ANTAGONISTYCZNE DZIAŁANIE BAKTERII ZAWARTYCH W PREPARATACH PROBIOTYCZNYCH W ODNIESIENIU DO S. ENTERITIDIS I ENTEROPATOGENNYCH SZCZEPÓW E.

Transkrypt

1 Acta Sci. Pol., Medicina Veterinaria 5(2) 2006, ANTAGONISTYCZNE DZIAŁANIE BAKTERII ZAWARTYCH W PREPARATACH PROBIOTYCZNYCH W ODNIESIENIU DO S. ENTERITIDIS I ENTEROPATOGENNYCH SZCZEPÓW E. COLI 1 Michał Bednarski, Maciej Kuczkowski Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu Streszczenie. Probiotyki pełnią istotną rolę jako bariera ochronna hamująca rozwój bakterii patogennych. Znajdują równieŝ zastosowanie w leczeniu zakaŝeń przewodu pokarmowego ludzi i zwierząt. Najczęściej w skład preparatów probiotycznych wchodzą bakterie kwasu mlekowego. WaŜną cechą probiotyków jest ich działanie przeciwbakteryjne. Mechanizm działania bakterii kwasu mlekowego jest złoŝony. U podstaw ich działania stoi produkcja wielu substancji antagonistycznych, w tym metabolitów, substancji antybiotykopodobnych oraz białek zwanych bakteriocynami. Celem autorów niniejszej pracy było sprawdzenie działania wybranych preparatów probiotycznych wobec izolowanych od drobiu pałeczek Salmonella Enteritidis oraz enteropatogennych szczepów E. coli. Słowa klucze: antagonizm, bakterie kwasu mlekowego, bakterie patogenne, E. coli, probiotyki, Salmonella Enteritidis W ostatnich latach probiotyki są szeroko propagowane, jako środki lecznicze lub wspomagające leczenie. Bakterie w nich zawarte dzięki swoim cechom, takim jak: zdolność przylegania do komórek nabłonka, kolonizacja jelit (lub innych narządów), szerokie spektrum działania przeciw mikrobiologicznemu są uwaŝane za naturalną barierę dla patogennych mikroorganizmów. Posiadają przy tym wiele innych cech, które są poŝądane ze względów dietetyczno-ŝywieniowych (lepsze trawienie i optymalne wykorzystanie składników pokarmowych). W skład preparatów probiotycznych wchodzą najczęściej bakterie kwasu mlekowego, które są jednym ze składników naturalnej flory przewodu pokarmowego ludzi i zwierząt. Preparaty probiotyczne powinny cechować się wieloma właściwościami, w tym silnymi mechanizmami antagonistycznymi wobec bakterii patogennych. Mechanizmy te są bardzo złoŝone i nie do końca poznane. U podstaw skutecznego działania bakterii antagonistycznych stoi konkurencja Adres do korespondencji Corresponding author: Michał Bednarski, Katedra Epizootiologii i Administracji Weterynaryjnej z Kliniką, Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu, pl. Grunwaldzki 45, Wrocław, mbed@ozi.ar.wroc.pl

2 84 M. Bednarski, M. Kuczkowski o składniki pokarmowe oraz współzawodnictwo w zasiedlaniu nabłonka jelit w stosunku do patogennych gatunków bakterii i grzybów np.: Salmonella sp., Vibrio sp., E. coli czy Candidia sp.. Najlepszymi zdolnościami zasiedlania nabłonka jelit danego gatunku zwierząt charakteryzują się szczepy bakterii probiotycznych wyizolowane od tego gatunku zwierząt. Pałeczki kwasu mlekowego i gatunki pokrewne produkują w duŝych ilościach metabolity, które w sposób niespecyficzny hamują wzrost patogennej mikroflory. Do takich związków naleŝą metabolity rozkładu cukrów prostych, takie jak: kwas mlekowy, octowy i propionowy, które powodują zakwaszenie środowiska, a takŝe aldehydy, diacetyl czy nadtlenek wodoru. Niektóre szczepy, co jest cechą szczególnie poŝądaną u bakterii wchodzących w skład preparatów probiotycznych, posiadają zdolność produkcji substancji antybakteryjnych i bakteriocyn. Substancje te wykazują efekt hamujący lub nawet bójczy wobec bakterii patogennych [Kot 2000, Lewus 1991, Mikołajczyk 2002, Prost 1999, Usajewicz 1999]. Do badań nad skutecznością działania bakterii antagonistycznych na florę patogenną wykorzystywane są metody zarówno w warunkach in vivo, jak teŝ in vitro. W badaniach nad siłą działania substancji antybakteryjnych produkowanych przez róŝne szczepy bakterii wykorzystuje się głównie metody hodowli laboratoryjnej. Opierają się one na zasadzie dyfuzji substancji produkowanych przez szczepy bakterii antagonistycznych do podłoŝa, na którym są wysiewane szczepy bakterii patogennych [Spelhaugh 1989, Strus 1998]. Celem autorów niniejszej pracy było sprawdzenie w warunkach in vitro skuteczności działania preparatów probiotycznych wobec bakterii patogennych dla człowieka wyizolowanych od drobiu. Bakteriami badanymi w doświadczeniu były szczepy Salmonella Enteritidis oraz enteropatogenne szczepy E. coli (grupa EPEC). Wymienione drobnoustroje odpowiadają za zakaŝenia pokarmowe u ludzi. S. Enteritidis w Polsce od połowy lat 80. jest główną przyczyną zatruć i zakaŝeń pokarmowych u ludzi (około 20 tys. rejestrownych przypadków rocznie w kraju). Za najwaŝniejsze źródło uwaŝany jest drób, jaja i inne przetwory spoŝywcze pochodzenia drobiowego. Występowanie zakaŝeń pałeczką Salmonella Enteritidis u drobiu w Polsce są bardzo częste, a infekcja poza drogą poziomą szerzy się takŝe drogą pionową poprzez jaja. Patogenne szczepy E. coli, odpowiadają głównie za zatrucia o charakterze epidemicznym. Szczególnie często diagnozowane są zakaŝenia tymi pałeczkami u dzieci. Wśród patogennych szczepów E. coli duŝą grupę stanowią szczepy enteropatogenne (grupa EPEC) [Osek 2006, Przybylska 2004, Zieliński 2004]. MATERIAŁ I METODY Szczepy bakterii patogennych Do badań wykorzystano 20 szczepów pałeczek Salmonella Enteritidis i 20 szczepów enteropatogennych E. coli. Szczepy bakterii patogennych pochodziły z kolekcji Zakładu Chorób Drobiu Katedry Epizootiologii i Administracji Weterynaryjnej z Kliniką, Wydziału Medycyny Weterynaryjnej we Wrocławiu. Bakterie te zostały wyizolowane od drobiu w latach i były przechowywane w temperaturze 70 o C, w bulionie tryptozowo-sojowym z dodatkiem 10% glicerolu. Badane szczepy zostały zidentyfikowane na podstawie cech biochemicznych i serologiocznych: S. entritidis za pomocą surowic grupowych, a następnie surowic monowalentnych (Instytut Biotechnologii Surowic i Szczepionek, Biomed S.A.), natomiast E. coli zostały zidentyfikowane za Acta Sci. Pol.

3 Antagonistyczne działanie bakterii 85 pomocą surowic dla szczepów enteropatogennych E. coli EPEC (Instytut Biotechnologii Surowic i Szczepionek, Biomed S.A.). Wykonanie Do sprawdzenia właściwości bójczych szczepów bakterii antagonistycznych posłu- Ŝono się metodą słupkową, którą została opisana przez Strus [1998]. Szczepy bakterii antagonistycznych pochodziły z preparatów zawierających liofilizowane szczepy bakterii probiotycznych. Do badań uŝyto 7 preparatów: 6 zawierających po jednym szczepie i 1 preparat złoŝony, który zawierał 3 szczepy bakterii naleŝących do róŝnych gatunków (tab. 1). Posiew bakterii wykonywano na podłoŝu MRS (Biocorp), tak by uzyskać jednolity wzrost (zawiesina w jałowym płynie fizjologicznym, gęstość 1,5 skali McFarlanda). Szczepy były inkubowane w temperaturze 37 o C przez 36 godzin, w warunkach modyfikowanej atmosfery (Generator GENbox CO 2, biomérieux). Po okresie inkubacji z podłoŝa wycinano słupki o średnicy 9 mm. Tabela 1. Skład badanych preparatów Table 1. Composition of used preparats Numer preparatu Number of praparats Skład (gatunek/gatunki bakterii) Compositon (species of bacteria/bacterias) 1 Enterococcus feacium 2 Lactobacillus acidophilus 3 Lactobacillus acidophilus 4 Lactobacillus plantarum 5 Lactobacillus plantarum 6 L. delbruecki subsp. bulgaricus 7 Lactobacillus acidophilus, L. delbruecki subsp. bulgaricus, Bifidobacterium bifidum Szczepy S. Enteritidis i enteropatogennych E.coli wysiewane były jałową wymazówką na podłoŝe Mueller-Hiltona z zawiesiny w płynie fizjologicznym odpowiadającej gęstości 0,5 w skali McFarlanda. Następnie wcześniej wycięte słupki z hodowlą bakterii antagonistycznych zostały naniesione na płytki z posianymi bakteriami patogennymi, w ilości 7 słupków na jedną płytkę. Jako kontrolę negatywną uŝyto analogicznie wykonanych słupków z podłoŝa MRS, na którym nie wykonano posiewu. Odczytu strefy zahamowania dokonywano po 24-godzinnej inkubacji w temperaturze 37 o C w warunkach tlenowych. Dodatkowo, przy odczycie mierzono zaobserwowaną strefę przejaśnienia, która była wynikiem wolniejszego wzrostu bakterii patogennych. Opracowanie wyników Do celów opracowań statystycznych zebrane dane poszczególnych średnic zostały przekształcone, tak by ich wielkość odpowiadała róŝnicy średnicy badanych stref (bójczych i przejaśnienia) i średnicy słupków, która wynosiła 9 mm. Wyniki tak opracowanych pomiarów stref bójczych i stref zahamowania wzrostu bakterii patogennych zostały przedstawiane w formie wykresów pudełkowych. Do statystycznego opracowania wyników posłuŝono się Językiem R. Do wykazania róŝnic statystycznych pomiędzy działaniem poszczególnych preparatów probiotycznych wykorzystano testy: T-studenta i Wilcoxona. Medicina Veterinaria 5(2) 2006

4 86 M. Bednarski, M. Kuczkowski WYNIKI I OMÓWIENIE Największą średnicę zahamowania wzrostu S. Enteritidis wykazały bakterie antagonistyczne z preparatów probiotycznych nr 2, 4 i 7 (Ryc. 1), a siła ich działania była porównywalna i nie wykazała istotnych róŝnic statystycznych. Niemniej, wielkości stref zahamowania dla preparatów nr 4 i 7 były bardziej zróŝnicowane i przyjmowały wartości od bardzo niskich, równych zeru do bardzo wysokich. Zatem wyniki działania tych preparatów w stosunku do S. Enteritidis są mniej przewidywalne. Słabszymi i porównywalnymi względem siebie właściwościami hamującymi wykazały się preparaty nr 3 i 6 (brak róŝnic statystycznych). Najsłabsze właściwości miał preparat nr 5 oraz nr 1, który nie wykazał Ŝadnych właściwości bójczych. Ryc. 1. Wielkości stref zahamowania wzrostu S. Enteritidis (w milimetrach) Fig. 1. Size of growing s inhibition of S. Enteritidis (mm) Najsilniejszym działaniem bójczym wobec patogennych szczepów E. coli wykazał się preparat nr 2 i 4 (brak róŝnic statystycznych). Słabe działanie wykazał preparat nr 6, natomiast brak lub znikome działanie miały pozostałe preparaty (ryc. 2). Istnienie stref przejaśnienia obserwowano u wszystkich bakterii antagonistycznych. Ich wielkości w stosunku do stref zahamowania wzrostu wykazały odwrotną tendencję. Większe średnie wielkości stref przejaśnienia obserwowano u E. coli, a mniejsze u S. Enteritidis (ryc. 3, 4). Preparat nr 1 w przypadku S. Enteritidis wykazał najmniejszą strefę zahamowania i były to róŝnice istotne statystycznie. Porównywalne działanie wykazały preparaty nr 2, 3, 4, 6, 7 (brak róŝnic istotnych statystycznie).w przypadku E. coli najsłabsze działanie wykazały 3 preparaty nr 1, 3, 7 (brak róŝnic istotnych statystycznie). Najsilniejsze działanie natomiast wykazały preparaty nr 2, 4, 6. Acta Sci. Pol.

5 Antagonistyczne działanie bakterii 87 Kontrola negatywna (słupek z podłoŝem MRS) nie wykazała Ŝadnego działania na badane szczepy bakterii patogennych. Ryc. 2. Wielkości stref zahamowania wzrostu enteropatogennych E. coli (w milimetrach) Fig. 2. Size of growing s inhibition of entropathogenic E.coli (mm) Ryc. 3. Wielkości stref przejaśnienia S. Enteritidis (w milimetrach) Fig. 3. Size of slow down growing s sphere of S. Enteritidis (mm) Medicina Veterinaria 5(2) 2006

6 88 M. Bednarski, M. Kuczkowski Ryc. 4. Wielkości stref przejaśnienia enteropatogennych E. coli (w milimetrach) Fig. 4. Size of slow down growing s sphere of entropathogenic E.coli (mm) WNIOSKI Poszczególne bakterie antagonistyczne wykazały zróŝnicowane właściwości bójcze wobec bakterii patogennych w badaniach in vitro. Preparat nr 1 zawierający w swoim składzie Enterococcus feacium nie wykazał Ŝadnych właściwości bójczych w stosunku do badanych szczepów. Zdecydowanie efektywniejsze działanie badanych probiotyków zostało zaobserwowane wobec S. Enteritidis, dodatkowo uzyskane wyniki były bardziej wyrównane. Natomiast skuteczność działania wobec E. coli wykazały tylko 3 preparaty (ryc. 3 i 4). Najlepsze właściwości hamujące zarówno w stosunku do S. Enteritidis, jak i E. coli wykazały preparaty: nr 2, zawierający w swoim składzie Lactobacillus acidophilus oraz nr 4, w którego skład wchodzi Lactobacillus plantarum. W przeprowadzonych badaniach preparat złoŝony (nr 7) nie wykazał lepszych właściwości hamujących niŝ preparaty zawierające jeden gatunek bakterii, niemniej moŝe być to wynikiem wzajemnego oddziaływania bakterii zawartych w preparacie na siebie podczas wzrostu na poŝywce. Istnienie strefy przejaśnienia związane jest ze zwolnionym (opóźnionym) wzrostem bakterii patogennych. Zjawisko to jest trudne do wytłumaczenia. Hodowla bakterii antagonistycznych w warunkach beztlenowych hamuje w znacznej części wytwarzanie niespecyficznych substancji hamujących: kwasu mlekowego i nadtlenku wodoru [Kot 2000]. Jednak takie wyniki mogą sugerować, Ŝe w przeciwieństwie do strefy zahamowania wzrostu, będącej efektem działania specyficznych substancji antybiotycznych Acta Sci. Pol.

7 Antagonistyczne działanie bakterii 89 i bakteriocyn, są one wynikiem działania innych niespecyficznych substancji niŝ wymienione, np. aldehydów. MoŜliwe jest teŝ działanie substancji specyficznych, których stęŝenie in vitro było zbyt niskie, by zahamować wzrost bakterii, a jedynie spowodowało zwolnienie wzrostu. W badaniach wykazano, Ŝe produkcja substancji hamujących jest cechą szczepu, a nie cechą gatunkową bakterii antagonistycznych (róŝnice w badaniach preparatów nr 2 i 3 (Lactobacillus acidophilus), 4 i 5 (Lactobacillus plantarum)). RównieŜ poszczególne szczepy wykazały zróŝnicowaną aktywność wobec obydwu gatunków bakterii patogennych. Nie u wszystkich szczepów bakterii probiotycznych wykorzystywanych w badaniach wykazano zdolność hamowania wzrostu badanych bakterii patogennych (preparat nr 1). NaleŜy jednak zwrócić uwagę, Ŝe brak tej zdolności nie oznacza braku skuteczności działania tych preparatów, poniewaŝ jak juŝ wspomniano mechanizm działania probiotyków jest bardzo złoŝony i nie do końca poznany. PIŚMIENNICTWO Kot B., Jakubczak A., Bukowski K., Antagonistyczne działanie bakterii fermentacji mlekowej w stosunku do wybranych drobnoustrojów. Med. Wet. 56, s Lewus C. B., Kaiser A., Montville T.J., Inhibition of food-borne bacterial pathogens by bacteriocins from lactic acid bacteria isolated from meat. Appl Environ Microbiol. 57, s Mikołajczyk A., Radkowski M., Elimination of Salmonella spp. by lactic acid. Pol. J. Vet. Scien. 5, s Osek J., Zoonozy oraz ich czynniki etiologiczne w krajach Unii Europejskiej oraz w Norwegii w 2004 roku. śycie Wet. 81, s Prost E., Probiotyki. Med. Wet. 55,s Przybylska A., Zatrucia i zakaŝenia pokarmowe w 2002 roku. Przegl. Epidem. 58, s Spelhaugh S.R., Harlander S. K., Inhibition of bacterial food-borne pathogens by bacteriocins from Lactococcus lactis and Pediococcus pentosaceous. J. Food Protect., 52, s Strus M., Nowa metoda oceny antagonistycznego działania bakterii kwasu mlekowego (LAB) na wybrane, chorobotwórcze bakterie wskaźnikowe. Med. Dośw. Mikrobiol., 50, s Usajewicz I., Perobiotyki w Ŝywieniu ludzi. Med. Wet., 55, s Zieliński A, Czarkowski M.P., Choroby zakaźne w Polsce w 2002 roku. Przegl. Epidem. 58, s ANTAGONISTIC ACTIVITY OF BACTERIA FROM PROBIOTIC DRUGS AGAINST SALMONELLA ENTERITIDIS AND ENTEROPATHOGENIC STRAINS OF E. COLI Abstract. Probiotics have important role as barrier against the development of pathogenic bacteria and in treatment of bacterial infection of gut system of animals and human. Lactic acid bacteria are the most common microbes used in probiotics. Antibacterial activity is an important characteristic of probiotics. The mechanisms by which lactic acid bacteria exert their effects are multiple. Lactic acid bacteria produce a variety of antagonistic fac- Medicina Veterinaria 5(2) 2006

8 90 M. Bednarski, M. Kuczkowski tors that include metabolic end products, antibiotic-like substances and bactericidal proteins, termed bacteriocins. The aim of this study were to compare the antimicrobial activity of different probiotics against bacterial strains Salmonella Enteritidis and enteropathogenic E. coli isolated from poultry. Key words: antagonism, E. coli, lactic acid bacteria, probiotics, pathogenic bacteria, Salomonella Enteritidis Zaakceptowano do druku Accepted for print: Acta Sci. Pol.