KWAS CYTRYNOWY SIDEROFOREM ENTEROKOKÓW?

MED. DOSW. MIKROBIOL., 2004, 56, 29-40 Pawel Lisiecki, Jerzy Mikucki KWAS CYTRYNOWY SIDEROFOREM ENTEROKOKÓW? Katedra Biologii i Biotechnologii Uniwersytety Medycznego w Lodzi Zaklad Mikrobiologii Farmaceutycznej Kierownik Zakladu: prof. dr hab. E. M. Szewczyk Zbadano 70 szczepów z rodzaju Enterococcus aby wyjasnic czy kwas cytrynowy moze pelnic u nich role sideroforu uczestniczacego w zaopatrywaniu komórek w zelazo. W róznych warunkach dostepnosci zelaza badano uwalnianie kwasu cytrynowego, wykorzystywanie kompleksu Fe3+-dicytrynian do stymulacji wzrostu i pobierania tego kompleksu do komórek. Enterokoki sa fizjologicznymi komensalami ludzi. Bytuja glównie w przewodzie pokarmowym lecz moga równiez wystepowac w jamie ustnej i sklepieniu pochwy (26). Pomimo niskiej zjadliwosci enterokoki sa czesta przyczyna róznych oportunistycznych zakazen (26). Podczas inwazji tkanek enterokoki napotykaja srodowisko rózne od ich dotychczasowych siedlisk. Stezenie wolnego zelaza - lo-18mjest w nim niewystarczajace dla podtrzymania wzrostu i dla pozyskania go niezbedne jest wykorzystywanie sideroforów (24,27). Lisiecki i wsp. (20) wykazali, po raz pierwszy, ze enterokoki wytwarzaja siderofory zaliczane do grupy chelatorów hydroksamowych. Stosunkowo niedawno odkryto, ze a-keto i a -hydroksykwasy kompleksujac zelazo sluzyly bakteriom z rodzajów Proteus, Providencia i Morganella jako si derofory (8), a u S. Typhimurium stezenie zelaza regulowalo wydzielanie do srodowiska a-ketokwasów (29). Kwas cytrynowy, trój karboksylowy a-hydroksykwas uczestniczy jako siderofor w transporcie zelaza u E. coli w postaci kompleksu Fe3+-dicytrynian (24,27). Celem przedstawionych tu badan bylo wyjasnienie czy kwas cytrynowy, metabolit posredni cyklu kwasów trójkarboksylowych, moze jako chelator i nosnik zelaza uczestniczyc w jego transporcie do komórek bakterii z rodzaju Enterococcus. MATERIAL I METODY S z c z e p y b a k t e ryj n e. W badaniach wykorzystano 70 szczepów z rodzaju Enterococcus. Czesc z nich - 33 szczepy pochodzily z kolekcji wlasnej, 21 ze zbioru Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego, a pozostalych 16 szczepów z czeskiej i niemieckiej kolekcji drobnoustrojów (CCM i DSM). Identyfikacje enterok oków pochodzacych z wlasnej kolekcji przeprowadzano przy uzyciu zestawu Praca dofinansowana z grantu wewnetrznego Umowa Nr 502/13/224

30 P. Lisiecki, J. Mikucki Nr1 API-STREP (biomerieux). Szczepy przechowywano w temperaturze -70 C w 3,7% pozywce plynnej BHI (Brain Heart Infision, Difco) zawierajacej 50% glicerolu. p o z y w k i. Uzywano pozywki zawierajacej (w litrze): 3 g Casamino Acids, Vitarnin Free (Difco); 3 g Yeast Extract (Difco); 3 g KH2P04; 5 g NaCI; 1 g NH4CI; 0,09 g MgCI2; 0,01 g CaCI2; 12,1 g TRIS (hydroksymetylo) aminometan (BDH) i 20% glukozy, ph pozywki doprowadzano do 7,2. Zawartosc zelaza obnizano do stezenia 3,5 x 10-7M za pomoca zywicy poliaminokarboksylowej Chelex100 (200-400mesh) (BioRad) wzglednie przez koordynacyjne wiazanie za pomoca roztworu o-fenantroliny w stezeniach odpowiadajacych MIC lub 50% MIC badanego szczepu. Pozywki z o-fenantrolina przetrzymywano przez 24 godziny w temperaturze 4 C dla efektywnego zwiazania wolnego zelaza przez chelator. War u n k i h o d o w l i. Zawiesina enterokoków w pozywce o gestosci optycznej AS80=1, glodzonych uprzednio przez 18 godzin w temperaturze 37 C na podlozu Mueller-Hintona 2 (biomerieux) stanowila inokulum. Zakazano nim (5% v/v), zaleznie od potrzeb, pozywki o róznej zawartosci zelaza: Fe+ zawierajacej 100 p,m zelaza w postaci Fe2S04 x 7H20, Fe- poddanej dzialaniu zywicy Chelex - Fe- (Chelex) i zawierajacej o-fenantroline w stezeniu odpowiadajacym 50% MIC - Fe- (fenantrolina). Pozywki inkubowano w temperaturze 37 C przez 24 godziny przy stalym wstrzasaniu (120 cykli/min). Po inkubacji oznaczano gestosc optyczna hodowli A=580nm i liczbe zywych komórek w mililitrze, a nastepnie hodowle wirowano (9500 x g, 15 min., 4 C). Plyn znad osadu hodowli saczono przez filtr membranowy 0,22 p,m (Millipore) i oznaczano stezenie kwasu cytrynowego oraz sideroforu hydroksamowego. c e n a w z r o s t u w z a w i e s i n a c h i h o d o w l a c h p l y n n y c h. Liczbe zywych komórek oceniano droga posiewu rozcienczen w buforowanym fosforanami roztworze 0,85% NaCI (Biomed) na plytki z 4% Trypticase Soy Agar (Difco). Gestosc optyczna oceniano w kolorymetrze spektralnym Spekol (Zeiss) przy dlugosci fali swietlnej 580 nm. Zawiesiny standaryzowano równiez przy uzyciu skali McFarlanda (Difco). K o m p l e k s y z e l a z a. Kompleksy Fe3+z kwasem pirogronowym (Sigma), kwasem szczawiooctowym (Sigma), kwasem a-ketoglutarowym (Sigma), desferrioksamina B (Ciba-Geigy), kwasem rodotorulowym (Sigma) i kwasem 2,3-dihydrobenzoesowym (Sigma) tworzono przez zmieszanie odpowiednich roztworów chelatora i FeCl3 x 6H20 (Sigma) metodami opisanymi przez Drechsela i wsp. (8). Kompleks dicytrynianu zelaza przygotowano przez zmieszanie cytrynianu sodu (Sigma) z FeCl3 x 6H20 (Sigma) w stosunku 200:1 (13). Kompleks dicytrynianu z zelazem radioaktywnym przygotowano przez zmieszanie cytrynianu sodu z 59FeCl3(Amersham, aktywnosc specyficzna 15,49 mci /mg) w stosunku 200:1. z n a c z a n i e k was u c Y t r y n o w e g o. Kwas cytrynowy oznaczano przy uzyciu standardowego zestawu enzymów (Boehringer Mannheim) zawierajacego liaze cytrynianowa oraz dehydrogenazy - jablczanowa i mleczanowa. Pomiary spektrofotometryczne utlenionego NADH wykonywano w spektrofotometrze UV/VIS Cary 1 (Varian) przy dlugosci fali swietlnej 340 nm. z n a c z a n i e s i d e r o f o r u h y d rok s a m o w e g o. Siderofor hydroksamowy oznaczano ilosciowo metoda Emery'ego i Neilandsa (9) w niezageszczonych i zageszczonych plynach znad osadu hodowli. Pomiary spektrofotometryczne

Nr1 Siderofory enterokoków 31 przeprowadzano w spektrofotometrze UV/VIS Cary 1 (Varian) przy dlugosci fali swietlnej 264 nm. Stezenie sideroforu wyrazano w p,/ml metanosulfonianu desferrioksaminy B (Ciba-Geigy) na mi plynu znad osadu hodowli. W y kor z y s t Y w a n i e z ród e lze l a z a. Badanie to przeprowadzono metoda krazkowo-dyfuzyjna wg Drechsela i wsp. (8). Do 20 mi roztopionej pozywki zawierajacej odpowiednie stezenie o-fenantroliny dodawano 0,1 mi zawiesiny badanego szczepu o gestosci optycznej odpowiadajacej Nr 5 skali McFarlanda (Difco) i zawierajacej 1,5 x 108cfu/m1. Pozywke wylewano na plytki Petriego o 014 cm i po zastygnieciu agaru na jego powierzchni ukladano krazki bibuly Whatman Nr 3 o 06 mm i nasaczano je 5 p,l roztworu kompleksu zelaza lub roztworów kontrolnych zawierajacych 25 p,gzelaza. Plytki preinkubowano w temperaturze pokojowej przez 30 min, a nastepnie w temperaturze 37 C odczytujac wyniki w postaci wielkosci stref wzrostu po 24 i 48 godzinach. o-fenantrolina zawarta w pozywce wiazala zelazo hamujac wzrost. Zdolnosc odwracania hamowania wyrazala sie wzrostem wokól krazka ze zródlem zelaza. Wielkosc stymulacji wzrostu okreslal rozmiar jego stref. M e t o d y a n a l i t Yc z n e. Zawartosc zelaza w pozywkach oznaczano metoda Gadia i Mehra (12) przy uzyciu ferrozyny (Sigma). Pomiarów spektrofotometrycznych dokonywano w kolorymetrze spektralnym Spekol (Zeiss) przy dlugosci fali swietlnej 526 nm. MIC o-fenantroliny dla badanych szczepów enterokoków oznaczano na podlozu Mueller-Hintona 2 (biomerieux) zawierajacym podwójnie malejace stezenia o-fenantroliny zgodnie z zaleceniami NCCLS (22). P o bi e r a n i e p r z e z k o mór k i s9fe (III) w k o m p l e k s i e z d i- c Y t r y n i a n e m. Komórki zebrane z pozywek Fe+, Fe- (Chelex) i Fe- (fenantrolina) wirowano (3000 x g, 5 min., 4 C) i trzykrotnie przemywano zimnym buforowanym fosforanami 0,85% NaCI (Biomed), a nastepnie zawieszano w pozywce Fe- (Chelex) nie zawierajacej jonów magnezu i wapnia do gestosci optycznej wzorca Nr 2 skali McFarlanda, odpowiadajacej 6x109CFU/m1. Do 1 mi tej zawiesiny (zawierajacej okolo 4 mg suchej masy bakterii) dodawano 3 p,l roztworu s9fe-dicytrynianu (1:200) co odpowiadalo 213,15 nmola s9fe(iii) na mg suchej masy bakterii. Zawiesine inkubowano w temp. 37 C przez 30 min. Po 10, 20, 30 minutach inkubacji pobierano 100 p,l próbki, które wirowano (3000 x g, 15 min., 4 C) pluczac trzykrotnie buforowanym fosforanami 0,85% NaCI (Biomed). Radioaktywnosc zebranych komórek mierzono w gamma kamerze Wallac 1470 Wizard. Wyniki przedstawiano jako nanomole pobranego zelaza na miligram suchej masy bakterii. O b l i c z e n i a s t a t y s t Y c z n e. Analize statystyczna wyników przeprowadzono poslugujac sie programem komputerowym Statistica PL firmy Statsoft. Zastosowano nieparametryczny test U Manna-Whitneya. WYNIKI Badane szczepy enterokoków nalezaly do 16 gatunków: E. faecalis (45 szczepów), E.faecium (10 szczepów) oraz po jednym szczepie gatunków E. avium, E. casseli.flavus, E. cecorum, E. dispar, E. durans, E. gallinarum, E. hirae, E. malodoratus, E. mundtii, E. pseudoavium, E. raffinosus, E. saccharolyticus, E. so-

32 P. Lisiecki, J. Mikucki Nrl litarius i E. sulfureus. Najliczniejsza byla grupa enterokoków izolowanych z materialu klinicznego - 60 szczepów. Od zwierzat pochodzilo 5 szczepów, ze srodowiska 3 szczepy, a z zywnosci 2 szczepy. Wszystkie szczepy wytwarzaly siderofor hydroksamowy. Plyny znad osadu hodowli w pozywce Fe- (Chelex) zawieraly go w róznym w stezeniu: od 10,4 p.g/ml (E. malodoratus z zywnosci) do 4,3 p.g/ml (E. faecalis z materialu klinicznego). Najliczniejsza grupe - 45,4% szczepów stanowily enterokoki wytwarzajace od 21 do 30 p.g/ml sideroforu, a druga z kolei liczna grupa - 34,3% wytwarzala ponad 30 p.g/ml sideroforu. Kwas cytrynowy w pozywce Fe- (Chelex) zostal wykryty w plynach znad osadu hodowli u 61,4% badanych szczepów. Nie zawierala go pozywka jalowa. Uwalnialy go wszystkie szczepy pochodzace z zywnosci, srodowiska i od zwierzat ale tylko 55% licznej grupy szczepów izolowanych z materialu klinicznego. Najwieksza jednak ilosc kwasu cytrynowego wykryto u szczepów pochodzacych ze srodowiska - srednio 8,4 p.g/ml, mniejsze ilosci - 4,9 p.g/ml u szczepów zwierzecych, 4,7 p.g/ml u szczepów izolowanych z zywnosci, a najmniejsze - 3,1 p.g/ml u szczepów klinicznych. Porównanie ilosci uwalnianego kwasu cytrynowego przez szczepy kliniczne - 3,1 p.g/ml i wszystkie pozostale wytwarzajace srednio 6,1 p.g/ml tego metabolitu wykazalo, ze róznice sa statystycznie znamienne (p<0,05). Kwas cytrynowy wystepowal czesciej w hodowlach E. faecium (72,7%) i w wiekszych ilosciach - 4,3 p.g/ml, gdy wsród szczepów E. faecalis (46,7 %) w ilosciach 1,9 p.g/ml i róznice te byly statystycznie znamienne (p<0,05). Grupa szczepów nalezacych do innych gatunków uwalniala znamiennie wieksze ilosci kwasu cytrynowego niz E. faecalis, srednio 5,9 p.g/ml (p<0,05). Porównanie ilosci uwolnionego kwasu cytrynowego przez szczepy E. faecium i inne, poza E. faecalis nie ujawnilo róznic. Analiza jednoczesnego wytwarzania przez enterokoki sideroforu hydroksamowego i uwalniania kwasu cytrynowego mogla wskazywac na wystepowanie pewnych korelacji. W grupie szczepów uwalniajacych do pozywki najwieksze ilosci kwasu cytrynowego, ponad 5,0 p.g/ml, wystepowalo 46,7% szczepów wytwarzajacych najmniejsze ilosci sideroforu hydroksamowego - ponizej 20 p.g/m1. Z drugiej strony grupe enterokoków nie uwalniajacych do pozywki kwasu cytrynowego tylko w 7 % tworzyly szczepy wytwarzajace mniej niz 20 p.g/ml sideroforu hydroksamowego, a az 59 % szczepów wytwarzajacych ponad 20 do 30 p.g/m1. Dane te mogly nasuwac przypuszczenie, ze jezeli kwas cytrynowy jest wykorzystywany jako siderofor to dwa te systemy poboru zelaza, moglyby w warunkach jego niedoboru uzupelniac sie lub zastepowac. Opracowanie statystyczne tych wyników nie potwierdzilo jednak istnienia jakiejkolwiek korelacji miedzy tymi zjawiskami (p>0,05). W dalszych badaniach oceniano zdolnosc stymulacji wzrostu przez kompleks zelaza (Fe3+) z dicytrynianem. Uzyto w tych badaniach równiez trzech powiazanych z cytrynianem posrednich metabolitów cyklu kwasów trójkarboksylowych: kwasu pirogronowego, kwasu szczawiooctowego i kwasu a-ketoglutarowego (Tabela I). Wstepnie sprawdzono mozliwosc przywracania wzrostu hamowanego przez o-fenantroline wiazaca w pozywce zelazo. Jako kontroli uzyto nieorganicznych zwiazków zelaza - siarczanu zelazawego [Fe (II)] i siarczanu zelazowo-amonowego

Z '"I... Tabela L Wzrost enterokoków w obecnosci kompleksów zelaza z kwasami dwu i trójkarboksylowymi oraz sideroforami hydroksamowymi i fenolanowo-katecholowymi Szczepy bakteryjne Zródla zelaza E. faecalis E. faecium BD122 BD123 BD160 449 60S BY1 BY6 BY 13 BY 49 - Fe3+-dicytrynian + + + + + + + + + Fe3+-pirogronian ++ + + ++ ++ ++ ++ + + <I) Fe3+-szczawiooctan +++ ++ ++ ++ 'N + + + + - >- Fe3+-ketoglutaran (+) (+) - + - (+) + + - <I.) <I) Ferrioksamina B + + + + + + (+) + (+) Co Fe3+-rodotorulowykwas + + + ++ ++ + + + (+) S Fe3+-dihydroksybenzoesowy kwas + + +++ ++ + + + ++ + Siarczan zelazawy ++ + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ <I) ō Siarczanzelazowo- '"' '= amonowy + + + + + + + + + Cytrynian zelazowoamonowy ++ ++ ++ +++ ++ ++ ++ +++ ++ rn... Co (1) a 8- ~ (1) ::; (1) a:o;- o :o;- o- :;; -, brak wzrostu; (+), slaby wzrost; +, strefa wzrostu 10-15 mm; ++, strefa wzrostu 16-20 mm; +++, strefa wzrostu 21-30 mm en en

34 P. Lisiecki, J. Mikucki Nr1 [Fe (III)] i zwiazku organicznego - cytrynianu zelazowo-amonowego[fe (III)]. Dla kontroli wykorzystano równiez kompleksy zelaza [Fe (III)] z sideroforami hydroksamowymi - ferrioksamina B i kwasem rodotorulowym oraz sideroforem fenolanowo-katecholowym - kwasem 2,3-dihydroksybenzoesowym. Wszystkie szczepy wykorzystywaly dla wzrostu zwiazki zelaza w postaci jonów zelazawych i zelazowych (Tabela I). Najsilniej promowal wzrost organiczny zwiazek zelaza - cytrynian zelazowo-amonowy. Oznaczalo to, ze enterokoki wymagaja do wzrostu zelaza, które potrafia pobierac w tych warunkach doswiadczalnych. Maja równiez zdolnosc przyswajania zelaza z jego kompleksów z sideroforami gdyz przywracaly one wzrost wszystkich szczepów, ale w róznym stopniu. Wlasciwa próba pobierania zelaza z jego kompleksów z kwasami dwu- i trój karboksylowymi wykazala, ze tylko 9 z 70 szczepów mialo zdolnosc przyswajania takiego zelaza (Tabela I). Bylo to S szczepów E. faecalis oraz 4 szczepy E. faecium, wszystkie izolowane z materialu klinicznego. Nie wszystkie jednak kompleksy przywracaly wzrost wszystkich szczepów. Najefektywniej promowaly go kompleksy Fe3+-dicytrynian i Fe3+-pirogronian. Kompleks Fe3+-szczawiooctan ogólnie slabo stymulujacy wzrost nie przywracal go u jednego szczepu - E.faecalis 60S.Najslabiej dzialal kompleks Fe3+-ketoglutaran nie stymulujacy ponadto wzrostu trzech szczepów: E. faecalis 160 i 60S oraz E. faecium BY 49. Zbadano nastepnie wplyw zawartosci zelaza w pozywce na uwalnianie do pozywki kwasu cytrynowego przez 9 wyselekcjonowanych szczepów (Tabela II). Porównano stezenie kwasu cytrynowego w pozywce z nadmiarem zelaza (Fe +) oraz z jego niedoborem, mniejszym na pozywce Fe- (Chelex) i wiekszym na pozywce Fe- (fenantrolina). W pozywce Fe+ z nadmiarem zelaza, metabolit ten zostal wykryty zarówno u szczepów E. faecalis jak i E. faecium. Jego srednie stezenia dla wszystkich szczepów wynosilo 3,29 Mg/mIi bylo takie same jak u poszczególnych gatunków, odpowiednio 3,22 i 3,38 Mg/mI. W pozywce Fe+ intensywniej rosly szczepy E. faecalis. Tabela II. Kwas cytrynowy w hodowlach enterokoków w pozywce Z nadmiarem (Fe +) i niedoborem (Fe -) zelaza. Pozywka Fe + Pozywka Fe - Chelex 100 o-fenantrolina Szczep Wzrost* Kwas Wzrost Kwas Wzrost Kwas cfu/ml cytrynowy cfu/ml cytrynowy cfu/ml cytrynowy j.lmol!ml j.lmol/ml j.lmol!ml E. faecalis BD 122 156 x10' 2,56 87 x10' 2,56 61 x10' O E. faecalis BD 123 545 x10' 3,40 540 x10' 1,97 266 x10' O E. faecalis BD 160 78 x10' 3,26 51 x10' O 71 x10' O E. faecalis 449 126 x10' 3,40 126 x10' 2,89 102 x10' O E. faecalis 605 233 x10' 3,52 173 x10' 3,55 134 x10' O E. faecium BY 1 8,2x10' 3,39 7,4 x10' 4,90 0,63 x10' 1,54 E. faecium BY 6 4,1 x10' 3,62 4,43 x10' 3,62 0,36 x10' 1,81 E. faecium BY 13 3,68 x10' 3,27 1,96 x10' 3,91 0,77 x10' 1,67 E. faecium BY 49 19,6 x10' 3,00 18,4 x10' 2,23 6,6 x10' 1,96 * ) cfu - colony forming units

ri I Nr1 Siderofory enterokoków 35 W pozywce Fe- (Chelex) srednie stezenie kwasu cytrynowego wynosilo 3,2 p,g/ml bylo wiec takie jak w pozywce Fe+ i róznice nie byly tu statystycznie znamienne (p>0,05). Ilosci uwalnianego kwasu cytrynowego byly rózne: u szczepów E. faecalis - 2,74 p,g/ml i E. feacium - 3,66 p,g/ml. Wzrost szczepów E. faecalis w pozywce Fe- (Chelex) byl w porównaniu z pozywka Fe+ hamowany (z wyjatkiem szczepu BD 123 i 449), a szczepy z gatunku E. faecium rosly z podobna intensywnoscia w obu pozywkach (z wyjatkiem szczepu BY 13). W pozywce Fe- (fenantrolina), szczepy E. faecalis nie uwalnialy podczas wzrostu kwasu cytrynowego, a szczepy E. faecium ilosci znacznie mniejsze -1,74 p,g/ml niz w pozywce Fe+. Róznice te byly statystycznie znamienne (p<0,05). Porównanie wydzielania kwasu cytrynowego w warunkach niedoboru zelaza w pozywce Fe- (Chelex) - 3,66 p,g/ml i pozywce Fe- (fenantrolina) -1,74 p,g/ml wykazalo istotnosc róznic (p<0,05). Wzrost szczepów E. faecium w pozywce Fe- (fenantrolina) byl bardzo silnie hamowany a jego intensywnosc stanowila od 7,7% do 20,9% intensywnosci wzrostu w pozywce Fe+. Tabela III. Pobieranie przez szczep E. faecalis 449 zelaza S9Fe(III) skompleksowanego z dicytrynianem Pozywka Fe+ Pozywka Fe- (Chelex) PozywkaFe-(fenantrolina) t (min) % dawki s9fe3+-dicvtrvnian nm x mg1* % dawki nm x mg1 % dawki nm x mg1 poczatkowej poczatkowej poczatkowej 10 8,74 4,10 3,48 1,63 18,02 8,45 20 14,73 6,90 12,18 5,71 26,68 12,51 30 20,82 9,76 14,51 6,80 34,67 16,26 *) mg suchej masy bakterii Tabela IV. Pobieranie przez szczep E. faecium BY 1 zelaza S9Fe(III) skompleksowanego z dicytrynianem Pozywka Fe+ Pozywka Fe- (Chelex) PozywkaFe-(fenantrolina) t (min) % dawki S9Fe3+-dicvtrvnian nm x mg1* % dawki nm x mg1 % dawki nm x mg1 poczatkowej poczatkowej poczatkowej 10 2,78 1,3 1,58 0,74 4,59 2,15 20 5,46 2,55 1,54 0,72 9,7 4,55 30 2,47 1,15 247 1,15 8,68 4,07 *) mg suchej masy bakterii Na modelu szczepów E. faecalis 449 i E. faecium BY1 zbadano wplyw zawartosci zelaza w srodowisku wzrostu na kinetyke pobierania do komórki kompleksu S9Fe3+-dicytrynian (Tabela III, IV Ryc. 1,2). Oba szczepy wykorzystywaly ten kompleks dla promocji wzrostu w biotestach (Tabela I). Uzyto komórek spoczynkowych zebranych z trzech pozywek: Fe+ z nadmiarem zelaza, i dwóch z niedoborem tego pierwiastka - Fe- (Chelex) i Fe- (fenantrolina). Ograniczanie dostepu do zelaza wiazalo sie u obu szczepów z aktywniejszym przyswajaniem dicytrynianu.

36 P. Lisiecki, J. Mikucki Nrl Najwyrazniej zaznaczylo sie to u komórek zebranych z hodowli na pozywce Fe- (fenantrolina), w której niedobór zelaza bylo wiekszy niz w pozywce Fe- (Chelex). Szczep E. faecalis 449 wiazal po 30 minutach 34, 67% poczatkowej dawki izotopu zelaza, a wiec prawie dwukrotnie wiecej niz po hodowli na pozywce Fe+, z nadmiarem zelaza (Tabela III, Ryc. 1). Podobnie, szczep E. faecium BY 1 po 30 minutach wiazal 8,68% dawki poczatkowej izotopu, prawie czterokrotnie wiecej niz po hodowli w pozywce Fe+ (Tabela IV, Ryc. 2)..;- 20 aj E 15 >< ::E.E-.f 10 m.. '0.Q 5 :. O -.- pozywka Fe+ _ O 10 20 30 40 czas(mln) pozywka Fe- (Chelex) -*- pozywka Fe- ( fenantrolina) Ryc.l. Pobieranie przez szczep E. faecalis 449 zelaza S9Fe(III)skompleksowanego z dicytrynianem -- 10.. ȧj E 8 >< ::E 6.Elli l&. 4 m.. -o.q 2 o G- O O 10 20 30 40 czas (mln) -.- pozywka Fe+_ pozywka Fe- (Chelex)-*- pozywka Fe- (fenantrolina) Ryc. 2. Pobieranie przez szczep E. faecium BY 1 zelaza S9Fe(III)skompleksowanego z dicytrynianem

1 Nr1 Siderofory enterokoków 37 DYSKUSJA Enterokoki zaliczane sa do grupy bakterii mlekowych. Sa homofermentatywne. W warunkach beztlenowych dominujacym produktem glikolizy w cyklu Embdena- -Meyerhoffa-Parnasa jest w warunkach beztlenowych mleczan powstajacy z pirogronianu przy udziale dehydrogenazy mleczanowej. U E. faecalis czynny jest jednoczesnie, dominujac w warunkach tlenowych lub przy limitowaniu w pozywce glukozy, kompleks dehydrogenazy pirogronianu prowadzacy do przeksztalcania pirogronianu w octan (5). Badane szczepy enterokoków rosly w hodowlach stacjonarnych ale aktywnie wytrzasanych, a wiec w warunkach tlenowych, a pozywka zawierala 10 mm glukozy. Powstajacy w tych warunkach acetylo-coa jest wiazany z cyklem kwasów trój karboksylowych, przeksztalcany pod dzialaniem szczawiooctanu w cytrynian, z którego w dalszych przemianach powstaje a-ketoglutaran bedacy dopelnieniem cyklu kwasów trójkarboksylowych niepelnego u enterokoków (30). Tak wiec w toku tych przemian w komórkach enterokoków powstaje pirogronian, cytrynian i a-ketoglutaran, a szczawiooctan stanowi ogniwo wiazace przemiany tych kwasów karboksylowych. Dlatego badajac zdolnosc a-ketokwasów do dostarczania, dzieki wlasciwosciom kompleksotwórczym, zelaza enterokokom wykorzystano te cztery posrednie metabolity kwasów trójkarboksylowych. Tylko 9 klinicznych szczepów enterokoków miala zdolnosc wykorzystywania zelaza z jego kompleksów z dicytrynianem, pirogronianem, szczawiooctanem i a-ketoglutaranem przy czym najaktywniejszym kompleksem byl Fe3+-pirogronian, a Fe3+-szczawiooctan tylko dla szczepów E. faecalis. W porównaniu z innymi bakteriami mlekowymi dane dotyczace metabolizmu cytrynianu u rodzaju Enterococcus sa ograniczone (6,11,32). Wynika z nich, ze kwas cytrynowy jako jedyne zródlo wegla nie podtrzymywal wzrostu enterokoków (4). Dzis wiadomo, ze E. faecalis i E. faecium moga nie tylko fermentowac cytrynian w obecnosci kosubstratu w postaci laktozy przeksztalcajac te substraty odpowiednio w octan i mrówczan oraz mleczan ale i rosnac w obecnosci kwasu cytrynowego jako jedynego zródla wegla wytwarzajac octan i mrówczan (30). Cytryllian moze u enterokoków odgrywac role substratu energetycznego. Energia jest wtórnie tworzona na drodze przeksztalcenia acetylo-coa w octan z wytworzeniem dwóch czasteczek ATP (30). Pozyskiwanie zelaza przy uzyciu dostarczajacego je egzogennego cytrynianu zostalo udowodnione u E. coli (24,27), Mycobacterium smegmatis (23), Neisseria meningitidis (2), Pseudomonas aeruginosa (7), Listeria monocytogenes (1) i Vibrio anguillarum (21). Mechanizmy wykorzystywania cytrynianu jako nosnika zelaza sa rózne u róznych bakterii. Jako nosnik zelaza cytrynian moze dzialac niezaleznie lub w zwiazku z innymi mechanizmami poboru zelaza. Wzrost V. anguillarum i P. aeruginosa w obecnosci cytrynianu zelaza jako jego jedynego zródla hamowal wy_ twarzanie sideroforów (14,21). Podobne zjawisko zaobserwowano u czesci badanych szczepów nieznamienne. enterokoków. Okazalo sie jednak, ze bylo ono statystycznie System poboru zelaza za pomoca cytrynianu moze miec charakter konstytutywny, nie indukowany obecnoscia lub stezeniem zelaza czy cytrynianu w pozywce. U Mycobacterium smegmatis (23) i Rhodopseudomonas spheroides (25)

38 P. Lisiecki, J. Mikucki Nr1 obecnosc zelaza w pozywce nie hamowala poboru cytrynianu zelaza ale u E. coli (24,27), P. aeruginosa (14) i Bradyrhizobiumjaponicum (13) jest on w takich warunkach silnie hamowany. Obecnosc cytrynianu w pozywce jest warunkiem indukcji systemu poboru zelaza u E. coli (24,27), Mycobacterium smegmatis (23), V. anguillarum (21) czy B. japonicum (13). System ten wystepuje u E. coli nawet jesli cytrynian nie jest wykorzystywany jako jedyne zródlo wegla (27). Paleczki z rodzaju Salmonella natomiast, które wykorzystuja cytrynian jako jedyne zródlo wegla nie moga poslugiwac sie nim jako nosnikiem zelaza (27). Nie wszystkie systemy poboru cytrynianu zelaza wymagaja dostarczenia energii. Jest ona konieczna dla pobierania cytrynianu zelaza przez B. japonicum (13), P. aeruginosa (14) i E. coli (27) a nie wymaga jej Mycobacterium smegmatis (23). Koszty energetyczne tego systemu poboru zelaza sa znacznie nizsze niz jakiegokolwiek systemu sideroforów. Niskie jednak powinowactwo cytrynianu do zelaza sprawia, ze system ten moze w odróznieniu od sideroforów, dzialac w srodowiskach z wyzsza zawartoscia zelaza. Zwiekszone wytwarzanie a-ketokwasów w hodowlach, w których wzrost byl hamowany niedoborem zelaza opisano u E. coli (31,28), Pasteurella sp. (10,31) oraz mikrokoków i koagulazo-ujemnych gronkowców (16). Podobnie zachowuje sie S. Typhimurium, u którego dominujacym wydzielanym a-ketokwasem byl kwas pirogronowy pojawiajacy sie w warunkach silnie hamujacego wzrost niedoboru zelaza (29). a-ketokwasy i inne metabolity posrednie cyklu kwasów trój karboksylowych sa prawdopodobnie wydzielane w kazdych warunkach hodowli jesli hamowany jest wzrost metabolicznie aktywnych komórek. Niedobór zelaza w pozywce Fe- (Che lex) nie wplywal na zwiekszenie ilosci kwasu cytrynianu uwalnianego przez enterokoki. Poglebienie tego niedoboru w pozywce Fe- (fenantrolina) hamowalo uwalnianie kwasu cytrynowego u szczepów E. faecalis i znacznie zmniejszalo u szczepów E. faecium. o-fenantrolina jest silnym chelatorem majacym nawet zdolnosc do wnikania do komórek i wiazania endogennego zelaza (17). Wiadomo, ze brak zelaza w pozywce hamuje synteze i uwalnianie sideroforów na skutek zahamowania wzrostu (24,27). Sklania to do pogladu, ze synteza i uwalnianie kwasu cytrynowego podczas wzrostu enterokoków nie jest procesem celowanym dostarczajacym komórce chelatora zelaza. Proces ten nie jest poddawany negatywnej derepresji jak to ma miejsce u Bradyrhizobium japonicum (13). Nie wymaga tez obecnosci zelaza jako induktora. Oznaczaloby to, ze kwas cytrynowy nie odgrywa u enterokoków roli sideroforu. Ograniczanie dostepu do zelaza hamowalo w roznym stopniu wzrost. Pojawienie sie w tych warunkach kwasu cytrynowego w hodowlach moglo byc przejawem rozszczelnienia oslon komórkowych w niedogodnym otoczeniu srodowiska [szczepy E. faecalis w pozywce Fe- (Chelex)] i/lub kontynuowania aktywnosci metabolicznej przy zahamowanym wzroscie [szczepy E. faecium w pozywce Fe- (fenantrolina)]. W pozywce Fe- (fenantrolina) wzrost szczepów E. faecalis byl umiarkowanie hamowany. Nie uwalnialy one jednak kwasu cytrynowego. Moglo to byc spowodowane zwolnieniem wzrostu wczesniej zapoczatkowanego kosztem endogennych rezerw zelaza i wyczerpaniem ich co prowadzilo do wstrzymania aktywnosci metabolicznej. Kwas cytrynowy bylby zatem tylko wydalanym z komórki pierwotnym metabolitem posrednim cyklu kwasów trójkarboksylowych.

n Nrl Siderofory enterokoków 39 Pobieranie przez spoczynkowe komórki szczepów E. faecalis 449 i E. faecium BY 1 zelaza s9fe(iii) w kompleksie z dicytrynianem potwierdza wyniki biotestów dowodzace, ze kompleks ten stymuluje ich wzrost. Zelazo jest wiec pobierane do komórki. Szybkosc pobierania s9fe(iii) zalezy od stanu komórkowych rezerw zelaza: naj aktywniej bylo ono przyswajane przez glodzone komórki hodowane w obecnosci o-fenantroliny, u których oczekiwac mozna bylo maksymalnego wyczerpania endogennego zelaza. Doswiadczenie to nie wyjasnia mechanizmu wprowadzania zelaza do komórki enterokoków. Konieczna jest identyfikacja enterokokowego receptora dla tego kompleksu i udowodnienia udzialu energii w transporcie. Autorzy pracy skladaja podziekowania pani prof. dr hab. Walerii Hryniewicz za udostepnienie do badan szczepów enterokoków. P. L i s i e c k i, J. M i k u c k i CITRIC ACID AS A SIDEROPHORE OF ENTEROCOCCI? Summary In the poci of70 enterococai strains ofthe genus Enterococcus 61,4% reieased citrate into the medium. This metabolite has occurred more frequentiy in E. faecium strains. There was no correiation between hydroxamate siderophores production and citrate reieasing. Only nine (lo, 3%) of 70 strains have used Fe3+-dicitrate compiex as iron sources. Iron restricted condition causing moderate inhibition of growth have not increased citrate reieasing. When iron deficiency has caused stronger growth inhibition, E. faecalis strains did not reiease citrate and E. faecium strains its sma1ler amounts. The resting cells grown in iron-restricted condition have incorporated 59Fe3+compIexed by citrate more active than cells grown in the medium with excess of iron. So, citrate has not been a siderophore in enterococci. PISMIENNICTWO l. Adams TJ, Vartivarian S, Cowart R E. Iron acquisition system of Listeria monocytogenes. Infect Immun 1990;58: 2715-8. 2. Archibald RS, De Voe IW. Iron acquisition by Neisseria meningitides. Infect Immun 1980; 27: 322-34. 3. Bandell M, Lhotte ME, Marty-Teysset C i inni. Mechanism of citrate transporters in carbohydrate and citrate cometabolism in Lactococcus and Leuconostoc species. App Environ MicrobioI1998; 64: 1594-600. 4. Cogan TM. Constitutive nature of the enzymes of citrate metabolism in Streptococcus lactis subsp. diacetyiactis. J Dairy Res 1981;48: 489-95. 5. Condon S. Responses of Iactic acid bacteria to oxygen. FEMS MicrobioI Rev 1987; 46:269-80. 6. Coventry MJ, Hillier AJ, lago GR. The metaboiism of pyruvate and citrate in the thermoduric cheese starter Streptococcusfaecium. Aust. J Dairy TechnoI1978; 33: 148-54. 7. Cox CD. Iron uptake from ferripyochelin and ferric citrate by Pseudomonas aeruginosa. J BacterioI1980; 142: 581-7. 8. Drechsel H, Thieken A, Reissbrodt R i inni. a-keto acids are novei siderophores in the genera Proteus, Providencia, and Morganella and are produced by amino acid deaminases. J BacterioI1993; 175: 2727-33.

40 P. Lisiecki, J. Mikucki Nr1 9. Emery TF, Neilands J B. Further observations concerning the periodic acid oxidation of hydroxylamine derivatives. J Org Chem 1962; 27: 1075-7. 10. Flossman KD, Feist H, Erler W. Enprodukte der glucose-fermentation von Pasteurella multocida und P. haemolytica. Z Allg Mikrobiol1976; 16: 259-62. 11. Freitas AC, Pintado AE, Pintado ME i inni. Organic acids produced by lactobacilli, enterococci and yeast isolated from Picante cheese. Eur Food Res Technol1999; 209: 434-8. 12. Gadia MK, Mehra MC. Rapid spectrophotometric analysis of total and ionic iron in the /Lgrange. Microchemica Acta (Wien) 1977; 11: 413-8. 13. Guerinot ML, Meidl EJ, Plessner O. Citrate as a siderophores in Bradyrhizobiumjaponicum. J Bacteriol1990; 172: 3298-203. 14. Harding RA, Royt PW. Acquisition of iron from citrate by Pseudomonas aeruginosa. J Gen Microbiol1990; 136: 1859-67. 15. Hayashi T, Tsuchiya H, Todoriki H i inni. High-performance liquid chromatographic determination of a-keto acids in human urine and plasma. Anal Biochem 1982; 122: 173-9. 16. Heuck D, Beer W;Reissbrotd R. Iron supply of staphylococci and micrococci by a-keto-/ a-hydroxyacids. FEMS Microbiol Lett 1996; 43: 26-32. 17. Heuck D, Witte W;Braulke C i inni. Susceptibility of desferrioxamine and other chelators of coagulase-negative staphylococci. Zbl Bakteriol1994; 280: 304-11. 18. Hugenholtz 12:165-78. J. Citrate metabolism in lactic acid bacteria. FEMS Microbiol Rev 1993; 19. Kennes C, Dubourguier HC, Abagnac G i inni. Citrate metabolism by Lactobacillus plantarum isolated from orange juice. J Appl Bacteriol1991; 70: 380-4. 20. Lisiecki P, Wysocki P, Mikucki J. Occurrence of siderophores in enterococci. Zbl Bakterio11999; 289: 807-15. 21. Mazoy R, Botana LM, Lemos ML. Iron uptake from ferric citrate by Vibrio anguillarum. FEMS Microbiol Lett 1997; 154: 145-50. 22. National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS), Methods of dilution antimicrobial susceptibility test for bacteria that grow aerobically, Fourth edition, Document M7-A6, 1997. 23. Messenger AJM, Ratledge C. Iron transport in Mycobacterium smegmatis: uptake of iron from ferric citrate. J Bacteriol1982; 149: 131-5. 24. Mikucki J, Lisiecki P. Siderofory-agresyny bakterii. Post Mikrobiol1998; 37, 1: 73-97. 25. Moody MD, Dailey HA. Siderophores utilization and iron uptake by Rhodopseudomonas spheroids. Arch Biochem Biophys 1984; 234: 178-86. 26. MuTry BE. The life and times of the enterococci. Clin Microbiol Rev 1990; 3: 46-65. 27. Ratledge C, Dover L. G. Iron metabolism in pathogenic bacteria. Ann Rev Microbiol 2000; 54, 881-941. 28. Raunio R. Accumulation of keto acids during the growth cycle of E. coli. Acta Chem Scal'\d 1966; 20: 11-16. 29. Reissbrotd R, Kingsley R, Rabsch W i inni. Iron-regulated excretion of a-ketoacids by Salmonella typhimurium. J Bacteriol1997; 179: 4538-44. 30. Sarantinopoulos P, Kalantzopoulos G, Tskalidou E. Citrate metabolism by Enterococcus faecalis FAIR-E 229. Appl Environ Microbiol2001; 67: 5482-7. 31. Stevenson P, Griffiths. Growth of E. coli underiron-restricted condition. W: The virulence of E. coli. Red. M. Sussman, Academic Press, Inc., New York, 1985, 413-47. 32. Urdaneta D, Rafie G, Ferrer B i inni. Short-chain organic acids produced on glucose, la c- tose and citrate media by Enterococcus faecalis, Lactobacillus casei and Enterobacter aerogenes strains. Bioresource Technol1995; 54: 99-103. Otrzymano: 4 X 2003 r. Adres Autora: 90-235 Lódz, ul. Pomorska 137, Zaklad Mikrobiologii Farmaceutycznej Uniwersytetu Medycznego w Lodzi. e-mail: plisiecki@pharm.am.lodz.pl