Patrycja Pabiś. Aktywność farmakologiczna ligandów receptora histaminowego H3 w testach in vivo na zwierzętach

Transkrypt

1 UNIWERSYTET JAGIELLOŃSKI COLLEGIUM MEDICUM WYDZIAŁ FARMACEUTYCZNY Patrycja Pabiś Aktywność farmakologiczna ligandów receptora histaminowego H3 w testach in vivo na zwierzętach Praca magisterska wykonana w Katedrze Farmakodynamiki pod kierownictwem naukowym Prof. zw. dr hab. Barbary Filipek i opieką dr Szczepana Mogilskiego Kraków :

2 Serdecznie dziękuję Pani prof. zw. dr hab. Barbarze Filipek za możliwość realizacji pracy magisterskiej w Katedrze Farmakodynamiki UJCM oraz za ogromną wiedzę i pasję do pracy. Składam podziękowania Panu dr Szczepanowi Mogilskiemu za wsparcie merytoryczne, poświęcony czas oraz życzliwą pomoc w trakcie wykonywanych badań i pisania niniejszej pracy. Serdeczne dziękuję Pani Agnieszce Niedbał oraz Pani Teresie Dobrut za pomoc w przeprowadzeniu badań. 2 2:

3 Serdecznie dziękuję moim Rodzicom oraz Siostrze za okazane wsparcie podczas pisania niniejszej pracy jak również w trakcie całego okresu studiów. 3 3:

4 Spis treści I. Streszczenie:... 6 II. Abstract... 7 III. Wstęp Definicja pamięci i rys historyczny Struktury mózgu związane z formowaniem i przechowywaniem pamięci pogląd anatomiczny HIPOKAMP CIAŁO MIGDAŁOWATE (łac. Amygdala) Rodzaje pamięci Pamięć krótkotrwała Pamięć długotrwała Pamięć deklaratywna Pamięć proceduralna Pamięć emocji Procesy formowania pamięci Model powstawania pamięci u kręgowców Model formowania pamięci u Aplysia Californica Receptory zaangażowane w procesy pamięciowe Receptory związane z glutaminianem Receptory NMDA Receptory AMPA Receptory kainianowe Receptory GABA Noradrenalina i receptory noradrenergiczne Receptory 5-HT Receptory dopaminowe Acetylocholina :

5 Receptory nikotynowe Receptory muskarynowe HISTAMINA Receptory H Receptory H Receptory H Receptory H IV. Cel pracy V. Materiały Badane związki Stosowane odczynniki Zwierzęta Aparatura Analiza statystyczna wyników VI. Metodyka Test biernego unikania (Passive avoidance) Basen Morrisa (Morris Water Maze MWM) Test Wodnego Labiryntu Promienistego (Radial-Arm Water Maze) VII. Wyniki Wpływ badanych związków na proces uczenia się i pamięć w teście Passive avoidance Wpływ badanych związków na proces uczenia się i pamięć w teście Morris Water Maze Wpływ badanych związków na procesy pamięciowe w Wodnym Labiryncie Promienistym IX. Wnioski: :

6 I. Streszczenie: Celem pracy było zbadanie aktywności nowych ligandów receptora H3, będących odwrotnymi agonistami receptora, w kontekście ich wpływu na poprawę procesów pamięciowych. W tym celu poszerzono metodykę badań dla związków DL76 oraz E153, dla których wykonano test Labiryntu Wodnego Morrisa oraz Test Labiryntu Promienistego. Dla nowych związków E150, E151, E162 i E165 wykonano test Passive avoidance, w celu wstępnej oceny ich wpływu na procesy zapamiętywania. Badania wykonano na myszach u których indukowano zaburzenia pamięci poprzez podanie skopolaminy. Uzyskane wyniki wykazały znaczną aktywność związku E153 w teście Labiryntu Wodnego Morrisa oraz Labiryntu Promienistego uzyskując znamienne statystycznie skrócenie czasu wejścia na platformę w kolejnych dniach eksperymentu oraz znacznie mniejszą aktywność związku DL76 w wyżej wymienionych testach. Związki E150, E151, E162 i E165 w sposób umiarkowany wydłużały czas latencji w teście Passive avoidance, wykazując tym samym korzystny wpływ na zaburzone skopolaminą procesy pamięciowe u myszy. Największą aktywność w tym teście wykazał związek E :

7 II. Abstract The aim of the research was to determine the potential effect of H3 receptor antagonists/inverse agonists on memory deficit induced by scopolamine. We carried out three different tests: Morris Water Maze and Radial-Arm Water Maze to assess the influence of DL76 and E153 compounds on spatial memory, and Passive avoidance test to evaluate the effect of newly investigated compounds E150, E151, E162 and E165 on emotional memory and learning. In these three test, mice with scopolamine induced memory impairment were used. Results obtained from Radial-Arm Water Maze and Morris-Water Maze pointed at the higher activity of E153 compound comparing to DL76 compound because of statistically significant shortened time of a platform seeking. Passive avoidance test demonstrated that all new compounds moderately prolonged the latency time comparing to the control group with memory impairment induced by scopolamine. The finding pointed at the beneficial influence of tested compounds on learning and memory, impaired by scopolamine in mice. E165 showed the highest activity among four tested compounds. 7 7:

8 III. Wstęp 1. Definicja pamięci i rys historyczny Pojęcie pamięci i potrzeba poznania mechanizmów składających się na ten proces funkcjonują już od bardzo dawna w świadomości naukowców. Już w starożytnej Grecji, dwaj najsłynniejsi filozofowie Platon i Arystoteles poruszali problem umiejscowienia ludzkich myśli, skłaniając się ku najważniejszym organom sercu (Arystoteles) oraz mózgowi (Platon). Natomiast wiek XVI przyniósł zapoczątkowanie badań nad umysłem w rozumieniu procesu mózgowego, a wiek XIX rozpoczął badania nad poznaniem funkcji poszczególnych struktur mózgu, które to badania trwają do dziś [1]. Definicja pamięci różni się w zależności od dziedziny nauki, jednak sprowadzają się one do podobnych wniosków, iż pamięć jest to system przekaźnictwa synaptycznego w mózgu, który przekształca bodźce ze środowiska zewnętrznego w sygnał elektryczny i chemiczny, wpływający na zmiany w obrębie ośrodkowego układu nerwowego, który to sygnał archiwizowany w odpowiednich strukturach mózgu lub nie, wpływa na zachowanie i odbieranie świata zewnętrznego. 8 8:

9 2. Struktury mózgu związane z formowaniem i przechowywaniem pamięci pogląd anatomiczny W formowanie pamięci zaangażowane są zróżnicowane struktury centralnego układu nerwowego, z których najważniejszą rolę pełnią: hipokamp, ciało migdałowate, kora płata czołowego i skroniowego, prążkowie, móżdżek, wzgórze i pień mózgu (Rys.1) [1]. Rys. 1. Budowa anatomiczna mózgu z wyszczególnieniem obszarów szczególnie zaangażowanych w formowanie pamięci. (Zmodyfikowano według Anatomia człowieka. Podręcznik dla studentów i lekarzy pod redakcją Najważniejszą W. Woźniaka [2]). strukturą w kontekście pamięci bez Najważniejszą strukturą w kontekście pamięci bez wątpienia pozostaje hipokamp wraz z ciałem migdałowatym, których zaangażowanie w procesy pamięciowe, pełni kluczową rolę i których zarówno cechy anatomiczne oraz funkcjonalne były, i są nadal, przedmiotem wielu szerokich badań HIPOKAMP Hipokamp (łac. Hippocampus) jest częścią układu limbicznego, topograficznie leżącego w obrębie płata skroniowego (łac. Lobi temporales), jednak pod względem czynnościowym należy do płata limbicznego (łac. Lobus limbicus) [2]. 9 9:

10 Strukturalnie formację hipokampa można podzielić na dwie główne części: hipokamp właściwy, trójwarstwowy obejmujący regiony CA1-CA3 oraz, według niektórych autorów, także zakręt zębaty hipokampa (łac. Gyrus dentatus). Drugim regionem strukturalnie i funkcjonalnie związanym z hipokampem właściwym (łac. Cornu Ammonis) jest pole przyhipokampowe, obejmujące węchomózgowie (korę śródwęchową; łac. Rhinencephalon) oraz podkładkę (łac. Subiculum) [2, 3]. Pętla aktywacji poszczególnych obszarów rozpoczyna się od powierzchniowej warstwy komórek gwiaździstych kory śródwęchowej, która odbiera informacje pochodzące z wzrokowej, słuchowej i somatoczuciowej kory nowej. Neurony Rys.2. Podział struktury hipokampa właściwego wraz z obszarem przyhipokampowym oraz droga wychodzące głównie z warstwy II pobudzeń w obrębie formacji hipokampa (schemat węchomózgowia dostarczają w ramce). EC węchomózgowie; Sub podkładka; informacje do komórek ziarnistych DG zakręt zębaty; CA1-CA3 obszary zakrętu zębatego oraz pośrednio hipokampa właściwego. [4]. łączą się z komórkami piramidowymi regionu CA3 hipokampa. Warstwy głębokie kory śródwęchowej (warstwy II i V) łączą się neuronalnie z komórkami piramidowymi regionu CA1, jednak ich udział w aktywacji i przekaźnictwie neuronalnym jest znikomy [3]. Od zakrętu zębatego neurony, szlakiem przeszywającym, docierają do komórek piramidowych regionu CA3 hipokampa. Szlak przeszywający (łac. tractus perforans) przez długi okres czasu był przedmiotem badań, jako miejsce bezpośrednio związane z formowaniem pamięci długotrwałej. Jednak, jak wykazano, jest to droga niezależna od receptorów NMDA (które pełnią kluczową rolę w pamięci długotrwałej), a zależy od innego typu receptorów dla glutaminianu presynaptycznych receptorów kainianowych [5;3;1]. W następnym etapie informacje z CA3 przechodzą bocznicami Schaffera do komórek piramidowych regionu CA1, co zależne jest już od aktywacji receptorów NMDA. Pętlę przekazu informacji, zamyka anatomiczne połączenie regionu CA1 hipokampa z podkładką i dalej, z korą śródwęchową. [1; 3]. Tylna część regionu CA1 wiąże się z komórkami przedniej 10 10:

11 części podkładki, która z kolei jest połączona z boczną częścią węchomózgowia. Podobnie łączy się przednia część CA1 z tylną częścią podkładki, które połączone są z przednią częścią kory śródwęchowej. Przetworzone przez hipokamp informacje są kierowane także do innych struktur mózgowych przede wszystkim do kory przedczołowej oraz bocznego pola przegrody. [3]. Czynność hipokampa regulowana jest przede wszystkim przez neuroprzekaźniki: serotoninę, noradrenalinę i dopaminę, ze względu na dużą koncentracje receptorów mających powinowactwo do wymienionych przekaźników w obrębie hipokampa. Bardzo istotny jest również wpływ wzgórza na hipokamp oraz przedniej części przegrody, która kontroluje funkcjonowanie hipokampa poprzez cholinergiczne i GABA-ergiczne połączenia [3] CIAŁO MIGDAŁOWATE (łac. Amygdala) Jest to struktura korowo-podkorowa, położona w obrębie przednio-przyśrodkowej części płata skroniowego (łac. Lobi temporales). Składa się z zespołu jąder, dzielonych na większe grupy, które to grupy dzielą się na mniejsze zespoły jąder [2]. Istnieje kilka podziałów ciała migdałowatego: jeden z nich wyróżnia dwa zespoły jąder ewolucyjnie starszy, związany z systemem węchowym korowo-przyśrodkowym oraz młodszy, związany z korą nową, zespół podstawno-boczny. [2]. Zespół korowo-przyśrodkowy obejmuje jądra: korowe (łac. Cortical nuclei), przyśrodkowe (łac. Medial nuclei) oraz centralne (łac. Central nuclei), podczas gdy zespół jąder podstawno-bocznych jądra: boczne (łac. Lateral nuclei), podstawne (łac. Nuclei basales) i poboczne podstawne (łac. Nuclei basolaterales). Inny podział, opracowany przez Price a wyróżnia trzy główne zespoły jąder: jądra podstawno-boczne, środkowe i korowe [6]. Rys. 3. Schemat dróg doprowadzających do poszczególnych części ciała migdałowatego. La jądro boczne; B jądro brzuszne; Ce jądro centralne; M jądro przyśrodkowe; itc zespół jąder 11 inkluzyjnych. [8] 11:

12 Swanson i Petrovick stworzyli z kolei podział ciała migdałowatego pod względem funkcjonalności na: czołowo-skroniowy, autonomiczny, węchowy główny i węchowy poboczny. [7]. Najnowszy podział wg Swansona łączy się niejako z modelem funkcjonującym od dawna, bowiem jądro podstawno-boczne łączy się z tymi samymi strukturami co jądro korowe oraz posiada komórki takiego typu, jak te występujące w jądrze korowym części czołowo-skroniowej. Jądro centralne, embriologicznie wywodzące się z prążkowia (łac. Striatum), posiada komórki tego samego typu oraz jest zaangażowane w kontrolę systemu autonomicznego. Natomiast jądra korowe i przyśrodkowe, będące docelowymi strukturami dla połączeń węchowych, stanowią części głównego i pobocznego systemu węchowego. Główną strukturą odpowiedzialną za odbieranie impulsów z innych części mózgu jest jądro boczne. Otrzymuje ono impulsy czuciowe, słuchowe, smakowe, wzrokowe i węchowe. Impulsy wzrokowe i czuciowe są też kierowane do innych części mózgu, które to struktury odbierają także informacje z całej części mózgu, co pozwala na przetwarzanie różnego rodzaju impulsów w ciele migdałowatym. Impulsy słuchowe z kory słuchowej oraz wzgórza docierają do bocznej części ciała migdałowatego, która jest głównym ośrodkiem odbierającym informacje. Impulsy czuciowe Rys. 4. Schemat dróg odprowadzających z ciała migdałowatego oraz wewnętrznej komunikacji poszczególnych jąder. Oznaczenia jak w Rys. 3. [8] :

13 docierają do części grzbietowej, jednak później przesłane są do części brzuszno-bocznej i przyśrodkowej [8]. Pozostałe drogi doprowadzające do ciała migdałowatego rysunek nr 3. Głównym ośrodkiem połączeń wychodzących z ciała migdałowatego jest jądro centralne. Wysyła ono przetworzone informacje głównie do pnia mózgu (łac. Truncus cerebri) i podwzgórza, które zaangażowane są w regulację układu autonomicznego. Są to połączenia GABA-ergiczne, o charakterze hamującym. Kolejnym ważnym ośrodkiem jest jądro brzuszne, komunikujące się z prążkowiem oraz hipokampem za pomocą neuronów glutamatergicznych [6; 8]. Pozostałe połączenia wychodzące przedstawiono na rysunku nr 4. Funkcjonowanie ciała migdałowatego jako całości, opiera się na połączeniach wewnętrznych. Najważniejsze połączenia między jądrem bocznym a centralnym są jednak połączeniami nielicznymi. Istnieje jednak duża grupa połączeń pośrednich, łączących jądro boczne z innymi jądrami w obrębie ciała migdałowatego, które to jądra łączą się z jądrem centralnym [8]. Połączenia wewnętrzne przedstawiono na rysunku nr 4. W obrębie ciała migdałowatego występują neurotransmitery, które regulują funkcjonowanie ciała migdałowatego i przepływ informacji. Są to: noradrenalina, serotonina, dopamina, acetylocholina, glutaminian. Receptory dla ww. neuroprzekaźników są rozmieszczone w całym obszarze ciała migdałowatego z różną gęstością [8]. Stymulacja ciała migdałowatego wpływa na ujawniane emocji i wiązanie określonych bodźców z emocjonalnym ich odbiorem i, co za tym idzie, kaskadą zmian w obrębie układu autonomicznego. Jak wykazały badania uszkodzenie ciała migdałowatego objawiało się deficytem emocjonalnym badanych co obejmowało trudności w rozpoznawaniu i wykazywaniu strachu w określonych sytuacjach [9] :

14 aspektu. 3. Rodzaje pamięci Podział pamięci funkcjonujący obecnie występuje w zależności od rozpatrywanego Ze względu na czas trwania: pamięć krótkotrwałą pamięć długotrwałą 3.1. Pamięć krótkotrwała (STM Short Term Memory) Trwa od kilku minut do kilku godzin, wymagając ciągłego wzmocnienia, w celu jej utrzymywania. Wyróżnia się w tej podkategorii dwa typy pamięci krótkotrwałej: - pamięć związaną z zapamiętywaniem usłyszanych dźwięków oraz słów, które zostały wypowiedziane. Umożliwia ona m.in. zachowanie płynności mowy i spójność wypowiedzi. Tzw. Pętla fonologiczna związana jest z aktywnością kory lewej półkuli mózgu. - pamięć związana z magazynowaniem informacji wzrokowych, także przestrzennych. Pętla wzrokowo-przestrzenna obejmuje z kolei aktywność prawej półkuli mózgu [10] Pamięć długotrwała (LTM.- Long Term Memory) Z założenia jest pamięcią stabilną, trwającą przez długi okres czasu, a według części badaczy pamięcią wieczną. Pojemność pamięci długotrwałej jest nieograniczona lub co najmniej, znacznie większa od pojemności pamięci krótkotrwałej. Obejmuje korę płata czołowego i skroniowego, które pełnią rolę magazynów pamięci [1]. Ze względu na charakter nabytych informacji: Pamięć deklaratywna Pamięć proceduralna Pamięć emocji 14 14:

15 3.3. Pamięć deklaratywna Pamięć uświadomiona, w obrębie której wyróżnia się pamięć epizodyczną i pamięć semantyczną. o Pamięć epizodyczna związana z zapamiętywaniem osobistych zdarzeń w kontekście ich faktów. Obejmuje głównie okolice centralne płatów skroniowych, w tym także hipokampa, które według nowej koncepcji, pełnią funkcję biblioteki pamięci świeżej. Ponadto płaty czołowe rejestrujące i kodujące informacje, odpowiadają także za tworzenie powiązań z kontekstem wypowiedzi [1]. o Pamięć semantyczna wiąże się z wiedzą ogólną, faktami, które nie mają związku z osobistym doświadczeniem. Obejmuje ona przede wszystkim dolno-boczną część płatów skroniowych oraz płata czołowego kory mózgowej [1], jednak ze względu na charakter informacji zawartych w tym rodzaju pamięci, ich przechowywanie ma miejsce w różnych ośrodkach układu nerwowego [10]. Początkowo nie rozróżniano dwóch typów pamięci deklaratywnej, jednak przeprowadzone badania wykazały jej dychotomię pacjenci z ciężkimi zaburzeniami pamięci epizodycznej, zachowali wcześniej nabyte informacje odpowiadające pamięci semantycznej [1] Pamięć proceduralna Obejmuje zapamiętywanie automatyzmów ruchowych w codziennych czynnościach. Początkowo uczenie jest procesem świadomym, jednak z czasem nabyte umiejętności przechodzą do poziomu pamięci nieuświadomionej. Z pamięcią proceduralną związane są przede wszystkim struktury mózgu związane z układem ruchu, tj. móżdżek oraz jądra podstawy mózgu [1; 10] Pamięć emocji Pamięć związana z wpływem poszczególnych bodźców na ich emocjonalne zapamiętywanie. Najczęściej pamięć emocji rozpatruje się w kategorii strachu, który powstaje po zadziałaniu określonych bodźców. Miejscem jej powstawania są struktury podkorowe, gdzie główną rolę w formowaniu pamięci odgrywa ciało migdałowate (jako jedna ze składowych jąder podkorowych) [1] :

16 Niektórzy badacze wyróżniają ponadto model pamięci operacyjnej, jako osobny rodzaj pamięci, różnicując go z pamięcią krótko- i długo-trwałą. Według definicji pamięć operacyjna jest pamięcią trwającą przez krótki okres czasu i przechowującą/przetwarzającą informacje niezbędne do zaplanowania i wykonania określonego działania [11]. Według przeprowadzonych badań, pamięć operacyjna wpływa na wzmocnienie pamięci długotrwałej oraz jest przekształcana w pamięć długotrwałą, a także uszkodzenie struktur odpowiedzialnych za pamięć operacyjną, ma niekorzystny wpływ na formowanie pamięci długotrwałej [90]. Według innych badań powiązanie pamięci operacyjnej z poziomem inteligencji i osobniczo zróżnicowanymi zdolnościami wskazuje na jej rozdzielne rozpatrywanie z pamięcią krótkotrwałą, która nie koreluje ze zdolnościami czy poziomem inteligencji [11]. Pamięć operacyjna wiąże się ze strukturami korowymi i podkorowymi tworzenie pamięci obejmuje brzuszną część kory przedczołowej, natomiast przetwarzanie informacji część grzbietową kory przedczołowej. Z kolei przekształcanie pamięci operacyjnej w pamięć długotrwałą angażuje najprawdopodobniej hipokamp [12] :

17 4. Procesy formowania pamięci Formowanie pamięci jest procesem niezwykle złożonym, który obejmuje wiele procesów do siebie podobnych pod względem molekularnym, jednak często różniących się obszarem mózgu, w którym zachodzą. Wynika to z faktu, że różne typy pamięci powstają w nieco innych ośrodkach, które mogą angażować do tego procesu różne składowe. Z drugiej strony podział pamięci na krótko- i długotrwałą (a także roboczą czy też pamięć emocji) postawił pytanie czy obejmują one zupełnie różne szlaki sygnałowe, czy może proces powstawania pamięci długotrwałej jest kontynuacją procesu, stanowiącego o powstawaniu krótkotrwałej pamięci. Prawdą jest, że podstawą powstawania każdego typu pamięci są impulsy elektryczne przewodzone przez neurony, które prowadzą do aktywacji różnego typu receptorów, a te uruchamiają kaskadę szlaków metabolicznych i zmian synaptycznych Model powstawania pamięci u kręgowców Zmiany synaptyczne zachodzące pod wpływem impulsów, nazywane są jako długotrwałe wzmocnienie synaptyczne LTP (long-term potentiation) [13,14]. Jego podstawę sformułował Hebb w 1949 roku, znaną jako regułę Hebba. Według poczynionych przez niego badań uznał, że synapsy pomiędzy dwoma neuronami stają się silniejsze na skutek zachodzących w ich obrębie zmian tylko, jeśli zarówno część presynaptyczna jak i postsynaptyczna synapsy, ulegnie wzbudzeniu w tym samym czasie na skutek depolaryzacji [13]. Zadziałanie więc impulsu o odpowiedniej sile i zaindukowanie zmian w obrębie synapsy wywoła LTP. Istotny jest fakt, że LTP zaindukowany w jednej synapsie nie pojawia się w innych, nieaktywnych synapsach, z którymi ma kontakt. Jednak jeżeli słaba aktywacja jednej synapsy występuje wraz z silnym pobudzeniem sąsiadujących synaps, których miejscem docelowym jest ta sama komórka, wówczas obie drogi wywołują LTP [15]. Fazy LTP mogą wykazywać pewne różnice, w zależności od obszaru mózgu w którym zachodzą. Ponadto różne obszary mózgu są w ścisłym kontakcie funkcjonalnym i anatomicznym, co zapewnia ich ciągłą komunikację i wzajemną zależność. [16]. W większości jednak obejmują one hipokamp, a przede wszystkim obszary CA1 i CA3, stanowiące centrum dla pamięci deklaratywnej [17]. Wyróżnione dwie fazy LTP w hipokampie wczesna i późna różnią się niejako pod względem mechanizmu, głównie w kwestii przekaźników i sekwencji zmian i korelują z pojęciem pamięci krótko- i długotrwałej. Przyjmuje się, że wczesna faza LTP (E- LTP) jest podstawą pamięci krótkotrwałej, która aktywowana przez pojedyncze bodźce trwa 1-3h i nie wymaga syntezy nowych białek. Z kolei faza późna L-LTP wymaga co 17 17:

18 najmniej czterech bodźców o odpowiedniej sile i częstotliwości, trwa co najmniej 24h a synteza nowych białek i obecność kinazy białkowej zależnej od camp (PKA) są niezbędne do rozpoczęcia tej fazy [17]. Pomimo, iż kwestia niezależności STM od syntezy nowych białek została potwierdzona w licznych badaniach, ostatnie wyniki badań wykorzystujących myszy pozbawione genu kodującego białka CREB wykazały uszkodzenie zarówno pamięci krótkotrwałej jak i długotrwałej, sugerując zależność także STM od tego czynnika [18]. Wczesna faza LTP rozpoczyna się aktywacją receptorów AMPA w błonie postsynaptycznej pod wpływem uwalnianego glutaminianu z presynaptycznych zakończeń glutaminergicznych. Wywołuje to aktywację receptora i depolaryzację błony postsynaptycznej. Wzrost potencjału powoduje usunięcie jonu magnezu z receptora NMDA i jego aktywację [19]. Ponieważ w normalnym stanie kanał receptora blokowany jest jonem magnezu, obecność tylko cząsteczek glutaminianu nie jest wystarczająca do pełnej aktywacji NMDAR. Kiedy te dwa warunki obecność glutaminianu i depolaryzacja błony, a tym samym usunięcie Mg 2+ wystąpią w tym samym czasie, możliwe jest jego pobudzenie [17]. W wyniku aktywacji NMDAR dochodzi do napływu jonów wapnia do komórki. Ponadto depolaryzacja błony postsynaptycznej aktywuje napięciowo-zależne kanały wapniowe, w wyniku czego nasila się napływ wapnia i zwiększa jego stężenie w kolbie postsynaptycznej [14; 19]. W kolejnym etapie zwiększone stężenie jonów wapnia aktywuje enzymy, głównie kinazę białkową zależną od Ca 2+ (PKC) oraz kinazę białkową zależną od wapnia i kalmoduliny typu II (CaMKII) [13]. Kinazy te fosforylują inne białka obecne w synapsie - m.in. poprzez fosforylację aktywują receptory AMPA w błonie postsynaptycznej utrzymując jego pobudzenie przez kilka godzin. Powyższe enzymy mają też zdolność do autofosforylacji, co oznacza, że pomimo braku jonów wapnia, mogą pozostać zaktywowane przez jakiś czas, podtrzymując tym samym LTP [13]. We wczesnej fazie LTP aktywowana jest głównie presynaptyczna postać PKC, która z kolei fosforyluje białko wzrostowe GAP-43, mobilizujące pęcherzyki presynaptyczne z glutaminianem do transportu w okolice błony presynaptycznej [16; 20]. Według innych źródeł wczesna faza LTP jest fazą niezależną od NMDA, jeszcze inne utrzymują, że aktywacja AMPAR następuje w wyniku wcześniejszej aktywacji NMDAR, powołując się na badania, gdzie po podaniu antagonistów receptora NMDA doszło do uszkodzenia zarówno długo- jak i krótkotrwałej pamięci. Dało to podstawę do wysnucia wniosku, iż E-LTP także jest zależna od NMDAR [13]. Nie ma jednak wątpliwości co do udziału kinaz w tej fazie LTP. Przeprowadzone badania wykazały, że podanie inhibitorów PKC (w ciągu min po treningu pamięciowym) oraz inhibitorów 18 18:

19 CaMKII (w postaci infuzji do CA1 tuż po zakończeniu treningu) wywołało amnezję, jako skutek uszkodzenia szlaku powstawania pamięci [16]. Konsolidacja pamięci i tym samym przemiana pamięci krótkotrwałej w długotrwałą obejmuje mechanizm związany z późną fazą LTP. Przedłużające się impulsy o dużej częstotliwości, oddziałujące na synapsy prowadzą do dalszych zmian. Rys.5 :Mechanizm plastyczności synaptycznej. Opis sekwencji zmian w tekście. [19]. Wcześniej zaktywowane PKC i CaMKII powodują aktywację kinazy białkowej zależnej od camp (PKA) oraz kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK), obejmującej przede wszystkim ERK (extracellular signal-regulated kinase), które są kluczowymi enzymami fazy L-LTP. Zaktywowane przechodzą do jądra komórkowego, gdzie fosforylują czynniki regulujące transkrypcję genów białka CREB. Wiążą się one do DNA i aktywują transkrypcję elementów odpowiedzi na camp oraz innych białek, które odpowiadają za zmiany strukturalne w obrębie synaps [13]. Badania przeprowadzone na myszach nie posiadających genu dla PKA (podjednostki katalitycznej enzymu) lub których genom posiada mutację w obrębie CREB, wykazały defekt długotrwałej pamięci przestrzennej oraz uszkodzenie późnej fazy LTP [17]. Zmiany w synapsach, które umożliwiają konsolidację pamięci określane są mianem plastyczności synaptycznej i wiążą się bezpośrednio z syntezą białek w LTP. Obejmują początkowo powiększanie zakończeń synaptycznych, a także 19 19:

20 rozszerzanie i skracanie przestrzeni synaptycznej, co zwiększa wrażliwość receptorów NMDA i AMPA na działanie glutaminianu [21; 22]. Ponadto, używając dwufotonowego mikroskopu, zaobserwowano zwiększenie gęstości synaps, w wyniku tworzenia nowych zakończeń postsynaptycznych jako efekt podziału poprzednio istniejących zakończeń [23] lub też na skutek wzrostu nowych synaps [24]. Aktywacja receptorów NMDA Zwiększenie stężenia wapnia Aktywacja CaMKII Fosforylacja receptora AMPA Wbudowanie receptorów AMPA w błonę Zwiększenie przewodnictwa receptorów AMPA Rys. 6. Schemat sekwencji zdarzeń wczesnej fazy LTP. Mechanizm tworzenia pamięci jest modulowany przez inne neuroprzekaźniki obecne w synapsach, m.in. przez dopaminę (głównie przez receptory D1 i D2), serotoninę (przede wszystkim przez receptory 5-HT1A), noradrenalinę (receptory beta-adrenergiczne) a także acetylocholinę (przez receptory muskarynowe i nikotynowe). Wszystkie wymienione powyżej neuroprzekaźniki mają wpływ na stężenie camp, co wpływa także na aktywność PKA kinazy niezbędnej do konsolidacji pamięci [20]. Wzajemne oddziaływanie przekaźników jest także istotnym modulatorem formowania pamięci. Glutaminian, będący głównym neuroprzekaźnikiem, ma bezpośredni pobudzający wpływ na uwalnianie acetylocholiny w hipokampie i korze [25; 26] oraz pośrednio oddziałuje na neurony cholinergiczne, poprzez wpływ na układ GABA-ergiczny, który z kolei oddziałuje na neurony cholinergiczne w przegrodzie rdzeniowej [27]. Jak odnotowano, wzrost uwalniania acetylocholiny jest skorelowany z wyraźną poprawą pamięci. Jej uwalnianie w korze 20 20:

21 mózgowej zaobserwowano przy badaniach angażujących bodźce wizualne, węchowe oraz system nagrody. Natomiast wzrost uwalniania Ach w hipokampie jest związany z pamięcią przestrzenną [28]. Ponadto, zgodnie z przeprowadzonymi badaniami, podanie glutaminianu razem z szokiem elektrycznym (jako bodźcem) wywołuje wyraźne przedłużenie uwalniania w ciele migdałowatym noradrenaliny [29], która najprawdopodobniej moduluje konsolidację pamięci w tej strukturze [30; 31]. NMDAR AMPAR PKC PKA CaMKII ERK Białka sygnałowe i cytoszkieletu Transkrypcja genów i synteza białek Ekspresja LTP Rys.7. Sekwencja zdarzeń późnej fazy LTP. Istnieje hipoteza, że nabyta, stabilna pod wpływem konsolidacji pamięć może zostać reaktywowana, co wiąże się z przejściem w formę labilną. Informacje występujące w postaci pamięci labilnej mogą zostać wzmocnione, osłabione lub zaktualizowane [32; 33]. Do tej pory nie udało się wyjaśnić mechanizmu, na którym opiera się ponowne kodowanie pamięci po jej odświeżeniu, czyli rekonsolidacja. Najprawdopodobniej proces rekonsolidacji obejmuje różne obszary mózgu w zależności od rodzaju pamięci jaką operuje podobnie jak w procesie konsolidacji. Nie jest jednak wiadomo, czy mechanizmy tych dwóch procesów są identyczne czy może zróżnicowane. Przeprowadzone do tego czasu badania opowiadają się częściowo za postulatem, iż są to procesy zupełnie oddzielne, wymagające przeprowadzenia różnych mechanizmów, w różnych częściach mózgu. Przeprowadzone badania Passive avoidance na kurczakach, wykazały zróżnicowanie tych procesów pod względem procesów syntezy białek, procesu glikozylacji oraz indukcji czynników transkrypcji. Udowodniono ponadto, że 21 21:

22 poszczególne drogi w obrębie ciała migdałowatego są istotne dla procesu konsolidacji, jednak nie rekonsolidacji. Także w obrębie hipokampa inne mechanizmy molekularne występują w konsolidacji i rekonsolidacji; różne jego rejony aktywują różne enzymy z grupy kinaz MAP w czasie po treningu lub po reaktywacji pamięci pierwotnej. Jednak, odwrotnie do powyższych badań, liczne próby dostarczyły dowodów dla podobieństwa rozważanych procesów. Wykazano, że zarówno w konsolidacji jak i rekonsolidacji obecna jest synteza białek oraz, że zahamowanie PKA zaburza oba procesy. Ponadto przeprowadzone badania na myszach knock-out nie posiadających genu dla białek CREB wykazały zaburzenia obu procesów [32]. Natomiast po rozlicznych badaniach ustalono podobieństwo powyższych procesów w kwestii neuroprzekaźników Wykazano, że modulacja zarówno receptorów NMDA, adrenergicznych (ze szczególnym wskazaniem na receptory β), dopaminowych - D1 oraz, w mniejszym stopniu, D2, GABA1 oraz neuroprzekaźnika acetylocholiny zaangażowana jest w przeprowadzenie obu procesów. Podanie antagonistów NMDAR, receptorów β, D1 oraz Ach (w oddzielnych badaniach) spowodowało uszkodzenie pamięci i wywołanie amnezji wstecznej. Podobny efekt uzyskano po podaniu agonisty receptora GABA1, wskazując na istotność neuroprzekaźników także w procesie rekonsolidacji, ze szczególną rolą receptorów NMDA i β-adrenergicznych [34]. Wciąż jednak wymagane są badania dotyczące rozwikłania dokładnych mechanizmów ich działania, wzajemnej modulacji, oraz co najważniejsze, poznania mechanizmu molekularnego samego procesu rekonsolidacji. 4.2 Model formowania pamięci u Aplysia Californica Warto wspomnieć, że duży wpływ na poznanie mechanizmu pamięci miały badania przeprowadzone na ślimakach morskich Aplysia Californica, których prosty system nerwowy z zaledwie 20 tysiącami neuronów, pozwala na poznanie podstaw mechanizmów oraz stworzenia prostej sieci neuronalnej i molekularnej zależności. Ponadto, neurony będące przedmiotem zainteresowania, w łatwy sposób mogą zostać wydzielone i przeniesione do hodowli komórkowej, co umożliwi odtworzenie sieci neuronalnej i prowadzenie badań in vitro. Model stworzony na podstawie zachowań odruchowych u ślimaków kalifornijskich dał podstawy do stworzenia pojęcia plastyczności synaptycznej, które zostało zaadoptowane także w kontekście plastyczności synaps i powstawania pamięci u kręgowców. Eksperymenty oparto na zjawiskach sensytyzacji i habituacji zachowań pod wpływem określonych bodźców. Pojedyncza stymulacja czuciowa syfonu ślimaka wywołuje odruch obronny w postaci wycofywania skrzeli. Zaobserwowano, że wielokrotna stymulacja powoduje zanik tego 22 22:

23 odruchu na dłuższy czas, przy czy stymulacja czuciowa syfonu połączona z impulsem elektrycznym do ogona ślimaka, spowodowała przywrócenie odruchu obronnego zwierzęcia. Okres czasu, w którym odruch został przywrócony korelował z czasem podwójnego drażnienia ogona i syfonu ślimaka. Molekularną podstawą powyżej opisanych zjawisk są zmiany molekularnych mechanizmów oraz różnice w uwalnianiu neuroprzekaźników w obrębie synaps. Jednokrotna stymulacja syfonu będąc nowym bodźcem powoduje wzrost uwalniania glutaminianu w przestrzeni synaptycznej i pobudzanie neuronu ruchowego oraz generowanie odruchu. Powtarzająca się sekwencja tego samego impulsu wywołuje jednak habituację, w której dochodzi do wycofywania zakończeń synaptycznych i zmniejszania liczby synaps z neuronami ruchowymi oraz interneuronami, co objawia się zanikiem bodźca odruchowego. Impuls elektryczny powoduje natomiast uwolnienie serotoniny do synapsy z interneuronem, pobudzenia białka G, a co za tym idzie aktywacji cyklazy adenylanowej, wzrostu stężenia cyklicznego camp i aktywacji PKA, która fosforylując kanały potasowe i wapniowe wywołuje depolaryzację zakończenia presynaptycznego i uwalnianie glutaminianu. Przedłużające się oddziaływanie impulsu powoduje przejście PKA z cytoplazmy do jądra i fosforylację białka CREB-1, które jest pozytywnym aktywatorem genów skutkuje transkrypcją genów i syntezą białek, które uczestniczą w tworzeniu nowych połączeń synaptycznych i tzw. szlaków neuronalnych, które leżą u podstawy magazynowania pamięci. Powyższy zarys mechanizmu uczenia i przechowywania pamięci dał możliwość stworzenia podstaw bardziej złożonych mechanizmów występujących u kręgowców i, w toku ciągle przeprowadzanych badań jest uzupełniany o nowe, bardziej szczegółowe zależności [17, 35] :

24 5. Receptory zaangażowane w procesy pamięciowe Receptory związane z glutaminianem Receptory NMDA Jeden z trzech typów receptorów dla glutaminianu, jest heteromultimerycznym kanałem jonowym złożonym z 4 podjednostek: NR1 oraz NR2A-D [3] i wiążącym glutaminian z dużym powinowactwem [36]. Podjednostka NR1 zawiera miejsca wiążące glicynę, serynę lub poliaminy, które mają istotny wpływ na funkcjonowanie receptorów NMDA [3; 37]. Pełna aktywacja receptora NMDA jest możliwa tylko wówczas, gdy dodatkowe miejsce wiążące agonistów (glicynę/serynę/aminokwasy) jest zajęte [3]. W kontekście przeprowadzonych badań warto zauważyć, iż agonistą wiążącym się do miejsca dla agonistów (dla poliamin) jest także histamina [37]. Kanał NMDA jest wysoce przepuszczalny dla jonów wapnia, które transportowane są dokomórkowo wraz z Na + natychmiast po aktywacji receptora, przy jednoczesnym transporcie jonów potasu na zewnątrz komórki [36]. Ponadto receptory NMDA blokowane są w stanie spoczynkowym przez jon magnezu, co uniemożliwia przenoszenie potencjału na dalsze neurony [3], jednak gdy odpowiednia częstotliwość i siła impulsów synaptycznych wywołuje dostateczną depolaryzację, jony magnezu są uwalniane z receptora i dochodzi do jego pobudzenia [36]. Największa gęstość receptorów NMDA w obrębie mózgu występuje w hipokampie (w szczególności w obszarze CA1), a ponadto w korze oraz wzgórzu [3]. Receptory NMDA występują w postaci presynaptycznych autoreceptorów, które największą rolę odgrywają w przewodnictwie w obrębie rdzenia kręgowego, móżdżku, korze węchowej, a także pełnią rolę w móżdżkowym i korowym LTD [36] oraz w postaci receptorów postsynaptycznych receptorów, których aktywacja i dokomórkowy napływ Ca 2+ pełnią rolę zarówno w LTP jak i LTD [ 36]. Receptory NMDA, jak udowodniono, pełnią bardzo istotną rolę w procesie formowania pamięci przeprowadzone badania na myszach pozbawionych genu dla podjednostki NR1 w CA1 hipokampa, wykazały znaczne zaburzenia w procesie uczenia w porównaniu z grupą kontrolną [38; 39]. Powyższe wyniki zostały potwierdzone w innych badaniach, co spowodowało zaakceptowanie postawionego wniosku wynikającego z tych badań. Jednak niedawno przeprowadzone badania niejako kontrowersyjnie zaprzeczają powyższym, sugerując równie dobre nabywanie pamięci u myszy nieposiadających genu dla NMDA, co myszy kontrolne, z pełnym genotypem dla powyższych receptorów [40]. Jak też wykazano, receptory NMDA są niezwykle istotne w procesie nabywania pamięci, jednak nie biorą 24 24:

25 udziału w jej utrzymywaniu i przetwarzaniu blokada NMDA po treningu nie miała wpływu na wyniki testów pamięciowych, podczas gdy blokada receptorów przed treningiem wpłynęła negatywnie na proces uczenia i formowania pamięci co objawiło się w znacznie gorszych wynikach testów behawioralnych [41; 42]. Inne źródła opowiadają się jednak za wpływem tych receptorów także na odświeżanie pamięci [36]. Jak wspomniano wcześniej, dodatkowe miejsca wiążące dla agonistów (m.in. glicyny) wpływają na funkcjonowanie receptorów NMDA, co potwierdziły badania wykazujące zaburzenia pamięci w teście labiryntu wodnego Morrisa po podaniu antagonistów miejsca wiążącego glicynę [36]. Podsumowując receptory NMDA biorą udział zarówno w formowaniu pamięci emocji w ciele migdałowatym, pamięci proceduralnej w striatum, nawyków behawioralnych w móżdżku oraz odpowiadają za pamięć epizodyczną w hipokampie [36] Receptory AMPA Drugi typ receptorów pobudzanych przez glutaminian, występując we wszystkich pobudzających synapsach w hipokampie, też związany jest bardzo ściśle z procesem formowania pamięci [3]. Złożony z 4 podjednostek GluA1-4, w różnych kombinacjach pełni, podobnie jak receptor NMDA, nieco inne funkcje w zależności od składowych receptora [3]. Cechą charakterystyczną tych receptorów jest duże prawdopodobieństwo ulegania desensytyzacji, która wiąże się z niewydolnością synaptycznego klirensu glutaminianu. Glutaminian, który nie jest usuwany z przestrzeni synaptycznej, powoduje zamknięcie receptorów AMPA i ich niewrażliwość na pobudzenia, która przemija wolno i zależy od budujących receptor podjednostek. Do desensytyzacji może także dojść, gdy stężenie glutaminianiu nie jest wystarczająco wysokie, lub gdy rośnie zbyt wolno [3]. Kanał AMPA jest kanałem przepuszczalnym dla jonów sodu (do wewnątrz) oraz potasu (na zewnątrz). Ponadto odpowiada on także za prąd wapniowy dokomórkowy co jednak zależy od podjednostek, które budują receptor. AMPA nie zawierające podjednostki GluA2 są przepuszczalne dla Ca 2+, jednak jednocześnie mniej stabilne. Te zawierające GluA2 ze względu na zdolność wiązania z białkami w synapsach są bardziej stabilne [43]. Aktywacja receptorów na drodze ich fosforylacji przez CaMKII oraz PKA a także szlak sygnałowy obejmujący receptory AMPA, zostały bardziej szczegółowo poruszone w części dotyczącej procesu powstawania pamięci, w którym niewątpliwie, receptory te są mocno zaangażowane. Wykazano bowiem, że pod wpływem treningu pamięciowego, przeprowadzonego na 25 25:

26 królikach, zwiększyła się ekspresja miejsc wiążących receptorów AMPA oraz zaszły zmiany w konfiguracji jego podjednostek [37] Receptory kainianowe Najmniej poznaną grupą receptorów dla glutaminianu są receptory kainianowe. Są to pre- lub postsynaptyczne receptory złożone z 4 podjednostek spośród: GluK1-5. Głównie zlokalizowane w hipokampie w obrębie CA1 i CA3 [44; 45]. Mechanizm ich działania jest dwubiegunowy są to receptory jonotropowe, jednak sprzężone funkcjonalnie z białkiem G, które za pośrednictwem przekaźników drugiego rzędu wywołują napływ jonów wapnia z wewnątrzkomórkowych magazynów [46]. Podobnie jak AMPA i na tej samej drodze, ulegają desensytyzacji [3]. Jak wykazano, receptory kainianowe zaangażowane są w regulację neuroprzekaźników nie tylko glutaminianu, ale także GABA [3; 46]. Są ponadto zaangażowane w pobudzenie aksonalne, a także w proces plastyki synaps [3]. Zaobserwowano, że, w zależności od zastosowanej dawki agonistów, uwalnianie neuroprzekaźników zostało zahamowane lub wzmocnione co może wiązać się faktem występowania receptorów kainianowych pre- lub post-synaptycznie [3]. Jednak droga, na jakiej zachodzi modulacja uwalniania neuroprzekaźników oraz pozostałe efekty działania powyższych receptorów pozostaje niejasna i wymaga dalszych badań Receptory GABA W obrębie receptorów GABA wyróżnia się dwie podrodziny receptorów jonotropowych GABA A i GABA C oraz rodzinę receptorów metabotropowych sprzężonych z białkiem G GABA B. Wszystkie z powyższych receptorów zbudowane są z podjednostek, których różny skład warunkuje zróżnicowanie działania poszczególnych receptorów [47]. Receptory GABA A i GABA C należą do grupy nikotynowych kanałów jonowych blokowanych ligandem. Złożone są z 5 podjednostek, przy czym GABA A jest heteromeryczny, a GABA C homomeryczny. Działają poprzez indukowanie hyperpolaryzacji w neuronach i wygaszanie pobudzenia neuronów [3]. W kontekście receptorów GABA A istotna okazała się podjednostka α5, która występuje w mniej niż 5% wszystkich receptorów, które zlokalizowane są głównie w CA1 hipokampa [47]. Po podaniu agonistów receptora GABA A odnotowano pogorszenie wyników w testach pamięciowych [48] co daje dowody na negatywny wpływ powyższych receptorów na proces uczenia i konsolidację pamięci. Z kolei bezpośrednie podanie do CA1 hipokampa bikukuliny, 26 26:

27 związku będącego selektywnym antagonistą GABA A, natychmiast lub 1,5h po treningu, spowodowało poprawę funkcji pamięciowych [48]. Podobne rezultaty uzyskano w badaniach na myszach z deficytem genu dla podjednostki α5 myszy nie posiadające tego genu, wykazały lepsze wyniki w teście labiryntu wodnego Morrisa, który odzwierciedla pamięć przestrzenną. Natomiast w teście Passive avoidance, niezależnym od hipokampa, wyniki nie uległy zmianie [49]. Kolejnymi badaniami potwierdzającymi udział receptorów GABA A w procesach pamięciowych było wykazanie, iż antagoniści tego receptora zwiększają ekspresję BDNF w hipokampie [48], natomiast podanie agonistów GABA do przegrody rdzeniowej, mającej funkcjonalne połączenia z hipokampem, spowodowało zaburzenie w obrębie rytmu theta, który jest istotny dla procesu formowania pamięci [50]. Z kolei inne badania podważyły nieco wyniki poprzednio przeprowadzonych testów odnośnie wpływu receptorów GABA na funkcjonowanie pamięci, udowadniając iż niskie dawki GABA hamowały tworzenie pamięci, podczas gdy dawki wyższe pozytywnie wpływały na powstawanie pamięci krótkotrwałej [51]. Z kolei metabotropowy receptor GABA B sprzężony jest z białkiem G i, które działa poprzez hamowanie cyklazy adenylanowej oraz blokuje kanały jonowe. Receptory te występują w postaci auto-i hetero receptorów. Oddziaływanie GABA na presynaptyczne autoreceptory objawia się poprzez zahamowanie przez te receptory dalszego uwalniania GABA. Natomiast oddziaływanie na receptory postsynaptyczne wywołuje zahamowanie uwalniania glutaminianiu przez receptory NMDA i AMPA, a także otwiera kanały potasowe, wywołujące hyperpolaryzację neuronów i wyciszenie pobudzenia neuronu [52]. Podobnie jak w przypadku receptorów jonotropowych, podanie antagonistów receptora metabotropowego GABA, wykazano poprawę nabywania pamięci i jej funkcjonowanie, wykorzystując w testach behawioralnych zarówno gryzonie (myszy) jak i małpy rhesus [53] :

28 5.3. Noradrenalina i receptory noradrenergiczne Noradrenalina syntezowana jest w neuronach miejsca sinawego (łac. Locus coeruleus) z dopaminy pod wpływem beta-hydroksylazy. Oddziałuje na receptory adrenergiczne sprzężone z różnymi typami białek G. Występują w dwóch grupach α i β receptorów. Receptory α dziela się na dwa typy receptory α 1, które z kolei podzielone są na 3 podtypy α1a, α1b i α1d. Są one sprzężone z białkiem G q aktywując tym samym fosfolipazę C oraz fosfatydyloinozytol, co prowadzi do wzrostu aktywności kinazy białkowej C (PKC) oraz nasilenia uwalniania jonów wapniowych z magazynów wewnątrzkomórkowych [54]. Receptory α 2 również zawierają trzy podtypy A, B i C, występujące postsynaptycznie oraz dodatkowo α 2 A i C presynaptycznie. Sprzężone są z białkiem G i co prowadzi do hamowania cyklazy adenylanowej i zmniejszania stężenia camp [54]. Grupa receptorów β obejmuje trzy podgrupy β1-3. Wszystkie sprzężone są z białkiem G s aktywując cyklazę adenylanową i zwiększając stężenie cyklicznego AMP w komórce [54; 55]. Jak wykazały badania, szczególnie zaangażowane w regulację procesów pamięciowych są receptory α 2 i β. Zaobserwowano, że blokada receptorów β ma uszkadzający wpływ na powstawanie pamięci, oraz hamuje pozytywny wpływ agonistów tych receptorów. Bardzo istotna jest rola receptorów adrenergicznych w powstawaniu pamięci o podłożu emocjonalnym. Uczestniczą one w powstawaniu LTP w podstawno bocznej części ciała migdałowatego, najprawdopodobniej przez hamujący wpływ receptorów β na neurotransmisję GABAergiczną, co ułatwia przesyłanie impulsów korowych i wzgórzowych do bocznej części ciała migdałowatego. Z kolei aktywacja receptorów α2, poprzez inhibicję odpowiedzi postsynaptycznej, hamuje przepływ impulsów z bocznej do podstawnej części ciała migdałowatego, hamując LTP. W opozycji do badań udowadniających istotną rolę noradrenaliny w kodowaniu pamięci emocjonalnej stoją badania na myszach knock-out, pozbawionych genu dla β-hydroksylazy, gdzie nie zaobserwowano ubytku pamięci w testach behawioralnych. Podobnie pozytywny wpływ na pamięć noradrenalina wywołuje w obrębie hipokampa, gdzie pośrednio ułatwia fosforylację podjednostki GluR1 receptorów AMPA, umożliwiając transport receptorów do synapsy i nasilając indukcję LTP [55] :

29 5.4. Receptory 5-HT Jest to jedna z najważniejszych grup receptorów w kontekście pamięci. W obrębie grupy receptorów 5-HT wyodrębniono 7 rodzin: 5-HT 1-7, w obrębie których wyróżnia się kilka podtypów. Wszystkie rodziny receptorów są sprzężone z różnymi typami białka G, z wyjątkiem receptorów 5-HT 3, które w głównej mierze są receptorami jonowymi [56]. Receptory 5-HT 1 związane są z białkiem G i i/lub G 0. 5-HT 2 z białkiem G q, a receptory 5- HT 4,6,7 z białkiem G s. [57]. Te z receptorów, które funkcjonalnie związane są z białkami G s, działają poprzez aktywację cyklazy adenylanowej, a w konsekwencji aktywują kinazę białkową A i fosforylację CREB zaangażowanych w LTP. Aktywacja receptorów związanych z białkiem G i wywołuje mechanizm odwrotny, do mechanizmu wywołanego przez białko G s, czyli działa poprzez hamowanie aktywności cyklazy adenylanowej i zmniejszenia stężenia cyklicznego AMP. Z kolei receptory sprzężone z białkiem G q nasilają aktywność fosfatazy inozytolowej i zwiększają stężenie jonów wapnia w cytozolu [57; 58]. W testach Passive oraz Active avoidance na szczurach, po iniekcji pochodnej amfetaminy PCA, agonisty receptorów 5-HT, wykonanych na szczurach wykazano, że różne rodziny tych receptorów biorą udział w mechanizmie powstawania pamięci, opierając się na zróżnicowanych mechanizmach, w zależności od rodziny receptora [59]. Największą gęstość neuronów serotoninergicznych w hipokampie szczurów zanotowano w obrębie CA3 oraz zakrętu zębatego, natomiast w ciele migdałowatym występują, w przeważającej ilości, w jądrach: bocznym, brzusznym oraz okołohipokampowym (pobocznym brzusznym) [60]. W obrębie rodziny 5-HT 1 wyróżnia się podrodziny 5-HT 1A, B, D, E i F. Wszystkie występują w obrębie centralnego systemu nerwowego na neuronach serotoninergicznych, ale także nie-serotoninergicznych. Bardzo istotną rolę w procesie powstawania pamięci odgrywają receptory 5-HT 1A, występujące głównie w postaci autoreceptorów. Są one zaangażowane w neurogenezę w zakręcie zębatym, działając jako negatywny regulator aktywności neuronalnej w hipokampie. Ponadto poprzez aktywację kanałów potasowych sprzężonych z białkiem G i nasilają hyperpolaryzację i zmniejszają pobudliwość neuronów, hamują kanały wapniowe oraz, poprzez inhibicję receptorów NMDA i AMPA, w wyniku zahamowania aktywności cyklazy adenylanowej i w konsekwencji kinazy białkowej A, są zaangażowane w hamowanie LTP [58; 59]. Z powyższego wynika, iż podanie antagonisty receptorów 5-HT1A skutkuje osłabieniem procesów pamięciowych i zapamiętywania. Równie istotną rodziną w obrębie receptorów serotoninowych jest rodzina receptorów 5-HT 2, szczególnie podtyp 5-HT 2A. Działanie receptora opiera się, oprócz podstawowego mechanizmu opisanego powyżej, na aktywacji fosfolipazy A2 oraz fosfolipazy D, w wyniku 29 29:

30 interakcji z innymi białkami [60]. Aktywacja 5-HT 2A, ze względu na zmniejszenie przewodności kanałów K +, wywołuje depolaryzację neuronów. Ponadto dochodzi do wzrostu produkcji cgmp, pośrednio poprzez uwalnianie glutaminianu i aktywację NMDAR. Według badań, aktywacja receptorów NMDA wywołuje ułatwioną plastykę synaps po lokalnej iniekcji agonisty 5-HT 2A, co oczywiście wiąże się z powstawaniem LTP. [60]. Jeśli chodzi o zaangażowanie receptorów 5-HT 3 w formowanie pamięci nie jest do końca wyjaśnione. Receptory te, głównie 5-HT 3A występują przede wszystkim w hipokampie, ciele migdałowatym oraz korze, co zasugerowało ich udział w procesie pamięci. Występowanie receptorów na GABA-ergicznych interneuronach w hipokampie może sugerować wywieranie efektu na pamięć i uczenie w wyniku depolaryzacji komórek piramidowych w tym obszarze [56; 61]. Jednak według przeprowadzonych badań 5-HT 3A nie jest niezbędny w procesie nabywania pamięci, głównie pamięci związanej ze strachem, jest jednak istotny w wygaszaniu strachu. Z kolei Park i Williams w 2012 r. przeprowadzając badania Passive avoidance przy użyciu antagonisty receptora 5-HT 3A, wykazali istotne ułatwienie tworzenia pamięci w kontekście badanego strachu [62]. Bardzo istotną rodziną jest rodzina receptorów 5-HT 4, dla której udowodniono bezpośredni wpływ na procesy pamięciowe. Występujące głównie w hipokampie, korze oraz striatum. Aktywacja tych receptorów prowadzi do zwiększonego uwalniania ACh, dopaminy i serotoniny w kluczowych dla pamięci rejonach mózgu [56], pobudza uwalnianie peptydu neuroprotekcyjnego, który ułatwia wzrost neuronalny i poprawia funkcje pamięciowe, a także zmniejsza toksyczność komórkową związaną z pobudzoną transmisją glutamatergiczną [63] i poprawia funkcje poznawcze poprzez indukowanie depolaryzacji komórek piramidowych w obrębie CA1 hipokampa, przez co indukuje LTP w hipokampie [64]. Receptory 5-HT 6 oraz 5- HT 7 są stosunkowo nowo poznanymi receptorami, jednak badania nad ich funkcjami wykazują wpływ na kształtowanie pamięci, jej konsolidację oraz odświeżanie. Przeprowadzone badania w niezależnych ośrodkach udowodniły wpływ agonistów receptorów 5-HT6 na pogorszenie pamięci, jednak inne badania wykazały różny wpływ pobudzenia receptorów 5-HT6 w zależności od rodzaju badania a tym samym testowanego rodzaju pamięci [65]. Podobne rozbieżności zaobserwować można w przypadku receptorów 5-HT7 przeprowadzone badania wykazały, iż podanie agonistów tych receptorów wiąże się ze wzrostem camp i ułatwieniem konsolidacji pamięci, nie wpływając na STM. Ponadto podanie antagonistów 5-HT7 nie wykazało żadnego efektu, jednak w połączeniu z agonistą odwróciło ułatwienie LTP [66]. Niewątpliwie dalsze badania są niezbędne w celu szczegółowego wyjaśnienia mechanizmu działania powyższych receptorów :

31 5.5. Receptory dopaminowe Grupa receptorów odpowiadających na działanie dopaminy dzieli się na dwie rodziny: rodzina D1, obejmująca podrodziny D1 i D5, oraz rodzina D2 składająca się z receptorów D2-4 [3]. Mechanizm działania jest zróżnicowany w zależności od rodziny: rodzina receptorów D1 działa poprzez aktywcję cyklazy adenylanowej, co pociąga za sobą zmiany w obrębie enzymów komórkowych, natomiast rodzina D2 działa odwrotnie poprzez hamowanie cyklazy adenylanowej, wywołując efekt odwrotny [3]. Rozmieszczenie receptorów dopaminowych w obrębie mózgu jest dość szerokie. Receptory D1 występują w strukturach korowych, głównie w korze przedczołowej i striatum. Podobne rozmieszczenie wykazują receptory D2 i D3, występujące z dużą gęstością głównie w striatum. Natomiast receptory D4 i D5 znaleziono przede wszystkim w hipokampie oraz korze przedczołowej (D4) lub węchomózgowiu (D5) [67]. Rozmieszczenie receptorów jest ściśle związane z ich funkcją, jaką pełnią w kontekście formowania pamięci. Rozmieszczenie receptorów D1-3 sugeruje ich związek z pamięcią roboczą co ma odzwierciedlenie w badaniach naukowych. Po podaniu nieselektywnego agonisty D1/D2 zaobserwowano poprawę wyników w obrębie pamięci roboczej, przy czym podanie selektywnego agonisty D2 dało wyniki odwrotne. To sugeruje większe zaangażowanie receptorów D1 w tworzenie pamięci roboczej [68], co znajduje potwierdzenie w wynikach innych badań. Podanie antagonisty D1 miało bardziej uszkadzający wpływ na formowanie pamięci niż podanie antagonisty D2 [68]. Występowanie pre- i postsynaptyczne receptorów D2 ma także odzwierciedlenie w efekcie ich działania mniejsze dawki dopaminy pobudzają głównie receptory presynaptyczne, co skutkuje zmniejszonym uwalnianiem dopaminy, przy czym dawki większe receptory postsynaptyczne wywołujące nasilone uwalnianie dopaminy [69]. Pomimo, iż receptory D1 i D2 pełnią największą rolę w formowaniu pamięci przeprowadzone badania sugerują także niemały wpływ pozostałych receptorów na procesy pamięciowe: przeprowadzone badania na szczurach wykazały, że podanie agonisty D4 wywołuje poprawę pamięci w testach behawioralnych, podobnie działa podanie antagonisty D4 w mniejszych dawkach, natomiast wyższe dawki wywołały efekt uszkadzający [70,71] :

32 5.6. Acetylocholina Pewne znaczenie w formowaniu pamięci odgrywa także acetylocholina. Oddziałuje ona na dwa typy receptorów muskarynowe i nikotynowe, co przejawia się w zróżnicowaniu efektów jakie wywiera Receptory nikotynowe są receptorami jonowo tropowymi, pentametrycznymi, z dwoma głównymi typami homomerycznymi α7 oraz heteromerycznymi α 4 β 2. Różnią się one powinowactwem do Ach, kinetyką desensytyzacji oraz selektywnymi agonistami i antagonistami. Homomeryczny typ tych receptorów wystepuje zarówno pre- jak i postsynaptycznie. Badania wykazały, że aktywacja presynaptycznych receptorów zwiększa uwalniaie glutaminianiu i GABA. Z kolei aktywacja receptorów heteromerycznych wywołuje depolaryzację interneuronów w obrębie kory mózgowej [3]. Badania wykazały zaangażowanie obu typów receptorów nikotynowych w formowanie pamięci głównie pamięci roboczej, ale także w niewielkim stopniu pamięci przestrzennej [72,73] Receptory muskarynowe to receptory metabotropowe, występujące w hipokampie w postaci 4 typów receptorów. Wykazują aktywną formę w trakcie potencjału spoczynkowego, która jest hamowana przez agonistów tych receptorów. Agoniści receptorów muskarynowych wywołują depolaryzację neuronów, co jest szczególnie ważne dla niektórych interneuronów hipokampa [3]. Depolaryzacja wywołana przez receptory muskarynowe odgrywa najprawdopodobniej rolę w generowaniu rytmu theta w komórkach piramidowych w obrębie hipokampa, który jest istotny dla procesu formowania pamięci [74]. Receptory muskarynowe występujące presynaptycznie działają hamująco na uwalnianie neuroprzekaźników, najprawdopodobniej za pośrednictwem sprzężenia z białkiem G, jednak dokładny mechanizm nie jest do końca poznany [3] :

33 6. HISTAMINA Jest to amina biogenna o nazwie chemicznej 2-[4-imidazol]-etylamina [75], która działa za pośrednictwem czterech typów receptorów histaminowych H1-4. Poza układem nerwowym jest syntetyzowana i uwalniana przez komórki układu limfatycznego, głównie bazofile, limfocyty, mastocyty [75], które magazynują histaminę także w obrębie mózgu. Ponieważ gęstość mastocytów w mózgu jest znikowma większość funkcjonującej tam histaminy zlokalizowana jest w neuronach [76]. Synteza histaminy w układzie nerwowym zachodzi w jądrze guzowo-suteczkowym (nucleus tuberomamillaris), w tylnej części podwzgórza, gdzie pod wpływem dekarboksylazy histydyny powstaje histamina, która przechowywana jest w pęcherzykach w okolicy zakończeń neuronów. Jej metabolizm przeprowadzany jest w pierwszym etapie przez metylotransferazę histaminową do metylohistaminy, która z kolei pod wpływem monoaminooksydazy jest metabolizowana do metylowej pochodnej kwasu octowego [77]. Synteza i uwalnianie histaminy regulowane są głównie przez presynaptyczne, hamujące autoreceptory H 3, zlokalizowane w somatycznych i aksonalnych zakończeniach neuronów histaminowych, a także przez hamujące receptory muskarynowe M 1 dla acetylocholiny, adrenergiczne receptory α 2, serotoninergiczne receptory 5-HT 1A oraz opioidowe receptory κ. Ponadto badania in vivo wykazały hamujący wpływ tlenku azotu (NO) na uwalnianie histaminy w podwzgórzu [76]. Histamina, w przeciwieństwie do innych neurotransitterów o niewielkiej masie nie posiada mechanizmu transportu zwrotnego, co powoduje, że jej obecność w przestrzeni synaptycznej i możliwość oddziaływania na poszczególne receptory jest wydłużona [78]. System histaminergiczny, dzięki szerokim połączeniom, ma połączenia niemalże z każdą strukturą w obrębie centralnego systemu nerwowego pośrednio lub bezpośrednio. Jądro guzowo-suteczkowe, jako miejsce syntezy histaminy, otrzymuje połączenia głównie z przegrody, jądra przedwzrokowego oraz z grupy neuronów pnia mózgu. Z kolei włókna eferentne, wychodzące z tegoż jądra, kierowane są do kory mózgowej, ciała migdałowatego, substancji czarnej, hipokampa, striatum i wzgórza [79]. W obrębie mózgu największa gęstość połączeń histaminergicznych występuje zdecydowanie w podwzgórzu, gdyż jest to miejsce skąd wychodzą neurony histaminowe do wielu innych ośrodków. W hipokampie największą gęstość neuronów zaobserwowano w podkładce i zakręcie zębatym, przy czym kluczowe, pod względem formowania pamięci i jej konsolidacji, rejony CA1 i CA3 charakteryzują się małą gęstością takich połączeń [76] :

34 Działanie histaminy zależy od miejsca w organizmie, w którym występuje, od typu i lokalizacji receptorów na które oddziałuje oraz od charakteru poszczególnych procesów, w które jest zangażowana. Najbardziej znanym kierunkiem działania histaminy jest jej rola w procesie zapalnym i oddziaływanie na receptory H 1 i H 2, które zlokalizowane są na komórkach endotelialnych. [80]. Produkowana przez komórki układu immunologicznego rozszerza naczynia postkapilarne, aktywuje endotelium oraz zwiększa przepuszczalność naczyń krwionośnych, co skutkuje lokalnym obrzękiem i gromadzeniem komórek zapalnych w miejscu zapalenia [80]. Jednak badania rozpoczęte na dobre pod koniec XX wieku dostarczyły bardzo silne argumenty, mające potwierdzenie w badaniach naukowych zarówno na izolowanych preparatach, jak i w testach behawioralnych na zwierzętach opowiadające się za udziałem histaminy w procesie powstawania pamięci, jej konsolidacji oraz procesu zapominania Receptory H1 Działają głownie przez białko Gq, którego aktywacja powoduje nasilenie aktywności fosfolipazy C [76]. To z kolei prowadzi do napływu jonów wapnia do komórki zarówno jako efekt uwalniania z wewnątrzkomórkowych magazynów, jak i aktywacji napięciowozależnych kanałów wapniowych oraz do depolaryzacji komórki [77]. Ponadto receptory H1 prowadzą do uwalniania wstecznie przekaźników kwasu arachidonowego oraz tlenku azotu, a także czynników transkrypcji genów. Tak więc stymulacja H1 powoduje aktywację zarówno pre- jak i postsynaptycznych dróg sygnałowych [77]. Miejsca występowania receptorów H1 w mózgu to przede wszystkim: kora, hipokamp, ciało migdałowate, podwzgórze, wzgórze, striatum i móżdżek [77]. Wiele badań potwierdziło korelację obszarów gdzie występują te receptory z efektem jaki wywołują na procesy pamięciowe. Farmakologiczna blokada receptorów H1 w testach behawioralnych na gryzoniach, spowodowała uszkodzenie pamięci roboczej i referencyjnej, a także wpłynęła negatywnie na siłę wyładowań theta w hipokampie, co bezpośrednio wiąże się z procesem tworzenia pamięci. Podobny efekt uzyskano w badaniu gdzie antagonistę H1 wprowadzono bezpośrednio do hipokampa oraz doustnie [77]. Badania na ludziach po doustnym podaniu antagonistów receptora H1 wykazały wyraźne pogorszenie wyników w testach uczenia przestrzennego, pogorszenie czasu reakcji i podzielności uwagi, jednak nie wpłynęły na pamięć. Warto zauważyć, iż skopolamina wykazała bardzo podobny schemat zaburzeń po 34 34:

35 podaniu doustnym [80]. Z kolei badania na myszach nieposiadających genu dla receptora H1, wykazały pogorszenie wyników w niektórych testach, co świadczy o uszkodzeniu pamięci przestrzennej, ale także roboczej i epizodycznej [77] Receptory H2 Wiążą się z białkiem Gs, którego stymulacja aktywuje cyklazę adenylanową, prowadząc do wzrostu stężenia cyklicznego camp. Jak podano wcześniej uruchamia to szlak metaboliczny, prowadzący do zwiększenia syntezy białek CREB i rozpoczęcia plastyki w obrębie synaps, co związane jest z konsolidacją pamięci. Ponadto receptory H2 występują w obrębie mózgu przede wszystkim w hipokampie, ciele migdałowatym, korze i jądrach podstawy [77]. Tak więc sądząc po lokalizacji powyższych receptorów oraz mechanizmów działania receptory H2 są mocno zaangażowane w formowanie pamięci. Badania przeprowadzane w celu sprawdzenia oczekiwanego efektu działania polegały głównie na odwracaniu efektów innych związków, wpływających na receptory histaminowe [77]. Jednak badania przeprowadzone z użyciem tylko selektywnego agonisty H2 podanego infuzją bezpośrednio do przegrody, wykazały znaczną poprawę pamięci i lepsze wyniki w testach pamięciowych [77]. Także badania na myszach knock-out w obrębie H2 wykazały zaburzenia w kilku testach, świadcząc o zaangażowaniu receptorów H2 na procesy pamięciowe [77] Receptory H3 Zostały odkryte i opisane stosunkowo niedawno, jednak od kiedy w 1983 roku po raz pierwszy opisał je Arrang, bazując na wynikach badań jakie otrzymał wraz ze swoim zespołem [76], aż do dziś trwają nieustanne badania w wielu ośrodkach na świecie mające na celu zgłębienie fizjologicznej i farmakologicznej roli tych białek. Mechanizm ich działania jest wielokierunkowy, jednak wynika ze sprzężenia receptorów H3 z białkiem Gi. Stymulacja tego białka wywołuje zahamowanie powstawania camp, kluczowego przekaźnika szlaków komórkowych zaangażowanych m.in. w powstawanie dróg pamięciowych. Ponadto zwiększa uwalnianie jonów wapnia z magazynów wewnątrzkomórkowych, nasila fosforylację kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK), a także aktywuje fosfolipazę A2 oraz IP3 (trifosforan inozytolu) [78]. Opisane zostały zarówno presynaptyczne autoreceptory regulujące uwalnianie histaminy, a także heteroreceptory, także presynaptyczne, znajdujące 35 35:

36 się na neuronach innych niż histaminergiczne [82]. Receptory H3 utrzymują bardzo silną aktywność konstytutywną, co oznacza, iż pomimo braku liganda aktywującego, wolne receptory wykazują silną aktywację, a więc stymulują białko G, wywołując kaskadę przemian. Interesującym jest fakt występowania konstytutywnej aktywności nie tylko in vitro (co wykazuje kilka innych receptorów), ale także in vivo [78; 83]. Ponadto, receptory H3 posiadają wiele różnych izoform, które często różnią się w obrębie gatunków zwierząt, ale także mają inne powinowactwo do poszczególnych ligandów oraz zróżnicowaną dystrybucję w obrębie mózgu. Ze względu na różną dystrybucję w CSN, wykazano zróżnicowany wpływ na uwalnianie neurotransmiterów antagonista/odwrotny agonista H3 zwiększa uwalnianie dopaminy w obrębie kory przedczołowej, jednak nie wykazuje żadnego efektu w striatum [84]. Receptory H3 tworzą formy heterodimeryczne z receptorami dopaminowymi D1 i D2. Połączenie z receptorem D2 nie zmienia powinowactwa dopaminy do receptora i przez to nie wpływa na zmiany jego mechanizmu działania. Natomiast dimeryzacja receptora H3 z D1 powoduje zmianę w obrębie białka, z którym sprzężony jest receptor D1 w wyniku tego, D1R wiąże się z białkiem Gi zamiast Gs i wywołuje odwrotny efekt od pierwotnego zamiast pobudzać, hamuje produkcję camp [78]. Wpływ receptorów H3 na działanie innych neuroprzekaźników, został zaobserwowany szczególnie w kontekście wpływu na ich uwalnianie i obejmuje głównie acetylocholinę, dopaminę, noradrenalinę, glutaminian, GABA, serotoninę. Zaangażowanie receptorów H3 w procesy pamięciowe potwierdzono na podstawie wykonanych badań labiryntu Y - systematyczne podawanie antagonisty H3 przed treningiem poprawiło wyniki otrzymane w badaniu oraz ułatwiło przeprowadzenie kolejnych prób. Podobnie jak mikroinfuzja bezpośrednio do jądra podstawnego po treningu poprawiła pamięć przestrzenną [77]. Ponadto przeprowadzone badania Passive avoidance udowodniły odwrócenie uszkodzeń pamięci wywołanych skopolaminą (antagonistą receptorów muskarynowych) [85] oraz antagonistą NMDAR po bezpośredniej infuzji do hipokampa [86]. Także myszy pozbawione genu dla H3R wykazały się dużo lepszą pamięcią przestrzenną, w porównaniu z myszami Wild-type [77]. W opozycji do powyższych inne badanie przeprowadzone na myszach wykazało pogorszenie pamięci po podaniu antagonisty receptora H3 [83]. Oprócz pamięci przestrzennej są również dowody na udział receptorów H3 w konsolidacji pamięci związanej z emocjami w ciele migdałowatym, tym razem jednak podanie bezpośrednio do podstawno-bocznej części ciała migdałowatego agonisty H3 R- alfa-metylohistaminy, spowodowało poprawę wyników obserwowanych 72 godziny po treningu [87]. Tak więc w zależności od regionu mózgu, natury badanych procesów i 36 36:

37 przeprowadzonych testów, a także drogi podania i selektywności farmakologicznej zależy efekt wywoływany przez poszczególne ligandy receptora H3. Podsumowując różne mechanizmy działania histaminy i ich korelację z formowaniem pamięci można stwierdzić, że działanie histaminy zależy, jak wcześniej wspomniano, także m.in. od poszczególnych obszarów mózgu branych pod obserwację, obserwowanych procesów, typów pamięci i wzajemnej korelacji neuroprzekaźników. W obrębie hipokampa, który jest centrum dla pamięci przestrzennej, histamina działa pozytywnie na modulację tego Rys. 8: Podsumowanie wpływu receptorów histaminowych na elementy w obrębie synaps i ich korelacja z właściwościami kognitywnymi. Wpływ histaminy (HA) na receptory H1 powoduje zwiększenie uwagi, czujności oraz zmniejsza głód (jako efekt wielokierunkowości działania histaminy) [82]. typu pamięci, najprawdopodobniej oddziałując na receptory H1 i H2 w hipokampie według ogólnego, powyżej przedstawionego mechanizmu. Ponadto oddziałuje na receptory NMDA bezpośrednio, poprzez wiązanie się do miejsca dla poliamin w obrębie NMDAR. Wywołuje to aktywację NMDAR i zmiany synaptyczne niezbędne do formowania pamięci długotrwałej :