Wykład II Wektory plazmidowe
Terapia genowa Gene therapy wykorzystanie kwasów nukleinowych w charakterze leków Wektor vector Cząsteczka kwasu nukleinowego, służąca do przenoszenia obcego DNA (transgenu)
Wektory Plazmidowe Wirusowe nagi DNA Kompleksy ze związkami kationowymi Kompleksy z białkami osłonek Wirusowych RNA Retrowirusy (w tym lentiwirusy) DNA Adenowirusy AAV Wirus Herpes
Nośnik (vehicle( vehicle) Jon lub związek chemiczny, obdarzony ładunkiem dodatnim, umożliwiający zneutralizowanie ładunku ujemnego kwasu nukleinowego i jego wniknięcie do komórki - jony Ca 2+ -dekstran - liposomy kationowe - polipeptydy - dendrymery
Inne użyteczne terminy Tranformacja bakterii Modyfikacja fenotypu bakterii poprzez wprowadzanie genów za pomocą plazmidowego DNA Transfekcja Wprowadzanie genów do komórek eukariotycznych za pomoca wektorów niewirusowych Transdukcja Wprowadzanie genów do komórek eukariotycznych za pomoca wektorów wirusowych Klonowanie molekularne Uzyskiwanie wielu identycznych kopii genów, np. przez powielanie plazmidowego DNA w bakteriach
Terapia genowa Wzmacniająca Substytucyjna Hamująca wzmocnienie wprowadzenie hamowanie ekspresji ekspresji genów brakującego genu genów(np. za pomocą oligonukleotydów antysensowych) Nowotwory Choroby układu krążenia Choroby dziedziczne (wrodzone błędy metaboliczne, mukowiscydoza, dystrofia mięśniowa ) Nowotwory Choroby układu krążenia
Terapeutyczne kwasy nukleinowe DNA RNA Geny (Wektory DNA) Sekwencje niekodujące Geny (wektory RNA) Sekwencje niekodujące Oligonukleotydy Antysensowe Pułapki oligonukleotydwe rybozymy sirna
Rodzaje terapii genowej - somatyczna - komórek linii płciowej
Ekspresja genów w komórkach eukariotycznych wymaga zastosowania odpowiedniego promotora w wektorze plazmidowym 1. Promotor wirusowy 2. Promotor eukariotyczny - konstytutywne - indukowane 3. Złożone
Geny reporterowe Gen używany do badania skuteczności transfekcji. Gen reporterowy powinien być łatwy do wykrycia i nie powinien to być gen naturalnie obecny w transfekowanych komórkach.
Geny reporterowe CAT (acetylotransferaza Chloramfenikolu) Lucyferaza β-galaktozydaza Zielone białko fluorescencyjne (GFP) Wydzielnicza fosfataza alkaliczna (SEAP) Ludzki hormon wzrostu β-glukuronidaza
Wykrywanie ekspresji genów reporterowych -testy autoradiograficzne - testy kolorymetryczne - emisja fluorescencji - emisja chemilumienscencji -Wykrywanie białka: testy ELISA
Tabela. Geny reporterowe Gen Testy in vitro Zalety Wady Zastosowanie CAT (acetylotransferaza chloramfenikolu) Lucyferaza a) świetlika Photinus pyralis b) żebropława Renilla reniformis (sea pansy) β-galaktozydaza Wydzielnicza fosfataza alkalicza (SEAP) Zielone białko fluorescencyjne (GFP) Ludzki hormon wzrostu (HGH) B-glukuronidaza (GUS) o Chromatografia, Fluorescencja, immunoassay Bioluminescencja Kolorymetryczna Fluroymetryczna chemilumienscencyjna Chemiluminescencyjna, Kolorymetryczna Fluorescencja Radioimunnoassay Kolorymetryczna Fluorescencyjna Chemiluminescencyjna Minimalna aktywność endogenna w komórkach ssaków Nieizotopowe, Wysoka czułośc, niska niepecyficzna aktywność Assay in vivo Nieizotopowa, Liczne testy, stosowana jako kontrola do mormalizacji tranefkcji innych genów Assay in vivo Nieizotopowa, Białko wydzielnicze Bardzo czuła, możliwośc analizy wielu próbek Pozwala na badanie ekspresji w żywych komórkach, fluorescencja jest cechą białka nie są potrzebne żadne dodatkowe substraty Białko wydzielnicze, bezpośrednie wykrywanie białka, prosty test Test in vivo Nieizotopowa, stabilne białko, bardzo wysoka czułość testu chemiluminescencyjnego Praco- i czasochłonne Brak testów in vivo; białko ma okres półtrwania 50 godzin Krótki okres półtrwania białka, Kosztowny sprzęt Wysoka endogenna ekresja B- galaktozydaza w wielu typach komórek Brak testów in vivo Czułość może być zbyt mała, ale znane sa mutanty Test radioaktywny, stosunkowo niska czułość, kosztowny Najczulsze testy wymagają sprzętu
CAT katalizuje transfer grup acetylowych z acetylo koenzymu A na chloramfenikol Enzym prokariotyczny Bialko jest bardzo stabilne (okres półtrwania 50 godzin) Wykrywanie: Test radioaktywny Rozdział form acetylowanych od nieacetylowanych za pomocą chromatografii cienkowarstwowej Możliwa ekstrakcja dla oceny ilościowej Dostępne także testy nieizotopowe: ELISA
Geny reporterowe - β-galaktozydaza -hydroliza β-galaktozydów, najczęściej X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-B-D-galaktozyd --może być używana (mierzona) w tym samych ekstraktach co lucyferaza i CAT -testy kolorymetryczne: ONPG (o-nitrofenyl-b-d-galaktopiranozyd fluorymetryczne: MUG 4-methylumbelliferyl-b-D-galaktozyd chemiluminescencyjne 1,2-dioeksyetan Możliwy test przyżyciowy substrat di-b-d-galaktopyranozyd rozkładany przez β-galaktozydazę, produkt wykrywany przez fluorescencję
Lucyferaza -świetlika Photinus pyralis i żebropława Renilla reniformis -Reakcja bioluminescencyjna wymaga substratu lucyferyny ATP, -Jonów magnezu i tlenu. -Emisja światła szybko wygasa -Lucyferaza ma krótki okres półtrwania około 3 godzin -- wysoka czułośc Lucyferaza żebropława jako substratu używa celenterazyny
Zielone białko fluorescencyjne -z Aequorea victoria: ekworyna emituje niebieskie światło po związaniu jonów wapnia. Światło to absorbuje białko GFP, emitując równocześnie światło zielone Ekspresja GFP w innych organizamach powoduje zieloną fluorescencję po pobudzeniu światłem niebieskim lub UV
Transfekcja przejściowa i stabilna Transfekcja plazmidem zawierającym gen selekcyjny, np. gen oporności na neomycynę. Po transfekcji komórki są hodowane w pożywce zawierającej neomycynę (lub jej analog, jak G418). Komórki, które nie zostały stransfekowane plazmidem z genem Neo R, nie produkują enzymu rozkładającego G418 i giną. Przeżywają tylko komórki stabilnie stransfekowane plazmidem z genem selekcyjnym.
Selekcja komórek stabilnie transfekowanych 1. Geny oporności a) na antybiotyki aminoglikozydowe transferaza neomycyny b) hygromycynę fosfotransferaza hygromycyny B c) puromycynę d) zeocynę (bleomycyna).
Antybiotyki selekcyjne Antybiotyk Gen oporności Mechanizm działania Stężenie Genetycyna (G418) APH(3 ) I, APH(3 )II Blokuje translację w 50 1000 µg/ml komórkach eukariotycznych, interefrując z podjednostką rybosomu 80S Hygromycyna B Hph Wpływ na translokację, 50-1000 µg/ml zaburzenia wbudowywania aminokwasów Puromycyna Pac Hamuje translację 1-10 µg/ml Zeocyna Sh ble Wiąże się z DNA 0,5-1000 µg/ml Fleomycyna Sh ble Wiąże się z DNA 0,1-50 µg/ml Blasticydyna S Bcs, BCD Hamuje translację 3-50 µg/ml
Sposoby transfekcji plazmidowego DNA nagi DNA (metody fizyczne) nośniki chemiczne iniekcja elektroporacja Biolistyczna (strzelba genowa) mikroiniekcja makroiniekcja mała objętość Duża objętość (metoda hydrodynamiczna)
Elektroporacja 1. Siła przyłożonego pola elektrycznego -w większości komórek ssaczych maksymalna wydajność transfekcji jest uzyskiwana kiedy napięcie wynosi od 250V/cm do 750 V/cm Przeżywa około 20-50% komórek 2. Czas trwania impulsu elektrycznego - 20-100 msec 3. Temperatura 0 O C lub pokojowa 4. Skład jonowy środowiska Wydajność jest wielokrotnie wyższa gdy komórki są zawieszane w buforowanych roztworach soli (np.. HEPES) niż w roztworach substancji niejonowych takich jak manitol czy sacharoza
Makroiniekcja
Wstrzyknięcie nagiego DNA do mięśnia szkieletowego - ekspresja β-galaktozydazy
Transfekcja nagiego DNA 1. Rodzaje komórek 2. Maksimum ekspresji po 14 dniach w mięśniach 3. Utrzymywanie DNA we włóknach mięśniowych większość w postaci kolistej; ekspresja nawet do 2 lat 4. Regeneracja mięśni umożliwia większą ekspresję 5. Promotory wirusowe lepsze niż tkankowo specyficzne 6. Zależność wydajności transfekcji od wielkości zwierzęcia
Nagi DNA zastosowania 1. Terapia dystrofii mięśniowej Duchenna; myszy mdx 2. Transfer genów białek wydzielniczych, np.. VEGF 3. Zwierzęce modele chorób autoimmunologicznych 4. Szczepionki genowe
VEGF - a major angiogenic growth factor VEGF stimulates the formation of new blood vessels, acting as a mitogen for endothelial cells. Insuffcient vascularization leads to heart or peripheral muscle ischemia and is an inherent feature of cardiovascular diseases. Gene therapy with VEGF has been considered as a way to stimulate angiogenesis and ameliorate the effect of ischemia It has been also assumed that gene delivery with relatively weak plasmid vectors will be more safe, producing small amounts of therapeutically effective VEGF, but will not exert the side effects, which may be expected with strong vectors
Uzyskanie plazmidowych wektorów ekspresyjnych z genem czynnika wzrostu śródbłonka naczyń (VEGF) 1. Uzyskanie plazmidów (nie-ekspresyjnych) z cdna izoform ludzkiego genu VEGF 165 oraz VEGF 121 2. Uzyskanie dużych ilości plazmidu pgem-vegf. Wycięcie cdna za pomocą enzymu BamH1 3. Przecięcie za pomocą enzymu BamHI plazmidu psg5 (Stratagene) (plazmid posiada gen oporności na ampicilinę). 4. Wklonowanie sekwencji cdna VEGF do plazmidu VEGF. 5. Transformacja bakterii kompetentnych plazmidem ( mieszaniną ligacyjną ) 6. Selekcja bakterii na agarze zawierającym amipicilinę 7. Namnożenie w bulionie pojedynczych klonów bakterii wyrosłych na agarze 8. Izolacja plazmidowego DNA 9. Sprawdzenie plazmidowego DNA za pomocą trawienia enzymem retsrykcyjnym BamHI 10. Transfekcja uzyskanych plazmidów psg5vegf 165 oraz psg5vegf 121 do komórek mięśni gładkich szczura przy pomocy liposomów. 11. Zbadanie produkcji VEGF: test ELISA, barwienie immunohistochemiczne 12. Doświadczenia na zwierzętach.
VEGF gene transfer in vitro psg5vegf 165 plasmid (contains human VEGF 165 cdna driven by weak viral SV40 promoter) transfection in vitro to rat VSMC results in generation of large amounts of human VEGF despite low transfection efficiency, typical for these cells; released VEGF is biologicaly active and enhances proliferation of endothelial cells human VEGF ng/ml medium VEGF production by transfected cells 3 2 1 0 Control βgal VEGF 48 h VEGF 72 h β-gal expression VEGF expression Jozkowicz et al., Clin Chim Acta, 1999: 288:1-19 Dulak et al, Vasc Med, 2000;5:33-40
Injection of naked human VEGF DNA into rabbit ischemic skeletal muscle results in expression of human transgene and protein release Human VEGF protein in the blood of transfected rabbits 10 psg5vegf 165 VEGF pg/ml 8 6 4 human VEGF 165 rabbit VEGF 165 rabbit VEGF 121 2 RT-PCR - adductor muscle 0 β-gal psg5vegf 165 Dulak et al, Eur Surg 2002:34:105-110
Naked VEGF gene transfer increases the number of microvessels in the ischemic rabbit skeletal muscles alkaline phosphatase-positive microvessels in muscle transfected with control plasmid microvessels in muscle transfected with VEGF plasmid 2 Vessels/mm 300 200 100 p<0.01 0 β gal transfected VEGF transfected Dulak et al, Eur Surg 2002:34:105-110
Nośniki chemiczne plazmidowego DNA Jony Ca 2+ DEAE-dekstran Związki wielkocząsteczkowe Lipidy i lipsomy Polipeptydy Polimery dendrymery