Spektrometria Mas Analiza jakościowa i ilościowa benzokainy za pomocą wysokorozdzielczego chromatografu gazowego sprzęgniętego ze spektrometrem mas z jonizacją elektronami (EI) Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z techniką spektrometrii mas typu EI (Elektron Impact,) interpretacją, obróbką komputerową widm masowych, doborem mas do analizy ilościowej oraz sposobem identyfikacji substancji na podstawie ich widm. 1. Analiza jakościowa 1.1 Analizie poddany zostanie metanolowy roztwór benzokainy (ester kwasu p- aminobenzoesowego, PABA) o wzorze sumarycznym C 9 H 11 NO 2 i masie molowej 165,19 g/mol. Z otrzymanego roztworu dodaj dokładnie 1,5 ml do fiolki, a następnie szczelnie zakapsluj przy pomocy ręcznej kapslownicy. Fiolkę umieść w odpowiednim gnieździe autosamplera znajdującego się na obudowie chromatografu gazowego. 1.2 Ustaw program analizy chromatograficznej: temperatura pieca: 50 C (1 min.), potem 15 /min.do 200 C, wstrzymać 1 min. temperatura komory nastrzykowej: 250 C, tryb: Split 5:1, Objętość nastrzyku: 1µl, płukanie: dwa razy z fiolki A, dwa razy fiolki B, powtórzyć po nastrzyku Możesz skorzystać z gotowego programu sprawdzając powyższe parametry. 1.3 Wejdź na stronę Tune programu TurboMass i sprawdź czy ciśnienie jest odpowiednie (zbyt mała próżnia spowoduje zniszczenie emitera elektronówżarnika). Następnie ustaw parametry analizy spektrometru masowego trybie Full Scann w zakresie mas od 40 do 180 m/z: Mass start: 40 m/z Mass end:180 m/z Time (okno czasowe w którym wykonywane będzie skanowanie wybranych mas): Start-0; End-12 min. Method: centroid Scan Time (określa czas trwania każdego skanu w sekundach): 0,2 Inter-Scan Deley (określa czas w sekundach pomiędzy zakończeniem skanowania i rozpoczęciem następnego (ogólny czas skanowania=scan Time+ Inter-Scan Deley)): 0.1. Możesz skorzystać z gotowego programu sprawdzając powyższe parametry. 1
1.4 Zapisz swoją analizę w arkuszu analiz wyszczególniając metodę chromatograficzną oraz metodę spektrometrii mas, którą utworzyłeś (pamiętaj o wpisaniu numeru gniazda autosamplera, z którego ma być pobrana analiza). 1.5 Sprawdź szczelność systemu na stronie Tune wpisując masy helu(gazu nośnego) oraz gazów stanowiących główne składniki atmosfery ziemskiej i porównaj proporcje tych pików. 1.6 Jeżeli ciśnienie (próżnia) jest wystarczające oraz nie stwierdzasz przeciekówuruchom analizę. 1.7 Na podstawie wzoru strukturalnego oraz twojej wiedzy z zakresu fragmentacji kationorodników oraz reguły parzystości zaproponuj w poniższej tabeli teoretyczne metody fragmentacji, zaznaczając masę danego fragmentu. Postaraj się nazwać każdy opisany przez ciebie rodzaj fragmentacji np. przegrupowanie McLafferty ego, fragmentacja α inicjowana przez rodnik, fragmentacja α inicjowana przez ładunek itd. Pamiętaj, że produkty nie naładowane dodatnio np. rodniki (w wyniku fragmentacji powstaje kation i rodnik) nie ujawniają się w widmie MS. Podczas opisywania reakcji fragmentacji ładunek umieszcza się w miejscu o najniższym potencjale jonizacji pamiętając, że w rzeczywistości jest on rozproszony w obrębie całej cząsteczki. Pamiętaj, też o efekcie indukcyjnym, który powoduje, iż czasami atom o niskim potencjale jonizacji przyłącza elektron i tworzy obojętny rodnik. Posługuj się kalkulatorami mas znajdującymi się w programie TurboMass lub dostępnymi za darmo w Internecie. 2
Proponowane typy fragmentacji 3
1.8 Po zakończeniu analizy obejrzyj chromatogram (w spektrometrii mas nazywany TIC (Total Ion Current), gdyż powstaje z ogólnego prądu spektrometrii mas). Przeskanuj cały TIC znajdujący się w okolicach 10 min i porównaj czy znalazły się tam masy fragmentów zaproponowane przez ciebie w tabelce powyżej. 1.9 Skorzystaj z dostępnej w programie biblioteki widm masowych, aby potwierdzić czy wybrany pik chromatograficzny należy do benzokainy, pamiętając o użyciu funkcji Combine i odjęciu widma mas tła. 1.10 Obejrzyj widma masowe innych pików znajdujących się na chromatogramie, zidentyfikuj je przy pomocy biblioteki widm i zaproponuj od czego mogą pochodzić np.: adsorbent kolumny, zanieczyszczenie benzokainy, produkt rozkładu benzokainy etc? 1.11 Przy pomocy funkcji Display Mass sprawdź czy pojawiają się w chromatografie piki o masach występujących w benzokainie. 1.12 Oblicz (przy pomocy zainstalowanej aplikacji) wartość stosunku sygnału do szumu. Określ możliwości analizy jakościowej i ilościowej takiego stężenia benzokainy (pamiętając o efekcie matrycy). Za granicę wykrywalności przyjmuje się wartość S/N=3 za granicę oznaczalności S/N=8-10. 1.13 Wybierz i uzasadnij masy które będziesz skanował w trybie SIM (Selected Ion Monitoring) podczas oznaczania benzokainy. 1.14 Wnioski dotyczące analizy jakościowej: 4
2 Analiza ilościowa 2.1 Po wybraniu mas do wykonania analizy w trybie SIM (pamiętając, że wybieramy masy charakterystyczne dla związku i najbardziej intensywne) przejdź do okna analizy MS w trybie SIM/SIR i ustaw następujące parametry: Mass: wpisz wybrane przez ciebie masy i dodaj do tabelki Dwell czyli czas w sekundach, w którym wybrana masa ma być monitorowana: najczęściej wybieramy dziesiąte części sekundy Inter Chennel Delay czyli odpowiednik Inter-Scan Deley z analizy w trybie Full Scan: standardowo ustawiamy 0.1 Span czyli okno mas, margines jaki ma być skanowany w obrębie zadanej masy. Czym większa wartość tym mniejsze prawdopodobieństwo przeoczenia zadanej masy, ale jednocześnie mniejsza czułość analizy: standardowo ustawiamy tę wartość na 1 ( czyli np. skanowana jest wartość powiedzmy 100 to w rzeczywistości skanowane są masy od 80-120 m/z) 2.2 Sporządź 5 roztworów wzorcowych o stężeniach 20, 40, 80, 120, 160 mg/100ml, umieść po 1,5 ml w oznaczonych fiolach i zakapsluj je. 2.3 Umieść w odpowiednich gniazdach autosamplera i wyznacz warunki analizy w arkuszu analiz, zostawiając metodę chromatograficzną taką jak w analizie jakościowej oraz zaznaczając zaprogramowaną przez ciebie analizę w trybie SIM (pamiętaj o zaznaczeniu odpowiednich gniazd autosamplera oraz wykonaniu ponownej analizy badanej próbki w trybie SIM. 2.4 Po wykonaniu analiz, odnajdź pik (TIC) znajdujący się przy czasie retencji zidentyfikowanym (podczas analizy jakościowej) dla benzokainy i wyznacz wartości S/N. Porównaj jak zwiększyła się ta wartość i tym samym SIM wpływa na poprawę czułości analizy. 2.5 Pamiętając, że jest to tylko ogólne oszacowanie, wyznacz jakie stężenia można by zidentyfikować a jakie oznaczyć w trybie SIM (S/N=8-10-granica oznaczalności, S/N=3-granica wykrywalności). 2.6 Zintegruj pik chromatograficzny (TIC) zidentyfikowany jako benzokaina i sporządź krzywą regresji wyznaczając parametry regresji. Następnie oblicz zawartość benzokainy w badanej próbce. W zależności jak postanowi prowadzący ćwiczenia analizę ilościową wykonaj sporządzając ręcznie krzywą wzorcową i obliczając zawartość lub skorzystaj z gotowej aplikacji (wymagającej napisania jednak programu ilościowego) programu TurboChrom. 2.7 Mimo, iż oznaczenie benzokainy wykonane było bez użycia wzorca wewnętrznego opisz jakie korzyści daje użycie metody wzorca wewnętrznego i jaki wzorzec mógłby być tu użyty. 2.8 Pod wnioskami dotyczącymi oznaczenia benzokainy umieść wydruki widm masowych oraz chromatogramy użyte podczas ćwiczeń. 5
2.9 Wnioski dotyczące oznaczenia benzokainy:............ Zakres wiedzy potrzebnej do przystąpienia do ćwiczenia: -budowa spektrometru masowego z elektronowym źródłem jonizacji i pojedynczym kwadrupolem - rodzaje fragmentacji kationów nieparzystoelektronowych -interpretacja widm masowych (typ jonizacji EI) Źródła: Wykłady dla studentów farmacji i oddziału analityki medycznej II roku prof. Z.J Kokot Spektrometria Mas E. de Hoffman, J Charette, V. Stroobant 6