny roztwór kwasu 3,5 -dinitrosalicylowego (DNS) woda destylowana termobloki: 37, 50 oraz 100 C spektrofotometr stoper
PROCEDURA Przygotowanie roztworu śliny 1. Do probówki 50 ml wprowadzić 5 ml śliny. 2. Następnie rozcieńczyć ślinę wodą destylowaną 1:1. 3. Tak przygotowany roztwór enzymu użyć do wykonania kolejnych punktów ćwiczenia. Wpływ ph na aktywność α-amylazy 1. Do 6 probówek odmierzyć po 0,5 ml 1% koloidalnego roztworu skrobi (po uprzednim dokładnym wymieszaniu) i po 0,25 ml buforów o różnych ph (3, 4, 5, 6, 7, 8). Zawartość dokładnie wymieszać. Równocześnie przygotować próbę odczynnikową zawierającą (0,5 ml 1% koloidalnego roztworu skrobi, 0,25 ml buforu o ph 7 oraz 0,25 ml wody, UWAGA: do próby odczynnikowej nie dodajemy roztworu śliny) 2. Do każdej z probówek dodać po 0,25 ml roztworu śliny (oprócz próby odczynnikowej). Zawartość probówek natychmiast wymieszać i inkubować w temperaturze 37 C w ciągu 20 minut. 3. Po upływie 20 minut, pobrać 0,2 ml mieszaniny reakcyjnej i przenieść ją do nowej probówki, do której wprowadzić także 0,2 ml roztworu DNS. Zawartość probówek wymieszać i inkubować w ciągu 10 minut w termobloku 100 C. 4. Po 10 minutach probówki wyjąć, schłodzić do temperatury pokojowej pod bieżącą wodą i dodać do mieszaniny po 0,6 ml wody destylowanej. Zawartość wymieszać. 5. Zmierzyć absorbancję roztworu przy λ=540 nm (A 540 ) wobec próby odczynnikowej. 6. Z krzywej wzorcowej odczytać stężenie cukrów redukujących w mieszaninie reakcyjnej (mg maltozy /ml). Wyniki umieścić w tabeli. 7. Na podstawie tabeli sporządzić wykres zależności stężenia cukrów redukujących uwolnionych ze skrobi pod działaniem zastosowanego preparatu α-amylazy od ph środowiska, w której przebiegała reakcja. Wpływ temperatury na aktywność α-amylazy 1. Do 4 probówek odmierzyć po 0,5 ml 1% koloidalnego roztworu skrobi (po uprzednim dokładnym wymieszaniu) i po 0,25 ml buforu o ph 7. Zawartość dokładnie wymieszać. Równocześnie przygotować próby odczynnikowe dla każdej temperatur zawierające (0,5 ml 1% koloidalnego roztworu skrobi, 0,25 ml buforu o ph 7 oraz 0,25 ml wody, UWAGA: do prób odczynnikowych nie dodajemy śliny) 2. Każdą z probówek inkubować w ciągu 5 minut w następujących temperaturach: pokojowa, 5 C (lodówka), 37 C oraz 50 C. 3. Po 5 minutach do każdej z probówek dodać po 0,25 ml roztworu śliny (oprócz prób odczynnikowych). Zawartość probówek natychmiast wymieszać i inkubować w podanych powyżej temperaturach w ciągu 20 minut. 4. Po upływie 20 minut, pobrać 0,2 ml mieszaniny reakcyjnej i przenieść ją do nowej probówki, do której wprowadzić także 0,2 ml roztworu DNS. Zawartość probówek wymieszać i inkubować w ciągu 10 minut w termobloku 100 C.
5. Po 10 minutach probówki wyjąć, schłodzić do temperatury pokojowej pod bieżącą wodą i dodać do mieszaniny po 0,6 ml wody destylowanej. Zawartość wymieszać. 6. Zmierzyć absorbancję roztworu przy λ=540 nm (A 540 ) wobec prób odczynnikowych. 7. Z krzywej wzorcowej odczytać stężenie cukrów redukujących w mieszaninie reakcyjnej (mg maltozy /ml). Wyniki umieścić w tabeli. 8. Na podstawie tabeli sporządzić wykres zależności stężenia cukrów redukujących uwolnionych ze skrobi pod działaniem zastosowanego preparatu α-amylazy od temperatury, w której przebiegała reakcja.