Autoreferat Dr n. med. Piotr Maciejak Zakład Neurochemii Instytut Psychiatrii i Neurologii w Warszawie Strona 1
Spis treści 1. Imię i nazwisko... 3 2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe/artystyczne... 3 3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych... 3 4. Wskazanie osiągnięcia wynikające z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 roku o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zmianami)... 3 a) Tytuł osiągnięcia naukowego... 4 b) Publikacje składające się na osiągnięcie naukowe... 4 c) Omówienie celu naukowego wyżej wymienionych prac i osiągniętych wyników wraz z omówieniem ich ewentualnego wykorzystania... 5 5. Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo-badawczych... 14 a) Dane bibliometryczne... 14 b) Opis i tematyka głównych kierunków pozostałych badań naukowych... 14 Strona 2
1. IMIĘ I NAZWISKO Piotr Maciejak 2. POSIADANE DYPLOMY, STOPNIE NAUKOWE/ARTYSTYCZNE W latach 1993 1999 studia na I Wydziale Lekarskim Akademii Medycznej w Warszawie zakończone uzyskaniem tytyłu lekarza W latach 2000 2001 Studia Podyplomowe z zakresu Ekonomiki Zdrowia na wydziale Ekonomii Uniwersytetu Warszawskiego. Tytuł pracy dyplomowej: Metodologia analiz farmakoekonomicznych i ich rola w procesie racjonalizacji zachowań uczestników rynku farmaceutycznego W roku 2006 obrona pracy doktorskiej i uzyskanie tytułu dr n. med; promotor Prof. Adam Płaźnik, tytuł pracy Rola metabotropowych receptorów kwasu glutaminowego w zaburzeniach behawioralnych i biochemicznych w modelach padaczki 3. INFORMACJE O DOTYCHCZASOWYM ZATRUDNIENIU W JEDNOSTKACH NAUKOWYCH W latach 1999 2000 staż podypolmowy w Szpitalu Wolskim w Warszawie W latach 1999 2001 Asystent w Zakładzie Farmakologii i Fizjologii Ośrodkowego Układu Nerwowego Instytytutu Psychiatrii i Neurologii w Warszawie Od roku 2001 Adiunkt w Zakładzie Neurochemii Instytytutu Psychiatrii i Neurologii w Warszawie Od roku 2002 Adiunkt w Katedrze i Zakładzie Farmakologii Doświadczalnej i Klinicznej Uniwersytetu Medycznego w Warszawie Od roku 2004 współpraca z Urzędem Rejestracji Produktów Leczniczych jako ekspert zewnętrzny w zakresie oceny dokumentacji rejestracyjnej (przedklinicznej i klinicznej) oraz dokumentacji harmonizacyjnych Od 2012 roku ekspert zewnętrzny oceniający kliniczną dokumentację rejestracyjną w Europejskiej Agencji Leków (EMA) 4. WSKAZANIE OSIĄGNIĘCIA WYNIKAJĄCE Z ART. 16 UST. 2 USTAWY Z DNIA 14 MARCA 2003 ROKU O STOPNIACH NAUKOWYCH I TYTULE NAUKOWYM ORAZ O STOPNIACH I TYTULE W ZAKRESIE SZTUKI (DZ. U. NR 65, POZ. 595 ZE ZMIANAMI) Strona 3
a) TYTUŁ OSIĄGNIĘCIA NAUKOWEGO Ocena roli szlaku kynureninowego w mechanizmach działania terapii przeciwpadaczkowych. b) PUBLIKACJE SKŁADAJĄCE SIĘ NA OSIĄGNIĘCIE NAUKOWE 1. Maciejak P, Szyndler J, Turzyńska D, Sobolewska A, Taracha E, Skórzewska A, Lehner M, Bidziński A, Płaźnik A. Time course of changes in the concentration of kynurenic acid in the brain of pentylenetetrazol-kindled rats. Brain Res Bull. 2009 Mar 30;78(6):299-305. IF: 2.184; MNiSW: 27.000 2. Maciejak P, Szyndler J, Turzyńska D, Sobolewska A, Płaźnik A. Kynurenic acid: a new effector of valproate action? Pharmacol Rep. 2011;63(6):1569-73. IF: 2.445; MNiSW: 25.000 3. Maciejak P, Szyndler J, Turzyńska D, Sobolewska A, Kołosowska K, Lehner M, Płaźnik A. The kynurenine pathway: a missing piece in the puzzle of valproate action? Neuroscience. 2013 Mar 27;234:135-45. IF: 3.327; MNiSW: 25.000 4. Maciejak P, Szyndler J, Kołosowska K, Turzyńska D, Sobolewska A, Walkowiak J, Płaźnik. Valproate disturbs the balance between branched and aromatic amino acids in rats.. Neurotox Res. 2014 May;25(4):358-68. IF: 3.538; MNiSW: 25.000 5. Maciejak P, Szyndler J, Turzyńska D, Sobolewska A, Kołosowska K, Krząścik P, Płaźnik A. Is the interaction between fatty acids and tryptophan responsible for the efficacy of a ketogenic diet in epilepsy? The new hypothesis of action. Neuroscience. 2016 Jan 28;313:130-48 IF: 3.357; MNiSW: 25.000 Całkowity Impact Factor powyższych prac: 14,851 pkt Całkowita punktacja MNiSW powyższych prac: 127 pkt Oświadczenia współautorów o indywidualnym wkładzie autorskim w załączniku nr 8. Wykaz prac wraz z określeniem indywidualnego wkładu autorskiego w załączniku nr 4 Strona 4
c) OMÓWIENIE CELU NAUKOWEGO WYŻEJ WYMIENIONYCH PRAC I OSIĄGNIĘTYCH WYNIKÓW WRAZ Z OMÓWIENIEM ICH EWENTUALNEGO WYKORZYSTANIA OCENA ROLI SZLAKU KYNURENINOWEGO W MECHANIZMACH DZIAŁANIA TERAPII PRZECIWPADACZKOWYCH. Problematyka padaczki jak i samego procesu epileptogenezy pomimo wysiłku wielu ośrodków naukowych wymyka się próbom jej całościowego opisania. Wiadomo, że proces epileptogenezy, prowadzi do zasadniczych zmian w morfologii i funkcjonowaniu ośrodkowego układu nerwowego. Zmiany te dotyczą zarówno ekspresji genów, struktury i funkcji receptorów oraz kanałów jonowych, aktywności czynników wzrostowych, nasilenia procesu neurogenezy, zmian metabolicznych i wielu jeszcze innych zmian prowadzących do reorganizacji całych sieci neuronalnych. Analiza zmian zachodzących w przebiegu epileptogenezy, może mieć istotne znaczenie dla możliwości ingerowania w owe procesy a tym samym modyfikowania przebiegu padaczki. Jednak przełożenie pogłębionej wiedzy dotyczącej mechanizmów epileptogenezy, na skuteczność leczenia padaczki, trafia obecnie na wiele przeszkód, w tym tych związanych z brakiem użytecznych biomarkerów procesu epileptogenezy. Z faktów tych mogą wynikać różne strategie obierane dla poszukiwania skuteczniejszego leczenia przeciwpadaczkowego. Tak więc w klasycznym, analitycznym podejściu skazani jesteśmy na odkrywanie zależności strukturalno-funkcjonalnych zachodzących w przebiegu epileptogenezy, mając nadzieje na ich szczegółowe poznanie oraz możliwość selektywnego hamowania. Inne podejście dotyczy poprawy objawowego leczenia padaczki, poprzez poszukiwanie doskonalszych narzędzi farmakologicznych (w tym poszukiwanie nowych mechanizmów działania znanych leków przeciwpadaczkowych lub terapii przeciwpadaczkowych takich jak dieta ketogenną). Obydwa te podejścia były istotne w moich badaniach, w których skupiłem sie na znaczeniu szlaku kynureninowego w przedklinicznych modelach epileptogenezy oraz potencjalnej roli tego szlaku w mechanizmach działania terapii przeciwpadaczkowych. Istnieje ogólna zgoda co do tego, że napady padaczkowe mogą być wynikiem wystąpienia zaburzonej równowagi między procesami pobudzenia i hamowania neuronów. Przypuszcza się, że procesy prowadzące do wystąpienia napadów padaczkowych mogą być konsekwencją nadmiernej aktywacji układów pobudzających i/lub spadku aktywności układów hamujących. Kwas kynureninowy (KYNA) obok GABA jest uważany za jedną z najważniejszych endogennych substancji o charakterze hamującym. Jest on jednym z metabolitów tryptofanu (TRP) wytwarzanym przez komórki glejowe oraz neurony w szlaku kynureninowym. W ośrodkowym układzie nerwowym, KYNA syntetyzowana jest poprzez transaminacje z jej prekursora, L kynureniny Strona 5
(KYN). W wysokich, stężeniach KYNA jest konkurencyjnym antagonistą receptorów NMDA, AMPA oraz kainowych dla kwasu glutaminowego. W niższych stężeniach KYNA działa jako antagonista miejsca glicynowego receptora NMDA. Wykazano także, że KYNA może antagonizować, w sposób niekonkurencyjny, aktywność presynaptycznych receptorów nikotynowych alfa7. Istnieją dane wskazujące, że KYNA bierze udział w hamowaniu aktywności neuronalnej w tym także zjawiska rozniecania drgawek oraz napadów drgawek. 1. We wcześniejszych badaniach obserwowano, że stężenie KYNA w mózgu zmienia się w przebiegu padaczki, chociaż charakter oraz wzorzec czasowy tych zmian w określonych strukturach mózgu nie jest dobrze poznany. Stąd też szczególnie ważne wydawało mi się pytanie o znaczenie tych zmian w obrębie układu limbicznego oraz kory mózgu, a więc w strukturach ściśle zaangażowanych w procesy epileptogenezy. Z tego powodu, postanowiliśmy zbadać zmiany w poziomach KYNA w tych strukturach mózgu na różnych etapach rozniecania drgawek (przedkliniczny model epileptogenezy), indukowanych podaniami pentylenetetrazolu (PTZ; związek drgawko-twórczy, modulujący miejsce pikrotoksynowe, antagonista GABA-A). Analiza biochemiczna (HPLC) wykazała, że u zwierząt znajdujących się na pośrednim etapie rozniecenia drgawek (stopień 1 i 2 wg skali Racine a) obserwowano selektywny wzrost poziomu KYNA w korze gruszkowatej. Następnie, w trakcie procesu rozniecania dochodziło do stopniowego spadku stężenia KYNA, a największe nasilenie tego zjawiska obserwowano u zwierząt z w pełni roznieconymi drgawkami (stopień 5 wg skali Racine a) w jądrze ogoniastym, hipokampie, korze gruszkowatej oraz ciele migdałowatym. Biorąc pod uwagę, że kora gruszkowata jest aktywowana na wczesnym etapie rozwoju drgawek roznieconych, oraz fakt, że KYNA wykazuje działanie antagonistyczne wobec receptora NMDA, wzrost poziomu KYNA na wczesnych etapach rozniecania drgawek wydaje sie być przejawem mechanizmu obronnego, aktywowanego w celu zapobiegania nadmiernej aktywacji neuronów glutaminianergicznych. Z drugiej zaś strony, u zwierząt z w pełni roznieconymi drgawkami, obserwowane obniżenie poziomu KYNA może być przejawem bezpośredniej odpowiedzi na PTZ na tle zmienionej pobudliwości układów neuronalnych powstałej w wyniku procesu rozniecania. W tym kontekście interesujące wydają się także wyniki innych autorów, którzy wykazali selektywne deficyty endogennego KYNA u szczurów w genetycznym modelu napadów nieświadomości. Zmiany o podobnym charakterze obserwowano u ludzi, u których obniżone poziomy KYNA obserwowano w napadach nieświadomości, w zespole Westa, oraz niektórych chorobach neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Parkinsona. Podsumowując, przeprowadzone badanie potwierdza znaczenie szlaku kynureninowego w procesie epileptogenezy oraz wskazuje, że modulacja szlaku kynureninowgo w Strona 6
przebiegu epileptogenezy jest procesem o zmiennej dynamice zależnej od stopnia przebudowy epileptycznej poszczególnych struktur mózgu. Przy czym, początkowym etapom rozniecania drgawek towarzyszył wzrost stężenia KYNA, natomiast wraz z nasileniem procesu roznieca dochodziło do spadku stężenia KYNA, co może sugerować, że wraz ze zmniejszeniem stężenia KYNA łatwiej dochodzi do propagacji i pełnej ekspresji drgawek. Maciejak P, Szyndler J, Turzyńska D, Sobolewska A, Taracha E, Skórzewska A, Lehner M, Bidziński A, Płaźnik A. Time course of changes in the concentration of kynurenic acid in the brain of pentylenetetrazol-kindled rats. Brain Res Bull. 2009 Mar 30;78(6):299-305. 2. Punktem wyjścia kolejnego badania była obserwacja wskazująca, że właściwości przeciwdrgawkowe oraz neuroprotekcyjne, przypisywane KYNA charakteryzują także działania kwasu walproinowego (VPA). Podobieństwo efektów działania pomiędzy VPA i KYNA, stało się punktem wyjścia moich dalszych badań i postawienia pytania badawczego o rolę KYNA w centralnym mechanizmie działania VPA. VPA jest jednym z najczęściej stosowanych leków przeciwpadaczkowych, który w sensie chemicznym jest rozgałęzionym krótkołańcuchowym kwasem tłuszczowym. Mimo jego powszechnego stosowania, mechanizm działania VPA nie jest jak dotąd w pełni zrozumiały. Dotychczas potwierdzone mechanizmy działania VPA obejmują zwiększenie syntezy i hamowanie degradacji GABA; hamowanie pobudzenia wywołanego aktywacją receptorów NMDA; blokadę NA +, Ca 2+ oraz napięciowo-zależnych kanałów K +. VPA należy także do inhibitorów deacetylazy histonów. W związku z tym zbadałem zmiany stężenia KYNA w hipokampie po podaniu VPA (i.p.; 400mg/kg) u swobodnie poruszających się szczurów (mikrodializy in vivo). W naszym badaniu, zaobserwowaliśmy bardzo silny wzrost (ponad 1600 %) stężenia KYNA w hipokampie szczurów po podaniu VPA, a dodatkowo, wzrost ten był pozytywnie skorelowany z lokalnym wzrostem stężenia GABA. Przyjęty schemat eksperymentu nie pozwalał na określenie mechanizmu w jakim VPA wywołuje wzrost poziomu KYNA. Poszukiwanie tego mechanizmu stało się przedmiotem naszego kolejnego badania. Niemniej jednak, na tym etapie analizy, wydało się nam prawdopodobne, że zwiększone stężenie KYNA może być ważnym elementem przeciwpadaczkowej i neuroprotekcyjnej aktywności VPA. Podsumowując, zaobserwowano nieopisywaną wcześniej zależność, wskazującą że dootrzewnowe podanie VPA prowadziło do bardzo wyraźnego ośrodkowego wzrostu KYNA. Inne ważne spostrzeżenie wynikające z naszego badania, dotyczy występowania dodatniej korelacji pomiędzy KYNA i stężeniem GABA. Uwzględniając przeciwpadaczkowy Strona 7
i neuroprotekcyjny kontekst działania KYNA i VPA, a także ich hamujący wpływ na aktywność neuronalną, wydaje się prawdopodobne, że przeciwpadaczkowe i neuroprotekcyjne właściwości VPA, przynajmniej częściowo, mogą być konsekwencją wzrostu poziomów KYNA. Maciejak P, Szyndler J, Turzyńska D, Sobolewska A, Płaźnik A. Kynurenic acid: a new effector of valproate action? Pharmacol Rep. 2011;63(6):1569-73. 3. Głównym celem kolejnego badania była próba pogłębienia wstępnych obserwacji pochodzących z poprzedniego badania, oraz próba poszukiwania przyczyn dla których, wykazano bardzo znaczący wzrost stężenia KYNA w hipokampie po ostrym podaniu VPA u zwierząt z roznieconymi drgawkami w modelu PTZ. W pierwszym etapie eksperymentu zbadano dawko-zależność obserwowanego efektu VPA (i.p.; 50, 250 i 500 mg/kg) oraz sprawdzono czy wzorzec zmian w poziomach KYNA po podaniu VPA obserwowany poprzednio u zwierząt z roznieconymi drgawkami, jest także obecny u szczurów kontrolnych. Główną obserwacją pochodzącą z tej części eksperymentu było potwierdzenie bardzo silnych wzrostów poziomu KYNA po podaniu VPA (mikrodializy, in vivo) a obserwowany efekt był dawko-zależny. Badania in vitro wykazały, że zmiany obserwowane po podaniu VPA nie ograniczały się tylko do zmian stężenia KYNA ale dotyczyły także jego bezpośrednich prekursorów TRP i KYN. Podanie VPA prowadziło do postępującego i bardzo silnego wzrostu ośrodkowych stężeń KYN, KYNA i TRP. Zmiany w stężeniach KYN, KYNA i TRP po podaniu VPA obserwowano również w osoczu, jednak struktura tych zmian różniła się od tej obserwowanej w hipokampie. Najbardziej widoczne różnice dotyczyły TRP. Poziom TRP w osoczu ulegał zmniejszeniu, podczas gdy poziom w hipokampie wzrastał. Biorąc pod uwagę otrzymane wyniki oraz szereg dodatkowych zmiennych (fakt, (i) że TRP należy do egzogennych aminokwasów, którego tylko wolna frakcja niezwiązana z albuminami może przenikać do OUN oraz podlegać dalszemu katabolizmowi; oraz fakt, (ii) że KYNA, bardzo słabo przenika przez barierę krew-mózg (BBB) do ośrodkowego układu nerwowego), wydaje się, że podawanie VPA związane jest ze wzrostem wolnej frakcji TRP w osoczu. Możliwym wytłumaczeniem tego zjawiska jest fakt, że VPA zwiększa ilość wolnego TRP wypierając go z wiązania białkami osocza. W jednym z badań wykazano, że docelowym miejscem wiązania TRP na albuminach jest pozycja Sudlow II, stąd też TRP jest powszechnie stosowanym markerem wiązania dla tego miejsca. Idąc tym tokiem rozumowania, interesującym wydawało się sprawdzenie, czy inny lek, Strona 8
który silnie wiąże się w pozycji Sudlow II, a więc ma potencjał do wypieraniatrp, będzie wywoływać podobne do VPA zmiany w aktywności szlaku kynureninowego. W tym celu wykorzystaliśmy ibuprofen (IBU), jako jeden z leków referencyjnych dla wiązania się w miejscu Sudlow II na albuminach. Uzyskane wyniki wskazały, że IBU w stosunkowo dużej dawce 150 mg/kg, powodował podobny wzorzec zmian aktywności szlaku kynureninowego, do tego obserwowanego po podaniu VPA. Co więcej, okazało się, że istnieje silny efekt addytywny pomiędzy IBU (75 mg/kg) i VPA (250 mg/kg) w odniesieniu do ośrodkowego i obwodowego oddziaływania na ekspresje TRP KYN, KYNA. Wyniki te potwierdziły naszą hipotezę, że zmiany w aktywności szlaku kynureninowego obserwowane po podaniu VPA wynikają najprawdopodobniej z usunięcia TRP z jego miejsca wiązania na albuminach. Spostrzeżenie to ma istotne konsekwencje. Uwolnienie dużej ilości TRP z miejsc wiążących na albuminach stanowi bowiem podłoże do aktywacji różnych szlaków metabolicznych przekształceń TRP, np. aktywacji szlaku kynureninowego czy szlaku serotoninowego. Ponadto, TRP jest kluczowym przedstawicielem aminokwasów aromatycznych (AAA), stąd też jego wzrost może prowadzić do znacznego zaburzenia ośrodkowej i obwodowej równowagi pomiędzy aminokwasami rozgałęzionymi (BCAA), takimi jak leucyna, izoleucyna i walina, oraz aminokwasami aromatycznymi, takimi jak tyrozyna i fenyloalanina. Wydaje się, że wzrosty w poziomie TRP wywołane podaniem VPA, ze względu na konkurencję w domózgowym transporcie, mogą spowodować spadek BCAA/AAA w mózgu. Podsumowując, zaobserwowaliśmy, że zmiany w aktywności szlaku kynureninowego (wzrost TRP, KYN i KYNA w mózgu) obserwowane po podaniu VPA wynikają najprawdopodobniej z wyparcia TRP z jego miejsca wiązania na albuminach. Wydaje się, że konsekwencją takiego stanu rzeczy mogą być istotne obwodowe i ośrodkowe zmiany biochemiczne dotyczące także BCAA, AAA oraz przekaźników monoaminergicznych (dla których prekursorami są AAA), co jak się wydaje może mieć znaczenie dla przeciwpadaczkowego i neuroprotekcyjnego działania VPA. Maciejak P, Szyndler J, Turzyńska D, Sobolewska A, Kołosowska K, Lehner M, Płaźnik A. The kynurenine pathway: a missing piece in the puzzle of valproate action? Neuroscience. 2013 Mar 27;234:135-45. 4. W kolejnym badaniu rzeczywiście wykazałem, że podawanie VPA (i.p.) poprzez zmiany w stężeniu TRP (a w konsekwencji zmiany warunków konkurencji o wspólny domózgowy transporter LNAA) może prowadzić do obwodowych i ośrodkowych zaburzeń równowagi pomiędzy AAA a BCAA. Strona 9
Zaobserwowałem, że mózgach badanych zwierząt istotnie dochodziło do wzrostu stężeń AAA oraz spadku stężeń BCAA, co w konsekwencji prowadziło do obniżenia wskaźnika BCAA/AAA. Zmiana relacji BCAA/AAA może nieść za sobą bardzo poważne konsekwencje biochemiczne i funkcjonalne zarówno obwodowe jak i ośrodkowe, co obserwowaliśmy analizując zmiany stężeń dla szerokiej grupy neuroprzekaźników. Zaobserwowaliśmy, że opisywanym powyżej zmianom poziomów BCAA i AAA towarzyszyło zwiększenie mózgowych stężeń NA, DA oraz 5-HT. Podsumowując, zaobserwowaliśmy po raz pierwszy, że podawanie (i.p.) VPA prowadziło do wzrostu stężeń AAA oraz spadku stężeń BCAA w hipokampach, co w konsekwencji powodowało obniżenia wskaźnika BCAA/AAA. Zmianie poziomów BCAA i AAA towarzyszyło zwiększenie mózgowych stężeń NA, DA oraz 5-HT. Biorąc pod uwagę istotny wpływ BCAA i AAA na metabolizm neuronów oraz przekaźnictwo monoaminoergiczne, wydaje się, że ten mechanizm działania VPA powinien być także brany pod uwagę przy ocenie przeciwdrgawkowej, neuroprotekcyjnej i normotymicznej roli VPA. Maciejak P, Szyndler J, Kołosowska K, Turzyńska D, Sobolewska A, Walkowiak J, Płaźnik. Valproate disturbs the balance between branched and aromatic amino acids in rats.. Neurotox Res. 2014 May;25(4):358-68. 5. Konsekwencją otrzymanych wyników oraz z fakt, że struktura chemiczna VPA klasyfikuje go jako kwas tłuszczowy, sprowokowało naturalne pytanie dotyczące roli diety ketogennej (KD) w regulacji metabolizmu TRP. Dieta ketogenna (KD) jest jedną z najskuteczniejszych metod terapeutycznych u pacjentów z padaczką lekooporną. Istotą KD jest zwiększone spożycie tłuszczów z równoczesnym ograniczeniem spożycia węglowodanów poprzez co dochodzi do zwiększonego wytwarzania ciał ketonowych. Pomimo wysokiej skuteczności KD, potwierdzonej w wielu badaniach klinicznych, jej zastosowanie jest ograniczone, głównie z powodu niskiej akceptacji przez pacjentów, wynikającej z konieczności utrzymania wymagających reżimów żywieniowych. Pomimo długiej historii stosowania KD w padaczce, nadal nie jest w pełni znany jej mechanizm działania. Istniejące hipotezy dotyczące mechanizmu działania KD obejmują między innymi zwiększone wytwarzanie ciał ketonowych, zmiany aktywności niektórych układów neuroprzekaźnikowych (w tym GABA, glutaminianu i adenozyny) i kanałów jonowych, poprawę bioenergetyki komórki i funkcji mitochondriów jak również bezpośrednie przeciwdrgawkowe działanie kwasów tłuszczowych. Jako hipotezę roboczą tego badania przyjąłem założenie, potwierdzone w przebiegu badań, że działanie przeciwdrgawkowe KD jest między innymi wynikiem jej wpływu na metabolizm TRP. Strona 10
Szczegółowymi celami badania była ocena wpływu kwasów tłuszczowych (FA): oktanowego i dekanowego, będącymi głównymi składnikami diety MCT (podtyp diety ketogennej oparty na średniołańcuchowych FA) na metabolizm TRP, aktywność szlaku kynureninowego, stężenia monoamin i aminokwasów (w tym BCAA oraz AAA). Dodatkowo oceniano wpływ podań FA na nasilenie sedacji i próg wywoływania wyładowań następczych w hipokampach. Zaobserwowaliśmy, że dożołądkowe podanie FA zwiększało poziom TRP oraz KYNA w mózgu, jak również powodowało istotne zmiany w mózgowych i osoczowych stężeniach BCAA i AAA (obniżenie wskaźnika BCAA/AAA). Zmiany te miały analogiczny charakter do tych obserwowanych wcześniej po podaniach VPA. Kluczową obserwacją tego etapu badania było wyraźne podnoszenie progu wyładowań następczych w hipokampach oraz wywoływanie sedacji przez FA, przy czym zablokowanie przejścia TRP przez barierę krew-mózg znosiło te efekty natomiast nie miało wpływu na powstawanie ciał ketonowych. Biorąc pod uwagę, że FA są głównymi składnikami KD wyniki te sugerują, że przeciwdrgawkowe działania KD mogą być zależne od interakcji pomiędzy kwasami tłuszczowymi a metabolizmem TRP. Wyniki tych badań pozwoliły na postawienie hipotezy dotyczącej potencjalnego mechanizmu działania KD, dla której punktem wyjścia jest interakcja pomiędzy kwasami tłuszczowymi (FA) a TRP, która dobrze spaja dotychczasowe teorie działania KD: wolna frakcja TRP uwolniona z albumin z jednej strony podlega metabolizmowi a z drugiej buduje przewagę konkurencyjną wobec transportera LNAA (odpowiedzialnego za transport BCAA i AAA przez barierę krew-mózg -BBB), prowadząc do wzrostu ośrodkowego stężenia TRP. Wzrost stężenia TRP może powodować zmiany aktywności i metabolizmu komórek nerwowych w wyniku przesunięć w równowadze potencjału redoks. Jednym z najważniejszych regulatorów wielu szlaków metabolicznych jest dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy (NAD + ), którego jednym ze źródeł de novo jest TRP. Wzrost wolnej frakcji TRP w mózgu, będący efektem podań FA, może prowadzić do zwiększenia ilości NAD +, a tym samym do zmian homeostazy potencjału redoks w komórkach mózgu. Konsekwencją takiego stanu rzeczy może być, między innymi, zmniejszenie dopływu mleczanu do neuronów z astrocytów, jak również przesunięcie równowagi reakcji wchodzących w skład antyportowego działania przenośnika jabłczanowo- asparaginowego MAS (malate-aspartate shuttle) po obu stronach błony mitochondrialnej. Istnieją dowody na to, że zmiany w funkcji enzymów biorących udział w reakcjach MAS mogą wpływać na otwarcie kanału K ATP, co może prowadzić do hiperpolaryzacji błony neuronalnej i hamowania aktywności drgawkowej. Podsumowując, zaobserwowaliśmy, że dożołądkowe podanie FA zwiększało poziom TRP oraz KYNA w mózgu, jak również powodowało obniżenie wskaźnika BCAA/AAA. Strona 11
Kluczową obserwacją tego etapu badania było także wyraźne podnoszenie progu wyładowań następczych w hipokampach przez FA, przy czym zablokowanie przejścia TRP przez barierę krew-mózg znosiło te efekty. Biorąc pod uwagę, że FA są głównymi składnikami KD wyniki te sugerują, że przeciwdrgawkowe działania KD mogą być częściowo zależne od interakcji pomiędzy kwasami tłuszczowymi a metabolizmem TRP. Zaproponowaliśmy hipotezę dotyczącą potencjalnego mechanizmu działania KD, dla której punktem wyjścia jest interakcja pomiędzy kwasami tłuszczowymi (FA) a TRP, która prowadzi do przesunięć w równowadze potencjału redoks pomiędzy cytoplazmą a mitochondrium neuronu, co może wpływać na otwarcie kanału K ATP, powodując hyperpolaryzację błony neuronalnej i hamowanie aktywności drgawkowej. Maciejak P, Szyndler J, Turzyńska D, Sobolewska A, Kołosowska K, Krząścik P, Płaźnik A. Is the interaction between fatty acids and tryptophan responsible for the efficacy of a ketogenic diet in epilepsy? The new hypothesis of action. Neuroscience. 2016 Jan 28;313:130-48. Podsumowanie ogólne Badania nasze dotyczyły oceny zaangażowania szlaku kynureninowego w mechanizmach działania terapii przeciwpadaczkowych. Efektem tych badań było między innymi, zwrócenie uwagi na szczególne zaangażowanie endogennej substancji hamującej jaką jest KYNA w procesie epileptogenezy. Badanie nasze wskazały, że modulacja szlaku kynureninergicznego w przebiegu epileptogenezy jest procesem o wewnętrznej dynamice, która jak się wydaje jest przejawem reakcji adaptacyjnych: wzrost stężenia KYNA z jednej strony może być przejawem mechanizmu obronnego, aktywowanego w celu zapobieżeniu nadmiernej aktywacji neuronów glutaminianergicznych. Z drugiej zaś strony spadek stężenia KYNA mmoże być przejawem bezpośredniej odpowiedzi na hamowanie przekaźnictwa GABA-ergicznego, na tle zmienionej pobudliwości układów neuronalnych, powstałej w wyniku procesu rozniecania drgawek za pomocą PTZ. Drugim szczególnie istotnym wątkiem związanym z KYNA jest obserwacja dotycząca potencjalnego znaczenia KYNA w mechanizmie działania VPA, jednego z najczęściej stosowanych leków przeciwpadaczkowych. Wykazano, że obwodowe podania VPA prowadzą do aktywacji szlaku kynureninergicznego z następowym wzrostem TRP, KYN i KYNA oraz zmniejszeniem wskaźnika BCAA/AAA w ośrodkowym układzie nerwowym. Uwzględniając mechanizm działania KYNA, wydaje się prawdopodobne, że efekt silnego wzrostu KYNA po podaniu VPA może w pewnym zakresie tłumaczyć przeciwdrgawkowe i neuroprotekcyjne działanie VPA. Dodatkowo, te badania wskazując na mechanizm w jakim dochodzi do aktywacji szlaku kynureninowego, (a który związany jest z wypieraniem TRP z albumin przez VPA) dają nadzieję na wykorzystanie opisanego mechanizmu do Strona 12
uzyskiwania silniejszych wzrostów KYNA w OUN, a tym samym wywierania działania przeciwpadaczkowego i neuroprotekcyjnego. Konsekwencją tych obserwacji było postawienie pytania o rolę interakcji pomiędzy kwasami tłuszczowymi a TRP w mechanizmie przeciwdrgawkowego działania diety ketogennej. Zaobserwowaliśmy, że kwasy tłuszczowe (będące podstawowym składnikiem diety ketogennej) poprzez zwiększanie wolnej frakcji TRP, nasilają jego pasaż do OUN, co wiąże się z szeregiem zmian o charakterze biochemicznym, w tym między innymi z aktywacją szlaku kynureninowego. Dodatkowo, stwierdziłem, że zahamowanie przechodzenia TRP do OUN, wiązało się ze zniesieniem przeciwdrgawkowego działania kwasów tłuszczowych. Obserwacje te pozwoliły na zaproponowanie oryginalnej hipotezy dotyczącej mechanizmu działania diety ketogennej, opartej na przesunięciach w równowadze potencjału redoks pomiędzy cytoplazmą a mitochondriami w neuronach oraz komórkach glejowych, co może przekładać się na przeciwdrgawkowe działanie diety ketogennej. Potwierdzenie tej hipotezy w dalszych badaniach dawałoby szanse na zastąpienie tej źle tolerowalnej diety przez działania farmakologiczne wywołujące podobne skutki metaboliczne. Wnioski szczegółowe Potwierdzono udział KYNA w procesach epileptogenezy, przy czym wykazano że dynamika i kierunek zmian KYNA zależy od stopnia rozniecania drgawek oraz od struktury mózgu: o u zwierząt znajdujących się na pośrednich etapach rozniecenia drgawek za pomocą PTZ, obserwowano wzrost poziomu KYNA w korze gruszkowatej. o Następnie, w trakcie procesu rozniecania dochodziło do stopniowego spadku stężenia KYNA, przy czym zjawisko to było najsilniej wyrażone u zwierząt z w pełni roznieconym drgawkami w: jądrze ogoniastym, hipokampie, korze gruszkowatej oraz ciele migdałowatym Obserwacje te sugerują, że obniżenie stężenia KYNA w mózgu ułatwia propagację oraz pełną ekspresję drgawek. Opisano nowy mechanizm działania jednego z najpowszechniej stosowanych leków przeciwpadaczkowych VPA: o VPA powoduje silne wyparcie TRP z jego miejsc wiązania na albuminach, zwiększając tym samym poziom wolnego TRP z następową zmianą aktywności szlaku kynureninowego o VPA w sposób dawko-zależny zwiększa ośrodkowe stężenie KYNA, endogennego związku, wykazującego działanie przeciwdrgawkowe i neuroprotekcyjne Strona 13
o VPA prowadziło do wzrostu stężeń AAA oraz spadku stężeń BCAA, co w konsekwencji powodowało obniżenie ośrodkowego wskaźnika BCAA/AAA oraz zwiększenie mózgowych stężeń NA, DA oraz 5-HT. Obserwacje te sugerują, że przeciwpadaczkowe i neuroprotekcyjne właściwości VPA, przynajmniej częściowo, mogą być konsekwencją wzrostu aktywności szlaku kynureninowego oraz spadku ośrodkowego wskaźnika BCAA/AAA Wykazano, że przeciwdrgawkowe działanie kwasów tłuszczowych wchodzących w skład diety ketogennej, co najmniej w części, zależy od nasilenia transportu TRP do OUN o Zaproponowano, oryginalną hipotezę dotyczącą mechanizmu działania KD, opartą na przesunięciu równowagi potencjału redoks pomiędzy frakcją mitochondrialną i cytoplazmatyczną co może mieć wpływ na otwarcie kanałów potasowych K ATP, skutkując hyperpolaryzacją błony komórkowej neuronu oraz działaniem przeciwdrgawkowym. 5. OMÓWIENIE POZOSTAŁYCH OSIĄGNIĘĆ NAUKOWO-BADAWCZYCH a) DANE BIBLIOMETRYCZNE Mój dorobek naukowy obejmuje: o 73 prace w czasopismach polskich i zagranicznych, w tym 63 prace oryginalne oraz 10 poglądowych. Sumaryczny impact factor czasopism, w których opublikowano prace według listy Journal Citation Reports (JCR), zgodnie z datą opublikowania wynosi 154,654. Liczba cytowań publikacji bez autocytowań wynosi 743 (805 według bazy Scopus), indeks Hirscha według bazy Web of Science (WoS) wynosi 16 (17 według bazy Scopus). Szczegółowa analiza bibliometryczna znajduje się w załączniku nr 9. b) OPIS I TEMATYKA GŁÓWNYCH KIERUNKÓW POZOSTAŁYCH BADAŃ NAUKOWYCH Ocena roli receptorów metabotropowych dla kwasu glutaminowego (mglurs) w formowaniu się reakcji lękowych W tym cyklu prac skupiliśmy się na zagadnieniach dotyczących roli, jaką odgrywają mglurs w powstawaniu reakcji lękowych. W pierwszej kolejności podjęta została próba odpowiedzi na pytanie, w jaki sposób mglurs grupy I (receptory o charakterze głównie pobudzającym) pośredniczą w Strona 14
konsolidacji śladów pamięciowych powstających podczas warunkowania się reakcji lękowej? Wykazaliśmy, że dohipokampalne podanie DHPG (agonisty mglur1 i mglur5) zmniejszało, natomiast podania AIDA (antagonisty mglur1) zwiększało, późniejszą ekspresję reakcji lękowej. Natomiast podanie ligandów selektywnych wobec mglur5 (CHPG i MPEP) nie modyfikowało reakcji lękowej. Przyjęty przez nas schemat podania ligandów mglurs, a mianowicie podania następującebezpośrednio po sesji treningowej, podczas której rozpoczyna się proces warunkowania reakcji lękowej wskazuje, że odpowiednia aktywność mglurs jest niezbędna do utrzymywania adekwatnego poziomu wzbudzenia układów neuronalnych, koniecznego dla prawidłowego formowania się procesów uczenia i pamięci prowadzących do warunkowania się reakcji lękowych. Maciejak P., Taracha E., Lehner M., Szyndler J., Bidziński A., Skórzewska A., Wisłowska A., Zienowicz M., Płaźnik A. Hippocampal mglur1 and consolidation of contextual fear conditioning. Brain Res Bull 2003, 62, 39-45. Pewnym potwierdzeniem takiej interpretacji uzyskanych wyników były obserwacje pochodzące z kolejnego badania, w którym w podobny jak wyżej sposób analizowaliśmy efekty dohipokampalnych podań ligandów mglur1 i mglur5, lecz tym razem u zwierząt z roznieconymi wcześniej drgawkami (przy zastosowaniu PTZ). Zaobserwowaliśmy przeciwstawny wpływ antagonisty mglur1 (AIDA) na ekspresję reakcji lękowej u zwierząt z roznieconymi drgawkami w porównaniu do zwierząt kontrolnych (u zwierząt z roznieconymi drgawkami podanie AIDA zmniejszało ekspresję lęku). Dodatkowo zaobserwowano, że u zwierząt z roznieconymi drgawkami dochodzi do zmian współczynnika Glu/GABA, będącego teoretycznym markerem wzbudzenia. Otrzymane wyniki wykazały, że w sytuacji wzmożonej pobudliwości neuronalnej, jaka ma miejsce w przebiegu procesu rozniecania drgawek, dochodzi do modyfikowania funkcji mglur1, co prowadzi do zmienionej odpowiedzi na ligandy tego receptora. Wydaje się, że zmieniona funkcja mglur1 wynika z konieczności wytworzenia się nowej homeostazy, powstającej w warunkach wzmożonej pobudliwości neuronalnej w przebiegu rozniecania drgawek. Maciejak P., Lehner M., Turzyńska D., Szyndler J., A. Bidziński, E. Taracha, Sobolewska A., J. Walkowiak, A. Skórzewska, A. Wisłowska, A. Hamed, Płaźnik A. The opposite role of hippocampal mglur1 i fear conditioning in kindled and non-kindled rats. Brain Res 2008, 1187, 184-193. Ścisłe zaangażowanie mglurs grupy I w formowaniu i regulacji reakcji lękowych było przedmiotem kolejnego badania, w którym wykazaliśmy, że hamowanie aktywności mglurs grupy I skutkuje działaniami przeciwlękowymi w wielu testach behawioralnych. Jakkolwiek nie zaobserwowano efektu klasy dla całej grupy I mglurs, a przeciwlękowe efekty antagonistów receptora mglu1 (EMQMCM), które zależały od zastosowanego testu reakcji lękowej, były jakościowo różne od przeciwlękowego działania antagonistów mglur5 (MPEP i MTEP). Strona 15
Pietraszek M., Sukhanov I, Maciejak P, Szyndler J., Gravius A, Wisłowska A, Płaźnik A, Bespalov A, Danysz W. Anxiolytic-like effects of mglu1 and mglu5 receptor antagonists in rats. Eur J Pharmacol 2005, 514, 25-34 Przyjmując perspektywę badawczą, w której epileptogeneza postrzegana jest jako przejaw procesów neuroplastycznych, zdecydowaliśmy się przetestować hipotezę o znaczeniu grupy III mglur w procesach plastycznych związanych z kształtowaniem się fenotypu padaczkowego u zwierząt poddanych procesowi rozniecania drgawek (przy pomocy PTZ). W przyjętym przez nas schemacie eksperymentalnym ligandy grupy III mglur (CPPG- antagonista głównie grupy III mglur ; L-AP4 - agonista grupy III mglur) były podawane dokomorowo w 30 min po każdorazowej iniekcji PTZ. Takie podejście pozwoliło nam na ocenę wpływu tych ligandów na konsolidacje zmian leżących u podstaw procesu rozniecania i związaną z tym z przebudową układów neuronalnych. Dodatkowo zbadaliśmy zmiany stężeń aminokwasów biorących udział w regulacji aktywności neuronalnej, w tym GLU, GABA, alaniny i tauryny, u swobodnie poruszających się szczurów z zastosowaniem techniki mikrodializy. Zaobserwowaliśmy, że powtarzalne podania CPPG bezpośrednio po podaniach PTZ znamiennie spowalniało proces rozniecania drgawek indukowanych podaniami PTZ (35 mg/kg, ip). L - AP4 nie wpływało w sposób znamienny na szybkość procesu rozniecania drgawek, jakkolwiek obserwowano nieznaczne przyśpieszenie tego procesu. Wyjściowe stężenia glutaminianu, GABA, alaniny, tauryny oraz stosunek GLU/GABA były podwyższone w hipokampach szczurów z roznieconymi drgawkami. Obserwacje nasze wskazują, że w przebiegu rozniecania drgawek dochodzi do wystąpienia zmian w procesach regulacji uwalniania neuroprzekaźników w kierunku procesów pobudzeniowych oraz wykazało istotną rolę grupy III mglur w tych procesach. Ważną obserwacją wynikającą z naszego badania jest także fakt, że modyfikacja przekaźnictwa glutaminergicznego przy pomocy ligandów grupy III mglur determinuje zmiany w procesach związanych z formowaniem się i konsolidacją przebudowy neuroplastycznej mózgu. Maciejak P, Szyndler J, Turzyńska D, Sobolewska A, Taracha E, Skórzewska A, Lehner M, Bidziński A, Hamed A, Wisłowska-Stanek A, Płaźnik A. The effects of group III mglur ligands on pentylenetetrazolinduced kindling of seizures and hippocampal amino acids concentration. Brain Res. 2009 Jul 28;1282:20-7. Procesy epileptogenezy prowadzą stopniowo do przebudowania normalnie funkcjonujących sieci neuronalnych w sieci o nadmiernej pobudliwości. Procesy tej przebudowy mogą być postrzegane jako forma patologicznej plastyczności podlegającej ogólnym zasadom regulującym takie procesy, jak np. zależność od syntezy białka de novo. Przyjęcie takiej perspektywy w poszukiwaniu Strona 16
rozwiązań terapeutycznych, pozwala na postawianie prowokacyjnego pytania czy można oduczyć padaczki? Biorąc pod uwagę, powyższe fakty podjęliśmy próbę oceny wpływu inhibitora syntezy białek (CHX - cycloheximid jest uznanym inhibitorem biosyntezy białek w organizmach eukariotycznych), na ekspresję i "rekonsolidację drgawek rozniecanych wywołanych podaniami PTZ. Dodatkowo dla celów porównawczych, badaliśmy wpływ wybranej dawki CHX (125 µg/5µl) na rekonsolidację śladu pamięciowego, w innym modelu uczenia (nabywanie reakcji freezing w teście lęku warunkowanego). Otrzymane wyniki wykazały, że CHX podany wielokrotnie u zwierząt z roznieconymi drgawkami bezpośrednio po kolejnych trzech sesjach drgawek wywołanych podaniem PTZ, nie modyfikował intensywności drgawek. Z drugiej zaś strony, zaobserwowaliśmy, że CHX znacznie osłabiał intensywność drgawek, gdy był podawany na godzinę przed podaniem PTZ (działanie przeciwdrgawkowe). Ta sama jednak dawka CHX (125 ug) była wystarczająca do wywołania silnego hamowania syntezy białek indukowanej podaniem PTZ (badane jako ekspresja białka c-fos, oceniana techniką Western blot) oraz znacznego złagodzenia ekspresji reakcji lęku warunkowanego badanej po 24 h od podania CHX. Wyniki tego badania nie potwierdziły wprost hipotezy, o podobieństwie mechanizmów dotyczących znaczenia syntezy białek de novo podczas ekspresji i rekonsolidacji procesów plastycznych w przebiegu drgawek rozniecanych przy pomocy PTZ oraz procesu rekonsolidacji w teście lęku warunkowanego. Wyniki te, jednak nie negują całkowicie możliwości, że mechanizmy tworzenia śladów pamięciowych modelowanych w przez zjawisko LTP nie mają znaczenia dla procesu rozniecania drgawek. Maciejak P, Szyndler J, Lehner M, Turzyńska D, Sobolewska A, Bidziński A, Płaźnik A. The differential effects of protein synthesis inhibition on the expression and reconsolidation of pentylenetetrazole kindled seizures. Epilepsy Behav. 2010 Jul;18(3):193-200. Ocena zmian behawioralnych, strukturalnych i biochemicznych zachodzących w przebiegu modelowania drgawek rozniecanych W szeregu kolejnych badań skupiliśmy się nad poszukiwaniem zmian behawioralnych oraz funkcjonalnych towarzyszących procesowi epileptogenezy, modelowanej procedurą rozniecania drgawek. Jedną z pierwszych obserwacji pochodzących z tej grupy eksperymentów było stwierdzenie, że rozniecanie drgawek wiążę się ze zmianą stanu emocjonalnego zwierząt, przejawiającą się zmniejszeniem czasu reakcji znieruchomienia oraz całkowitego czasu wokalizacji ultradźwiękowej w paśmie awersyjnym w odpowiedzi na awersyjnie uwarunkowany kontekst. Zmianom tym Strona 17
towarzyszyło zaburzenie w obrębie przekaźnictwa monoaminergicznego, wskazując tym samym na zaangażowanie tego systemu neuroprzekaźnikowego w zmiany stanu emocjonalnego zwierząt z drgawkami rozniecanymi. Szyndler J., Rok P., Maciejak P., Walkowiak J., Członkowska A., Sienkiewicz-Jarosz H., Wisłowska A., Zienowicz M., Lehner M., Bidziński A., Kostowski W., Płaźnik A. Effects of pentylenetetrazol-induced kindling of seizures on rat emotional behavior and brain monoaminergic systems. Pharmacol Biochem Behav 2002, 73, 851-861. W kolejnym badaniu poszerzyliśmy nasze obserwacje o bardziej szczegółową ocenę przekaźnictwa serotoninergicznego w OUN u zwierząt z drgawkami rozniecanymi. Zaobserwowaliśmy spadek ilości transporterów dla serotoniny (mierzonej wiązaniem znakowanego trytem citalopramu, metodą autoradiografii) w rejonie CA3 oraz zakręcie zębatym hipokampa. Szyndler J., Wierzba-Bobrowicz T., Maciejak P., Siemiątkowski M., Rok P., Lehner M., Członkowska A.I., Bidziński A., Wisłowska A., Zienowicz M., Płaźnik A. Pentylenetetrazol-kindling of seizures selectively decreases [3H]-citalopram binding in the CA-3 area of rat hippocampus. Neurosci Lett 2002, 335, 49-53. W poszukiwaniu odpowiedzi na pytanie o uniwersalność obserwowanych zjawisk behawioralnobiochemicznych w przebiegu procesu rozniecania drgawek, kolejne badanie oparliśmy na modelu stanu padaczkowego wywołanego podaniami pilokarpiny. Zaobserwowaliśmy, że u zwierząt prezentujących spontaniczne napady drgawek dochodzi do wzrostu aktywności motorycznej, skrócenia reakcji znieruchomienia oraz zmniejszenia wokalizacji ultradźwiękowej w paśmie awersyjnym. Nie stwierdzono natomiast istotnych zmian w przekaźnictwie serotoninergicznym i dopaminergicznym w ocenianych strukturach mózgu. Zmianom behawioralnym towarzyszyła przebudowa neuropatologiczna struktur hipokampa, kory gruszkowatej i jąder wzgórza. Obserwacje te sugerują więc, że dysfunkcja struktur układu limbicznego może brać udział w powstawaniu zaburzeń emocjonalnych związanych z napadami drgawek. Szyndler J., Wierzba-Bobrowicz T., Skórzewska A., Maciejak P., Walkowiak J., Lechowicz W., Turzyńska D., Bidziński A., Płaźnik A. Behavioral, biomedical and histological studies in a model of pilocarpine-induced spontaneous recurrent seizures. Pharmacol Biochem Behav 2005, 81, 15-23. W kontekście tych obserwacji, bardziej klarowne wydają się wyniki kolejnego eksperymentu, w którym badaliśmy wpływ procesu rozniecania na procesy pamięciowe. Zaobserwowaliśmy mianowicie, że proces rozniecania drgawek, modelujący procesy epileptogenezy, wiąże się z występowaniem deficytów pamięci (mierzonych w teście labiryntu Morrisa), a zmianom tym towarzyszyły spadki stężenia kwasu glutaminowego, alaniny oraz glicyny. Obserwacje te wskazują, że obok bezpośrednich zmian w przekaźnictwie glutaminianergicznym, także zaburzenia równowagi w Strona 18
aminokwasach zaangażowanych pośrednio w metabolizm kwasu glutaminowego są istotne w przebiegu zaburzeń pamięci wywołanych rozniecaniem drgawek. Szyndler J., Piechal A., Blecharz-Klin K., Skórzewska A., Maciejak P., Walkowiak J., Turzyńska D., Bidziński A., Płaźnik A., Widy-Tyszkiewicz E. Effect of kindled seizures on rat behavior in water Morris maze test and amino acid concentrations in brain structures. Pharmacol Rep 2006, 58, 75-82. Trwałość modyfikacji środowiska aminokwasowego w obrębie OUN, będących efektem procesu epileptogenezy, potwierdziliśmy badając poziom wybranych aminokwasów w stanie stacjonarnym (w okresie międzynapadowym). Zaobserwowaliśmy istotny wzrost kwasu asparaginowego i glutaminowego, alaniny, argininy, tauryny oraz obniżenie stężenia GABA. Zmiany te implikowały zmiany w teoretycznym wskaźniku pobudliwości neuronalnej Glu/GABA, którego wzrost sugeruje trwały wzrost pobudliwości neuronalnej w wyniku rozniecania drgawek. Szyndler J., Maciejak P., Turzyńska D., Sobolewska A., Lehner M., Taracha E., Walkowiak J, Skórzewska A., Wisłowska-Stanek A., Hamed A., Bidziński A., Płaźnik A. Changes in the concentration of amino acid in the hippocampus of pentylenetetrazole-kindled rats. Neurosci Lett 2008, 439, 245-249. Poszukiwanie szczegółowej lokalizacji anatomicznej zmian neuropatologicznych zachodzących w przebiegu drgawek rozniecanych. W tym celu, w pierwszym z naszych badań wykorzystaliśmy zjawisko aktywacji ekspresji białka c- Fos jako markera aktywności neuronalnej. Badanie ekspresji białka c-fos przeprowadzono u zwierząt, które osiągnęły różny behawioralnie stopień rozniecania drgawek (wg. skali Racine`a), dając w ten sposób możliwość wyodrębnienia reprezentacji strukturalnej charakterystycznej dla określonego etapu rozniecania drgawek. Najwcześniejsze zmiany w trakcie rozniecania (stopień 2 wg. skali Racine`a) drgawek obserwowano w jądrze półleżącym przegrody, prążkowiu oraz w korach gruszkowatej i przedczołowej. Wraz z nasileniem procesu rozniecania (stopień 3 wg. skali Racine`a) obserwowano wzrost aktywności w korze śródwęchowej, ciałach migdałowatych (jądrze centralnym) oraz w jądrze bocznym przegrody. Natomiast u zwierząt, u których występowały duże napady toniczno-kloniczne (stopień 4 i 5 wg. skali Racine`a), obserwowano aktywacje szeregu struktur, z dominującą rolą zakrętu zębatego hipokampów. Wyniki tego badania pozwoliły na wstępne mapowanie struktur OUN podlegających aktywacji w przebiegu rozniecania drgawek przy pomocy PTZ, wskazując na struktury najszybciej odpowiadające na rozniecanie drgawek oraz struktury później aktywowane, rekrutowane dopiero powtarzalnymi podaniami PTZ. Strona 19
Szyndler J., Maciejak P., Turzyńska D., Sobolewska A., Taracha E., Skórzewska A., Lehner M., Bidziński A., Hamed A., Wisłowska-Stanek A., Krząścik P., Płaźnik A. Mapping of c-fos expression in the rat brain during the evolution of pentylenetetrazol-kindled seizures. Epilepsy Behav 2009, 16, 216-224. Kontynuacją omawianego badania była próba odpowiedzi na pytanie, czy schematowi aktywacji strukturalnej ocenianej na poziomie ekspresji białka c-fos towarzyszyć będą zmiany biochemiczne w poziomach neurotransmiterów monoaminergicznych i aminokwasowych. Zaobserwowaliśmy, że proces rozniecania drgawek wiąże się ze zmianami w przekaźnictwie noradrenergicznym, serotoninergicznym i dopaminergicznym w korze gruszkowatej, korze śródwęchowej, korze przedczołowej oraz w hipokampie. Najsilniejsza zmiana poziomu neuroprzekaźników dotyczyła przekaźnictwa serotoninergicznego, które charakteryzowało się jego nasileniem, szczególnie w stopniu 5 rozniecania drgawek i dotyczyło niemal wszystkich badanych struktur. Zmiany te mogą wskazywać na adaptacyjną rolę układu serotoninergicznego. Wzrostowi przekaźnictwa serotoninergicznego u zwierząt z 5 stopniem rozniecania drgawek towarzyszyło obniżenie metabolitów dopaminy DOPAC i HVA w korze gruszkowatej, wskazując na spadek lokalnego poziomu dopaminy, będącego konsekwencją procesu rozniecania drgawek, co jak się wydaje może przyczyniać się do promowania procesu drgawkotwórczego. Szyndler J., Maciejak P., Turzyńska D., Sobolewska A., Bidziński A., Płaźnik A. Time course of changes in the concentrations of monoamines in the brain structures of pentylenetetrazole-kindled rats. J Neural Transm 2010, 117, 707-718. W poszukiwaniu ewentualnych zmian w poziomach aminokwasów w strukturach mózgu u zwierząt poddanych procedurze rozniecania drgawek skupiliśmy się zarówno na aminokwasach o charakterze pobudzającym kwasie glutaminowym i alaninie, jak i o charakterze hamującym - GABA i taurynie. Do zmian, które ujawniły się na najwcześniejszych etapach rozniecania drgawek, należały wzrost stężenia kwasu glutaminowego, alaniny, tauryny i GABA w korze śródwęchowej i miały one charakter zmiany stałej, utrzymującej się wraz z postępem procesu rozniecania. U zwierząt, które osiągnęły stopień 5 rozniecania drgawek, obserwowano dodatkowo wzrost stężenia kwasu glutaminowego w ciele migdałowatym, jądrze półleżącym oraz korze gruszkowatej, czemu towarzyszył wzrost poziomu alaniny (stężenie alaniny było dodatkowo podwyższone w hipokampie oraz prążkowiu). Z uzyskanych wyników zarysowuje się obraz zmian w przekaźnikach aminokwasowych, wskazujący z jednej strony na przewagę przekaźnictwa pobudzającego, szczególnie w takich strukturach jak: kory śródwęchowa, przedczołowa i gruszkowata, z drugiej zaś strony obserwowano wzrost poziomu tauryny w ciele migdałowatym, jądrze półleżącym przegrody, korze śródwęchowej i korze gruszkowatej, co może być, jak się wydaje, przejawem mechanizmu Strona 20
obronnego przeciwko ekscytotoksyczności wywołanej wzrostem aktywności aminokwasów pobudzających: Maciejak P., Szyndler J., Turzyńska D., Sobolewska A., Bidziński A., Kołosowska K., Płaźnik A. Time course of change in the concentrations of amino acids in the brain structures of pentylenetetrazolekindled rats Brain Res 2010, 1342, 150-159. Podsumowując tę serię badań wydaje się, że uzyskane przez nas wyniki wskazują na istotne zmiany funkcjonalne zachodzące podczas procesu rozniecania drgawek, przejawiające się sekwencyjnymi zmianami neuroprzekaźnictwa monoaminergicznego i aminokwasowego w sieciach neuronalnych poszczególnych struktur mózgu. Obserwowany brak jednoczasowości zmian we wszystkich strukturach mózgu, szczególnie na niższych stopniach rozniecania drgawek, wskazuję na pewną autonomiczność sieci neuronalnych określonych struktur mózgu w adaptacji na silne i przetrwałe pobudzenie. Wraz ze stopniowym nasilaniem rozniecenia drgawek, autonomiczność ta wydaje się być przełamywana, a obserwowane zmiany biochemiczne stają się bardziej powszechne i dotyczą większej liczby struktur. Innym aspektem oceny zmian biochemicznych spowodowanych procesem epileptogenezy, był wpływ drgawek rozniecanych na aktywność wybranych elementów szlaku kynureninergicznego. Ocenie poddano zmiany stężeń kwasu kynureninergicznego (KYNA) oaz jego bezpośredniego prekursora - tryptofanu - w przebiegu procesu rozniecania elektrycznego drgawek w hipokampach. Zaobserwowano, że rozniecanie elektryczne drgawek wiąże się ze wzrostem metabolizmu tryptofanu w kierunku tworzenia KYNA zarówno w hipokampach, jak i ciałach migdałowatych. W ciałach migdałowatych zmianom tym towarzyszyło dodatkowo zaburzenie równowagi pomiędzy układami pobudzającymi i hamującymi, mierzone wzrostem współczynnika GLU/ GABA. W tym kontekście wzrost stężenia KYNA wydaje się być reaktywnym przejawem obronnej reakcji nadmiernie pobudzonych układów neuronalnych. Szyndler J., Maciejak P., Turzyńska D., Sobolewska A., J. Walkowiak, Płaźnik A. The effects of electrical hippocampal kindling of seizures on amino acids and kynurenic acid concentrations in brain structures. J Neural Transm 2012, 119, 141-149. Proces epileptogenezy postrzegany jest także jako przykład procesu patologicznej plastyczności. Dlatego interesujące wydało nam się, czy sztafeta strukturalna dotycząca aktywacji poszczególnych struktur OUN znajduje odbicie także w nasileniu procesów neuroplastycznych. W tym celu użyto technik immunocytochemicznych identyfikujących ekspresję białek egr-1 (early growth response gene) oraz arc (activity regulated cytoskeleton-associated gene), zaangażowanych bezpośrednio w procesy przebudowy neuroplastycznej. Zarówno białko Egr1, jak i białko Arc, są istotne dla procesów długotrwałej potencjalizacji synaptycznej (LTP), jak i dla zmian adaptacyjnych w Strona 21
cytoszkielecie synaps. Zaobserwowaliśmy, że ekspresja Egr1 wzrasta w przebiegu rozniecania drgawek, przy czym wzrosty te są najszybciej zauważalne w korach śródwęchowej i gruszkowatej, w rejonie CA3 i zakręcie zębatym hipokampa oraz jądrze podstawno-bocznym ciała migdałowatego. W przypadku białka Arc także obserwowano jego wzrosty w przebiegu rozniecania drgawek. Nasilenie jego ekspresji obserwowane było głównie w jądrze podstawno-bocznym ciała migdałowatego, korze śródwęchowej oraz zakręcie zębatym hipokampa. W sensie ilościowym maksymalny wzrost stężenia białka Arc widoczny był w zakręcie zębatym hipokampa u zwierząt w pełni roznieconych. Otrzymane wyniki wskazują, że strukturami, w których najwcześniej i z największym nasileniem dochodzi do wzmożenia procesów plastycznych w przebiegu rozniecania drgawek, są kory gruszkowata i śródwęchowa, po czym dochodzi do silnych zmian neuroplastycznych także w wielu innych strukturach OUN, ze szczególnym ich nasileniem w zakręcie zębatym hipokampa. Otrzymane wyniki korespondują w dużej części z wcześniejszymi wynikami biochemicznymi i immunocytochemicznymi, wskazując na ścisłą zależność funkcjonalno-strukturalną w obrębie sieci neuronalnych poszczególnych struktur OUN, prowadzącą do formowania się mózgu epileptycznego. Szyndler J., Maciejak P., Turzyńska D., Sobolewska A., J. Walkowiak, Płaźnik A.Changes in the Egr1 and Arc expression in brain structures of pentylenetetrazole-kindled rats. Pharm Rep 2013, 65, 368 378. Ocena wpływu neurosteroidów na wybrane funkcję ośrodkowego układu nerwowego W innej grupie naszych badań swoją uwagę skupiliśmy na zagadnieniach dotyczących wpływu ośrodkowo aktywnych steroidów na funkcję ośrodkowego układu nerwowego. W jednym z naszych pierwszych badań ocenie poddaliśmy skutki dokomorowych podań midazolamu - pełnego agonisty receptorów benzodiazepinowych oraz neurosteroidu - allopregnanolonu - będącego pozytywnym modulatorem receptorów GABA-A, na behawioralne i biochemiczne efekty wywołane podaniami związku drgawkotwórczego -pikrotoksyny. Zaobserwowaliśmy, że pojedyncze podanie midazolamu i allopregnanolonu hamowało w podobnym stopniu napady drgawkowe wywołane podaniem pikrotoksyny, natomiast w sytuacjach podań przewlekłych, zarówno midazolamu, jak i allopregnanolonu, obserwowaliśmy stopniową tolerancje na ich przeciwdrgawkowe działanie. Członkowska AI, Krzaścik P, Sienkiewicz-Jarosz H, Siemiatkowski M, Szyndler J, Maciejak P, Bidziński A, Płaźnik. Tolerance to the anticonvulsant activity of midazolam and allopregnanolone in a model of picrotoxin seizures.a Eur J Pharmacol. 2001 Aug 10;425(2):121-7. Dodatkowo zaobserwowaliśmy, że pojedyncze podanie allopregnanolonu silniej w porównaniu do midazolamu antagonizuje biochemiczne działania pikrotoksyny, prowadzące do obniżenia aktywności dopaminergicznej i serotoninergicznej w prążkowiu i korze czołowej myszy. Wyniki te potwierdziły wcześniejsze obserwacje wskazujące na bardzo podobny profil ośrodkowego Strona 22