REGULACJA METABOLIZMU

REGULACJA METABOLIZMU Zbiór ćwiczeń dla studentów III roku kierunku Biologia oraz studentów I roku MU na kierunku Biologia (spec. BKiO) i na kierunku Biotechnologia (spec. Biol.Mol., Biotech. lub Biot.Med.) Zakład Regulacji Metabolizmu Instytut Biochemii UW

Spis treści I. Aktywność glikolityczna w homogenacie mózgu str. 3 II. Transport anionów przez błonę mitochondrialną str. 7 III. Metabolizm glikogenu w homogenacie wątroby str.10 IV. Metabolizm argininy w mitochondriach str.13 V. Karboksylacja pirogronianu w mitochondriach wątroby str.16 VI. Wpływ różnych efektorów na aktywność dehydrogenazy glutaminianowej w mitochondriach wątroby lub nerki str.20 Oznaczanie fosforu metodą Fiske-Subbarowa Oznaczanie białka metodą biuretową str.23 str.24 2

1. AKTYWNOŚĆ GLIKOLITYCZNA W HOMOGENACIE MÓZGU Glikoliza w tkankach zwierzęcych polega na przekształceniu glukozy w mleczan w procesie obejmującym szereg reakcji enzymatycznych, czemu towarzyszy wytworzenie 2 moli ATP na jeden mol zużytej glukozy. Aktywność glikolityczna jest uwarunkowana obecnością ATP i NAD +. ATP jest niezbędny do fosforylacji glukozy i fruktozo-6-fosforanu w reakcjach katalizowanych przez heksokinazę i fosfofruktokinazę. NAD + jest koenzymem dehydrogenazy aldehydu 3-fosfoglicerynowego. Oznaczenie aktywności glikolitycznej polega na pomiarze ubytku glukozy i fosforanu z mieszaniny reakcyjnej, oraz na oznaczeniu wytworzonego mleczanu. Stężenie glukozy oznacza się kolorymetrycznie mierząc produkt jej reakcji z kwasem dinitrosalicylowym. Fosforan oznacza się metodą Fiske-Subbarowa (patrz. odp. rozdział), a obecność mleczanu w mieszaninie reakcyjnej wykrywa się spektrofotometrycznie na podstawie redukcji NAD + w reakcji katalizowanej przez dehydrogenazę mleczanową. Materiały i odczynniki 1. Homogenat mózgu: mózg szczura lub królika homogenizować przez 20 s w czterokrotnej objętości zimnego, 1 mm buforu osforanowego o ph 7,4. Homogenat przygotować bezpośrednio przed rozpoczęciem inkubacji i przechowywać w łaźni lodowej. 2. 50 mm glukoza 3. 0,2 M bufor fosforanowy (zrobiony, 4 0 C) 4. 0,1 M amid kwasu nikotynowego 5. Mieszanina podstawowa o składzie: 25 mm glukozy, 15 mm bufor fosforanowy, 25 mm amid kwasu nikotynowego. Do kolbki miarowej odmierzyć odpowiednie ilości odczynników: 2, 3,4 i uzupełnić wodą do 25 ml. 6. 80 mm M MgCl 2 (zrobiony, 4 0 C ) 7. 5 mm NAD + 8. 7 mm zobojętniony ATP (zrobiony, -20 0 C ) 9. 0,25 M KHCO 3 (zrobiony, RT) 10. 35 % kwas nadchlorowy (PCA) (zrobiony, RT) 11. 3 M K 2 CO 3 (zrobiony, RT) 12. 5 M KOH (zrobiony, pod wyciągiem) 13. Odczynniki do oznaczania fosforu (patrz rozdział Oznaczanie fosforu ) 3

14. Standardowy roztwór glukozy (2 mg/ml) 15. 1 % roztwór dinitrosalicylowego w 0,4 M NaOH. (zrobiony, RT) 16. Bufor do oznaczania mleczanu o składzie: 0,4 M wodzian lub siarczan hydrazyny, 1 M glicyna, 5 mm EDTA; ph 9.5 (ph doprowadzić za pomocą 5 M KOH - zużywa się go ok. 10 ml!). Należy przygotować 50 ml buforu (w dniu oznaczania mleczanu!) 17. Roztwór NAD (60 mg/ ml) 18. Roztwór dehydrogenazy mleczanowej (wydaje prowadzący) Wykonanie a. Czynności przygotowawcze Nastawić temperaturę łażni wodnej na 37 0 C. Przygotować 4 serie ponumerowanych probówek; - 3 probówki ok. 10 ml do przeprowadzenia inkubacji - 9 ponumerowanych od 1 do 9 probówek typu Eppendorf zawierających 0,1 ml 35 % PCA - 9 probówek ok. 10 ml do zobojętniania prób - 9 probówek typu Eppendorf do przechowywania prób. b. Przeprowadzenie inkubacji Do 3 ponumerowanych probówek odmierzyć poszczególnie składniki mieszaniny reakcyjnej wg. Tabeli (objętości podano w ml) Składniki Numer probówki 1 2 3 Mieszanina podstawowa 1,6 1,6 1,6 Woda - 0,4 0,4 MgCl 2 0,4 0,4 0,4 NAD 0,4-0,4 ATP 0,4 0,4 - KHCO 3 0,4 0,4 0,4 Uwaga, do pipetowania homogenatu używać końcówek do pipet skróconych skalpelem o ok. 2 mm. Przed rozpoczęciem reakcji mieszaniny reakcyjne inkubować w 37 0 C co najmniej 3 min. 4

Homogenat mózgu zamieszać. Reakcje rozpocząć dodaniem dokładnie 0,8 ml homogenatu do probówki nr 1. Właczyć stoper, zamieszać zawartość probówki i szybko pobrać 1 ml mieszaniny, przenieść ją do probówki Eppendorfa nr 1 zawierającej PCA. Probówkę nr 1 z mieszaniną reakcyjną ponownie umieścić w łażni. Po 1 min dodać 0,8 ml homogenatu do probówki nr 2 i jak poprzednio, po wymieszaniu, pobrać 1 ml do odpowiedniej probówki Eppendorfa. Po upływie kolejnej minuty rozpocząć reakcję w probówce nr 3, pobierając również i z niej próbę odpowiadającą czasowi 0 min. Po inkubacji z probówek 1, 2,3 pobrać w odstępach 1 min po 1 ml i przenieść do probówek Eppendorfa (4, 5, 6) zawierających PCA. Czas 30 min pobrać odpowiednio do probówek Eppendorfa nr (7, 8, 9). W ten sposób otrzymuje się próby do oznaczania fosforu, glukozy, i mleczanu odpowiadające 0, 15, 30 min inkubacji. c. Przygotowanie prób do oznaczania Próby zawierające wytrącone białko należy odwirować w mikrowirówce przez 2 min. Supernatanty przenieść do odpowiednich probówek, a następnie zawartość każdej z nich zobojętnić za pomocą 3 M węglanu potasowego. Wartość ph należy kontrolować za pomocą papierka lakmusowego. Zanotować objętość roztworu węglanu zużytą do zobojętniania każdej próby (do zobojętniania 1 ml supernatantu zużywa się około 91 µl węglanu). Po zobojętnieniu próby należy przenieść do próbówek typu Eppendorf i wstawić na 12-15 min do zamrażalnika, a następnie osad nadchloranu zwirować. Suprnatant przenieść do odpowiednich probówek Eppendorfa. Próby przechowujemy zamrożone. d. Oznaczanie glukozy Jednocześnie z oznaczaniem glukozy w badanych próbach należy wykonać krzywą wzorcową. Do probówek na typu Eppendorf należy odmierzyć w dwóch powtórzeniach odpowiednie objętości roztworu wzorcowego tak, by zawierały 0; 0,1; 0,2; 0,4; 0,6 lub 0,8 mg glukozy. Objętość roztworu w każdej probówce należy dopełnić wodą destylowaną do 1 ml, a następnie dodać 0,175 ml 1% roztworu kwasu dinitrosalicylowego w 0,4 M NAOH. Z badanych prób pobrać po 0,15 ml roztworu i przenieść do ponumerowanych próbówek. Do każdej próbówki dodać 0,85 ml wody destylowanej, a następnie 0,175 ml roztworu kwasu dinitrosalicylowego. Zawartość wszytykich probówek wymieszać i wstawić je do termobloku na 100 0 C na 10 min. Po wyjęciu probówki ostudzić i zmierzyć absorpcję prób przy 550 nm wobec próby odczynnikowej (bez glukozy). 5

e. Oznaczanie fosforu Do 9 probówek (na 10 ml) odmierzyć po 0,05 ml prób badanych, dopełnić wodą do 2,5 ml, a do probówki 10 odmierzyć 2,5 ml wody destylowanej. Następnie do każdej probówki odmierzyć w kolejności odczynniki do oznaczania fosforu wg przepisu w rozdziale Oznaczanie fosforu.... Zawartość fosforu odczytać ze sporządzonej jednocześnie z próbami badanymi krzywej wzorcowej. f. Oznaczanie mleczanu Do kuwet spektrofotometrycznych odmierzyć po 14 20 µl buforu do oznaczania mleczanu, 40 µl roztworu NAD (60 mg/ml) oraz 10 µl roztworu dehydrogenazy mleczanowej. Zawartość kuwet wymieszać za pomocą plastikowej szpatułki i zmierzyć początkową wartość absorpcji przy 340 nm wobec próby zawierającej bufor ( odczyt zanotować dopiero po ustabilizowaniu się wskazań przyrządu, czyli po ok. 10 minutach. Następnie dodać 30 µl próby badanej, roztwór dokładnie wymieszać i po 15 minutach odczytać zmianę absorbcji. Obliczyć stężenie mleczanu w badanych próbach wiedząc, że milimolowy współczynnik absorbancji dla NADH przy fali o długości 340 nm wynosi 6,22. Opracowanie wyników Obliczyć ile µmoli glukozy, fosforanu i mleczanu znajdowało się w mieszaninie reakcyjnej w poszczególnych próbach (µmol/g mózgu). Na podstawie różnic w oznaczeniach glukozy, fosforanu i mleczanu obliczyć: 1. Ile µmoli glukozy i fosforanu ubyło z mieszaniny reakcyjnej oraz ile mleczanu powstało w wyniku glikolizy. 2. Jaki jest stosunek zużycia fosforanu do ilości wykorzystanej glukozy. 3. Jaki jest stosunek ilości wytworzonego mleczanu do ilości zużytej glukozy. Wyniki zestawić w tabeli. 6

II. TRANSPORT ANIONÓW PRZEZ BŁONĘ MITOCHONDRIALNĄ Istnienie wewnątrzkomórkowych struktur i przestrzeni ograniczonych błonami o wyspecjalizowanych funkcjach biochemicznych jest ważnym czynnikiem regulacyjnym w metabolizmie komórki. Decydującą rolę odgrywa tu wybiórcza półprzepuszczalność tych błon oraz związane z tym procesy ułatwionego i aktywnego transportu metabolitów. Właściwie tylko woda i rozpuszczone w niej gazy; CO 2, O 2, NH 3, przenikają swobodnie przez błonę mitochondrialną na zasadzie dyfuzji. Kwasy di-, trikarboksylowe, pośredniki cyklu kwasów trikarboksylowych, mogą być transportowane do mitochondriów w wyniku istnienia swoistych przenośników. Wielu danych o transporcie metabolitów przez błonę mitochondrialną dostarczyły badania szybkości pęcznienia mitochondriów zawieszonych w izoosmotycznych roztworach soli amonowych. Pomiar pęcznienia przeprowadza się spektrofotometrycznie przy długości fali 520 nm. Materiały i odczynniki 1. Mitochondria z wątroby lub nerki szczura lub królika (wydaje prowadzący) 2. 20 mm buforu TRIS- HCl ph 7,4 3. 1 mm roztwór rotenonu w etanolu (wydaje prowadzący) 4. 0,2 M roztwór kwasu glutaminowego zobojętniony 3 M roztworem NH 3, ph 7,4 5 0,2 M roztwór kwasu glutaminowego zobojętniony 2 M roztworem KOH, ph 7,4 6. 0, 15 M roztwór kwasu cytrynowego zobojętniony 3 M roztworem NH 3, ph 7,4 7. 60 mm roztwór jabłczanu zobojętniony (na papierek lakmusowy) 2 M roztworem Tris 8 0,2 M roztwór jabłczanu zobojętniony 3 M roztworem NH 3, ph 7,4 9 0,3 M roztwór octanu amonowego 10 0,3 M roztwór chlorku potasowego 11 0,6 M roztwór fosforanu potasowego 12 0,6 M roztwór sacharozy Wykonanie a. Czynności przygotowawcze: Na 10 min przed pomiarem włączyć spektrofotometr i ustawić długość fali na 520nm. Przygotować 2 kuwety. Do jednej z nich (A) odmierzyć 1,5 ml wody destylowanej (próba odniesienia), do drugiej (B) 700µl buforu Tris-HCl o ph 7,4; 700 µl sacharozy i 5µl rotenonu. Kuwety umieścić w spektrofotometrze. Do kuwety B dodać 10 µl zawiesiny mitochondriów i 7

natychmiast zmierzyć absorbcję proby. Na podstawie uzyskanych wyników rozcieńczyć zawiesine mitochondriów tak, aby po dodaniu jej w ilości 10 do kuwety zawierającej roztwór sacharozy z rotenonem wartość absorpcji próby mierzona przy 520 nm wynosiła około 0,800-0,990. (Uwaga - mitochondria należy rozcieńczyć 0,3 M mannitolem). Tak rozcieńczone mitochondria stosować do dalszych badań. b. Oznaczanie pęcznienia mitochondriów Do suchych szklanych kuwet spektrofotometrycznych odmierzyć poszczególne składniki mieszaniny w ilościach podanych w Tabeli w µl. Poszczególne kuwety umieszczać kolejno w spektrofotometrze, stosując jako próbę odniesienia wodę destylowaną. Szybkość pęcznienia mitochondriów w kuwecie badać dodając do niej 10µl upszednio przygotowanej zawiesiny mitochondriów i mierząc wartość absorbcji przy 520 nm po 15 sekundach od dodania mitochondriów. Kolejne trzy pomiary absorpcji wykonywać co 15 sekund od momentu dodania mitochondriów, a następnie w odstępach 30 sekund notując zmiany absorpcji przez 6 minut. Analogiczne pomiary wykonać dla pozostałych prób. Składniki 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 mieszaniny reakcyjnej Bufor Tris-HCl 700 700 700 700 700 700 700 700 700 700 Sacharoza 700 KCl 700 Glutaminian 700 potasowy Glutaminian 700 amonowy Cytrynian 700 700 700 amonowy Fosforan potasowy 50 50 50 Jabłczan-Tris 50 Jabłaczan 700 700 amonowy Octan amonowy 700 Rotenon 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 8

Opracowanie wyników Wyniki uzyskane dla poszczególnych prób przedstawić w postaci wykresu, odkładając na osi odciętych czas pomiaru pęcznienia mitochondriów, a na osi rzędnych wartość absorpcji przy 520 nm. Wyjaśnić różnicę szybkości pęcznienia mitochondriów w obecności różnych substratów. 9

III. METABOLIZM GLIKOGENU W HOMOGENACIE WĄTROBY Proces degradacji glikogenu przebiega w wątrobie i w mięśniach, które cechuje duża zawartość tego wielocukru. Rozkład glikogenu jest katalizowany przez fosforylazę glikogenu: glikogen (n reszt glukozy) + fosforan glikogen (n - 1 reszt glukozy) + glukozo-1-fosforan In vivo równowaga tej reakcji jest znacznie przesunięta w kierunku degradacji glikogenu. Jednakże w określonych warunkach in vitro szybkość reakcji w kierunku przeciwnym jest 3- krotnie wyższa niż w kierunku fizjologicznym. Fosforylaza glikogenu występuje w dwóch formach aktywnej (fosforylaza a) oraz znacznie mniej aktywnej (fosforylaza b), której inhibitorem jest kofeina. W obecności kinazy fosforylazy i ATP forma b może zostać przekształcona w formę a. Forma a przechodzi w formę b przy udziale fosfatazy fosforylazy. W ćwiczeniu aktywność fosforylazy jest mierzona szybkością uwalniania fosforanu z glukozo -1-fosforanu. Odczynniki 1. 0,9 % NaCl 2. 0,5 M glukozo- 1- fosforan (zrobiony, -20 0 C ) 3. 10 % roztwór glikogenu 4. 1 M NaF 5 Roztwór kofeiny [10 mg/ml] 6. Odczynniki do oznaczania fosforu metodą Fiske-Subbarowa (Patrz: rozdz. Oznaczanie fosforu ) 7. 0,2 M AMP (zrobiony, -20 0 C ) 8. 35 % kwas nadchlorowy (PCA) (zrobiony, RT) Przygotowanie homogenatu wątroby Pobraną ze zwierzęcia wątrobę umieścić w zlewce z oziębionym 0,9% NaCl. Zważyć 5g wątroby, rozdrobnić ją skalpelem, a następnie zhomogenizować w 20 ml oziębionego roztworu NaCl. Homogenat przesączyć przez 2 warstwy gazy opatrunkowej. 10

Przeprowadzenie inkubacji Do 12 ponumerowanych probówek Eppendorfa dodać po 20 µl PCA. Do 4 probówek (A, B, C, D) odmierzyć składniki mieszaniny reakcyjnej wg Tabeli (wartości podano w µl). Substrat A B C D Glukozo-1-P 60 60 60 60 Glikogen 200 200 200 200 NaF - 200 200 200 kofeina - - 10 - AMP - - - 40 Woda 240 40 30 - Zawartość probówek wymieszać i preinkubować przez 5 min w łaźni wodnej o temperaturze 37 0 C. Reakcje enzymatyczną rozpocząć dodaniem do probówki A 0,5 ml ogrzanego w łaźni homogenatu wątroby (do pipetowania użyć ściętej końcówki). Włączyć stoper i zamieszać zawartość probówki. Szybko pobrać 200 µl mieszaniny i przenieść do probówki Eppendorfa nr 1 zawierającej PCA. Po upływie 1 min dodać 0,5 ml homogenatu do probówki B, pobierając po 200 µl próby do probówki Eppendorfa nr 2. Po upływie kolejnej minuty rozpocząć reakcję w probówce C, a następnie w D, pobierając po 200 µl próby do probówek Eppendorfa odpowiednio nr 3 i 4. Kolejne próby pobierać w 10 i 20 min z probówki A, w 11 i 21 min z probówki B, w 12 i 22 min z C, a w 13 i 23 min z D. Przygotowanie prób do oznaczeń Próby zawierające wytrącone białko wirować przez 1 min w mikrowirówce. Supernatanty przenieść do probówek Eppendorfa i użyć bezpośrednio do oznaczeń lub przechowywać zamrożone. Oznaczanie fosforu w badanych próbach i opracowanie wyników Do probówek dodać 75 µl badanych prób i dopełnić wodą do 2,5 ml. Jednocześnie przygotować krzywą wzorcową do oznaczeń fosforu wg przepisu zawartego w rozdziale Oznaczanie fosforanu metodą Fiske Subbarowa, dodając kwas trójchlorooctowy, kwaśny roztwór molibdenianu amonowego i odczynnik redukujący również do prób badanych. Dalej postępować zgodnie z przepisem. Wykreślić krzywe obrazujące przebieg reakcji w 11

poszczególnych próbach odkładając na osi Y ilość µmoli P/ml mieszaniny reakcyjnej, a na osi X - czas w minutach. 12

IV. METABOLIZM ARGININY W MITOCHONDRIACH Amoniak powstając w wyniku przemian związków azotowych jest usuwany z organizmów ssaków w postaci mocznika dzięki działania enzymów cyklu mocznikowego. Arginaza, katalizująca ostatnią reakcję cyklu, powoduje rozkład argininy z wytworzeniem mocznika i ornityny. Enzym ten występuje we frakcji cytolosowej wątroby oraz w mitochondriach wątroby, nerki i innych tkanek. W mitochondriach, w obecności 2-oksoglutaranu, ornityna podlega następnie reakcji transaminacji katalizowanej przez aminotransferazę ornitynową z utworzeniem glutaminianu. Aktywność arginazy oznacza się na podstawie pomiaru ilości ornityny uwolnionej w trakcie inkubacji, aminotransferazy zaś na podstawie ilości wyprodukowanego glutaminianu. Aminokwasy w próbach oznacza się za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej w układzie z odwróconymi fazami (RP-HPLC). Przed przeprowadzeniem chromatografii aminokwasy przeprowadza się w pochodne DABSYLowe, co umożliwia pomiar stężenia w zakresie światła widzialnego (maksimum absorpcji 436 nm) Aminokwas (NH 2 ) + DABS (SO 2 Cl) Aminokwas (NHSO 2 ) DABS Rozdziału aminokwasów dokonuje się na kolumnie Spherogel C 18. Fazą ruchomą są: bufor octanowy ph 3,5 oraz acetonitryl. Chromatografię rozwija się w gradiencie liniowym zaczynając od 20% acetonitrylu i zwiększając jego stężenie do 70% w ciągu 25 min. Odczynniki 1. Mitochondria izolowane z wątroby lub nerki królika (wydaje prowadzący) 2. Mieszanina podstawowa o składzie: 0,24 M mannitol., 20 mm bufor fosforanowy; ph 7,4 (przygotować w dniu inkubacji) 3. 0,1 M roztwór kwasu aminooksyoctowego (AOA) zobojętniony za pomocą 3M KOH (zrobiony, -20 0 C ) 4. 0,1 M zobojętniony roztwór kwasu 2- oksoglutarowego (na papierek lakmusowy) 5. 0,2 M roztwór argininy zobojętniony za pomocą HCl (na papierek lakmusowy) 6. 0,1 M zobojętniony roztwór kwasu jabłkowego (na papierek lakmusowy) 7. Metanolowy roztwór rotenonu (0,2 mg/ml) (wydaje prowadzący) 8. 8 mm roztwór chlorku dabsylu w acetonie (wydaje prowadzący) 13

9. 0.4 M bufor węglanowy ph 9,0 (wydaje prowadzący) 10. 35 % roztwór kwasu nadchlorowego (zrobiony, RT) 11. 3 M roztwór K 2 CO (zrobiony, RT) 12. Odczynnik biuretowy do oznaczania białka (zrobiony, RT) 13. 10 % roztwór dezoksycholanu sodowego (zrobiony, RT) 14. 70% etanol (wydaje prowadzący) Wykonanie Do naczynek inkubacyjnych odmierzyć składniki mieszaniny reakcyjnej w ilościach podanych w tabeli (µl): Składniki 1 2 3 4 5 Mieszanina 1000 1000 1000 1000 1000 podst. Arginina 50 50 50 50 50 2-OG - 40 40 40 40 Jabłczan - - 20-20 AOA - - - 40 40 Rotenon 20 20 20 20 20 Woda 830 790 770 750 730 Naczynka preinkubować w temperaturze 30 0 C przez 5 minut, a następnie rozpocząć reakcje enzymatyczne poprzez dodanie po 100 µl zawiesiny mitochondriów do każdego naczynka w odstępach 1-minutowych. Po 40 minutach inkubacje przerwać pobierając 1 ml próby do probówek Eppendorfa zawierających po 100 µl 35% PCA. Próby wymieszać i schłodzić przez 10 min w zamrażalniku. Następnie próby zwirować, przenieść supernatanty do odpowiednio oznaczonych probówek i zobojętnić je za pomocą 3 M węglanu potasowego (należy użyć około 100 µl węglanu na 1 ml supernatantu). Zobojętnione próby ponownie schłodzić, a następnie ciecze znad osadów przenieść do probówek Eppendorfa i odwirować pozostałości osadu. Nie zapomnieć o oznaczeniu białka mitochondrialnego (wg przepisu w rozdziale Oznaczanie białka metodą biuretową ). 14

Przygotowanie prób do chromatografii (dabsylacja) Wszystkie czynności należy wykonywać pod kierunkiem prowadzących. Do podpisanych kalibrowanych probówek Eppendorfa dodać po 50 µl buforu węglanowego ph 9,0, a następnie 50 µl zobojętnionej próby oraz 200 µl roztworu DABS w acetonie. Zawartość probówek wymieszać zgodnie ze wskazówkami otrzymanymi od prowadzących. Następnie probówki umieścić na 10 min w cieplarce rozgrzanej do temperatury 70 0 C. Po upływie tego czasu probówki wyjąć z cieplarki, delikatnie wymieszać ich zawartość i z powrotem wstawić do cieplarki na dalszych 10 min. Po zakończeniu dabsylacji próby uzupełnić do 0,5 ml za pomocą 70 % etanolu i wymieszać za pomocą mieszadła elektrycznego. Tak przygotowane próby można przechowywać zamrożone. Chromatograficzny rozdział aminokwasów jest wykonywany przez prowadzących. Studenci interpretują otrzymane chromatogramy. Opracowanie wyników Obliczyć ilość ornityny i glutaminianu w próbach. Wyniki wyrazić w nmol/mg białka. 15

V. KARBOKSYLACJA PIROGRONIANU W MITOCHONDRIACH WĄTROBY Pierwszy etap glukoneogenezy - karboksylacja pirogronianu z wytworzeniem szczawiooctanu, katalizowana przez karboksylazę pirogronianową (ligazę pirogronian : CO 2 ; EC 6.4.1.1), zachodzi w mitochondriach zgodnie z następującym równaniem: Pirogronian + ATP + HCO 3 - AcetyloCoA, Me +2 ---------------------- szczawiooctan + ADP + fosforan Stwierdzono, że szybkość karboksylacji pirogronianu może być regulowana przez kwasy tłuszczowe. Związki te są wykorzystywane mitochondriach jako substraty oddechowe, utlenieniu których towarzyszy wytwarzanie acetylo-coa, aktywatora karboksylazy pirogronianowej. Ponadto długołańcuchowe kwasy tłuszczowe hamują transport nukleotydów adeninowych przez błonę mitochondrialną, zaś nienasycone kwasy tłuszczowe są znane jako związki rozprzęgające oksydacyjną fosforylację. Różny wpływ kwasów tłuszczowych na szybkość procesu karboksylacji pirogronianu jest uwarunkowany między innymi rodzajem kwasu tłuszczowego oraz stanem metabolicznym mitochondriów. W warunkach fizjologicznych powstający szczawiooctan ulega redukcji do jabłczanu, pod wpływem dehydrogenazy jabłczanowej, lub jest przekształcany w cytrynian w reakcji katalizowanej przez syntazę cytrynianową. Szybkość karboksylacji pirogronianu można zmierzyć enzymatycznie, oznaczając zawartość jabłczanu i cytrynianu w mitochondriach, bądź też, po podaniu znakowanego H 14 CO - 3, ilością radioaktywnego dwutlenku węgla włączonego do produktów karboksylacji. Materiał i odczynniki 1. Mitochondria wątroby królika (1 ml zawiesiny zawierającej w przybliżeniu 60 mg białka/ml) (wydaje prowadzący) 2. 1 M roztwór chlorku potasowego (zrobiony, 4 0 C) 3. 0,1 M chlorku magnezowego (zrobiony, 4 0 C) 4. 0,2 M bufor fosforanowy (K 2 HPO 4 /KH 2 PO 4 ), ph 7,4 (zrobiony, 4 0 C) 5. 0,2 M bufor Tris- HCl, ph 7,4 (zrobiony, 4 0 C) 6. 0,1 M roztwór EDTA (zrobiony, 4 0 C) 16

7. Mieszanina podstawowa o następującym składzie: 30 mm KCl, 4 mm EDTA, 10 mm MgCl 2, 20 mm bufor fosforanowy ph 7,4, 0,1 M bufor Tris-HCl ph 7,4. Mieszaninę o ostatecznej objętości 50 ml sporządzić poprzez zmieszanie w kolbie miarowej odpowiednich ilości odczynników 2,3,4,5 i 6. Uzupełnić objętość wodą. (przygotować w dniu inkubacji) 8. 0,2 M roztwór kwasu pirogronowego zobojętniony NaOH (na papierek lakmusowy) lub 0,2 M roztwór pirogronianu sodowego 9. 1 M roztwór kwaśnego węglanu potasowego zawierający NaH 14 CO 3 (60 μci/ml) (wydaje prowadzący) 10. 50 mm roztwór kwasu palmitynowego w etanolu (wydaje prowadzący) 11. 50 mm roztwór kwasu kaprylowego w etanolu (wydaje prowadzący) 12. 0,2 M zobojętniony roztwór bursztynianu (na papierek lakmusowy) lub 0,2 M roztwór bursztynianu sodowego 13. 0,1 M roztwór ATP zobojętniony Tris (zrobiony, -20 0 C ) 14. 1 mm roztwór rotenonu w etanolu (zrobiony, -20 0 C ) 15. Oligomycyna, roztwór etanolowy (1 mg/ml) (wydaje prowadzący) 16. 10 mm roztwór 2,4-dinitrofenolu (DNP) w etanolu lub 1 mm etanolowy roztwór FCCP (wydaje prowadzący) 17. Mieszanina scyntylacyjna (wydaje prowadzący) 18. Odczynniki do oznaczania białka metodą biuretową (zrobione, RT) 19. 35% kwas nadchlorowy (zrobiony, RT) 20. 3 M roztwór węglanu potasu (zrobiony, RT) Wykonanie a. Czynności przygotowawcze Wszystkie czynności wymagające pracy z izotopem 14 C przeprowadzać pod kierunkiem prowadzących i bezwzględnie stosować się do regulaminu. Włączyć termostat utrzymujący stałą temperaturę (30 0 C) w naczynkach inkubacyjnych. Do probówek typu Eppendorf podpisanych A1, A2, B1, B2, C1, C2 lub w innej kombinacji (wg decyzji prowadzących) odmierzyć po 0,1 ml 35% PCA. Do wskazanych przez prowadzących naczynek inkubacyjnych (np. A, B, C) odmierzyć poszczególne składniki mieszaniny reakcyjnej w ilościach podanych w tabeli (μl). Nad naczynkami inkubacyjnymi umieścić zamocowane w korkach szklane rurki z kapilarami podłączonymi do butli z mieszaniną tlenu i dwutlenku węgla (karbogenem). 17

Składniki A B C D E F G Mieszanina 1500 1500 1500 1500 1500 1500 1500 podstawowa NaH 14 CO 3 w 50 50 50 50 50 50 50 KHCO 3 Pirogronian 50 50 50 50 50 50 50 Kaprylan - 20 - - - - - Palmitynian - - 20 - - - - Bursztynian - - - - 150 - - ATP - - - - - 10 10 Oligomycyna - - - - - 10 10 Rotenon - - - 10 10 10 10 DNP lub - - - - - - 10* FCCP Woda 1400 1380 1380 1390 1240 1370 1360 *UWAGA W przypadku próby G, do naczynka inkubacyjnego dodajemy wszystkie składniki według tabeli, z wyjątkiem DNP lub FCCP. Następnie dodajemy zawiesinę mitochondriów i po minucie rozpoczynamy inkubację przez dodanie DNP lub FCCP. b. przeprowadzenie inkubacji Poprosić prowadzących o odkręcenie dopływu karbogenu do naczynek inkubacyjnych. Do naczynka A dodać 0,15 ml zawiesiny mitochondriów i włączyć stoper. Natychmiast pobrać 1 ml mieszaniny i przenieść do probówki Eppendorfa A1 zawierającej 0,1 ml 35% PCA. Po 1 min dodać 0,15 ml zawiesiny mitochondriów do naczynka B i podobnie jak poprzednio natychmiast pobrać próbę zerową do probówki Eppendorfa B1 zawierającej 0,1 ml 35 % PCA. Podobnie postępować z kolejnymi próbami, zachowując jednominutowe przerwy. Po 10 minutach od momentu dodania mitochondriów do pierwszego naczynka inkubacyjnego pobrać po 1 ml mieszaniny inkubacyjnej z kolejnych naczynek i przenieść (z zachowaniem tej samej kolejności i jednominutowych przerw jak podczas rozpoczynania inkubacji) do probówek Eppendorfa zawierających 0,1 ml 35 PCA, podpisanych A2, B2, C2 itd. (Oczywiście naczynka podpisujemy A, B, C, jeżeli to akurat ten zestaw doświadczalny został wybrany przez prowadzących.) 18

Probówki Eppendorfa zawierające wytrącone białko wstawić do lodówki na 10 min, a następnie odwirować w mikrowirówce. Supernatanty (dokładnie po 0,8 ml) przenieść do odpowiednio podpisanych probówek i wstawić na 30 minut do wytrząsarki (po kierunkiem prowadzących), a następnie zneutralizować 3 M węglanem potasowym. Po odwirowaniu osadu nadchloranu potasowego przenieść po 0,5 ml każdej próby do naczynek scyntylacyjnych, dodać po 5 ml mieszaniny scyntylacyjnej i zmierzyć radioaktywność prób (pod kierunkiem prowadzących). Nie zapomnieć o oznaczeniu białka mitochondrialnego (wg przepisu w rozdziale Oznaczanie białka metodą biuretową ). c. Opracowanie wyników Otrzymane wyniki wyrazić liczbą impulsów (cpm) radioaktywnego dwutlenku węgla włączonego w ciągu minuty na miligram białka mitochondrialnego. 19

VI. WPŁYW RÓŻNYCH EFEKTORÓW NA AKTYWNOŚĆ DEHYDROGENAZY GLUTAMINIANOWEJ W MITOCHONDRIACH WĄTROBY LUB KORY NERKI Dehydrogenaza L glutaminianowa katalizuje reakcję redukcyjnej aminacji 2-oksoglutaranu oraz reakcję oksydacyjnej dezaminacji glutaminianu; 2-Oksoglutaran + NH 4 + + NAD(P)H + H + L glutaminian + NAD(P) + + H 2 O Dehydrogenaza glutaminianowa (GDH) jest ważnym ogniwem wiążącym metabolizm białek i cukrowców, dostarczając w zależności od stanu fizjologicznego komórki 2-oksoglutaranu lub glutaminianu. Utlenienie glutaminianu prowadzi do uwolnienia jonu amonowego oraz wytworzenia 2- oksoglutaranu, który może być wykorzystany w reakcjach transaminacji lub włączony w przemiany cyklu Krebsa. Wytworzony w reakcjach cyklu kwasów trikarboksylowych szczawiooctan jest z kolei substratem karboksykinazy fosfoenolopirogronianowej., kluczowego enzymu szlaku glukoneogenezy lub syntezy cytrynianowej, uważanej za regulatorowy enzym cyklu Krebsa. W wątrobie amoniak uwolniony w reakcji katalizowanej przez GDH jest zużywany do syntezy mocznika, a w nerce bierze udział w kontroli równowagi kwasowo-zasadowej. W warunkach zwiększonej zawartości jonów amonowych w komórce GDH katalizuje reakcję wytwarzania glutaminianu. Materiały i odczynniki 1. Mitochondria wątroby (ok. 2 mg białka na ml) lub nerki królika (20 mg białka na ml) lub szczura (wydaje prowadzący) 2.. 0,2 M Bufor Tris- HCl, ph 7.4 3. 1 M KCl 4. 0,1 M EGTA, ph 7,4 (2 ml) 5. Mieszanina podstawowa; 40 mm Bufor Tris- HCL, 240mM KCL, 6 mm EGTA. Do kolby miarowej o pojemności 25 ml odmierzyć odpowiednie iliści składników 2,3,4, i objętość uzupełnić wodą do kreski. (Przygotować w dniu oznaczenia) 6. 1 M NH 4 Cl 7. 10 % Triton X- 100 (zrobiony, RT) 20

8. 1 mm rotenon w metanolu (wydaje prowadzący) 9. 10 mm NADH (przygotować bezpośrednio przed użyciem) 10. 0,2 M 2-oksoglutaran, ph 7,4 (przygotować bezpośrednio przed użyciem) 11. 0,1 M ADP, ph 7.4 (wydaje prowadzący) 12. 0,1 M Leucyna (wydaje prowadzący) 14. 0,2 M gentamycyna 15. 2 mm chlorochina Wykonanie A. Czynności przygotowawcze Nastawić termometr kontaktowy termostatu 30 0 C podłączyć termostatyzowaną przystawkę do spekola i włączyć ogrzewanie. Do termostatu wstawić w kolbach stożkowych mieszaninę podstawową i wodę. Włączyć spekol. Ustawić długość fali na 340nm.. Przygotować probę odniesienia zawierającą 1 ml mieszaniny podstawowej i 1 ml wody. B. Przeprowadzenie reakcji enzymatycznej Do kuwety odmierzyć składniki mieszaniny reakcyjnej A B C D E F G Mieszanina podstawowa 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 Woda 875 835 835 825 825 775 775 NH 4 Cl 50 50 50 50 50 50 50 Rotenon 5 5 5 5 5 5 5 Triton X-100 10 10 10 10 10 10 10 ADP - 40 - - - - - Leucyna - - 40 - - 40 40 Gentamycyna - - - 50-50 - Chlorochina - - - - 50-50 Po zamieszaniu zawartości kuwety zmierzyć wartość absorpcji mieszaniny, Dodać taką ilość koenzymu by wartość absorpcji zawierała się w granicach 0,7-0,9 (ok. 30 µl) Następnie dodać 10µl mitochondriów, zamieszać i włączyć stoper. Po minucie rozpocząć pomiary zmian absorpcji wywołane utlenieniem NADH. Notować zmiany absorpcji co 15 sekund przez 2 21

minuty. Następnie dodać 20 µl roztworu 2 oksoglutaranu w celu rozpoczęcia reakcji. Zawartość kuwety zmieszać i notować zmiany absorpcji co 15 sekund przez 3 minuty. Jeżeli zmiany absorbcji w czasie przekraczają 0,12 /min do pomiaru dodawać mniejsze ilości mitochondriów. Po zakończeniu pomiaru zawartość kuwety wylać, a kuwetę dokładnie wypłukać. Białko mitochondrialne oznaczyć metodą biuretową. C. Opracowanie wyników Obliczyć aktywność enzymu w każdej próbie, obliczając zmiany absorbcji w czasie. Do obliczen uwzględnić szybkość początkową reakcji a także szybkość utleniania NADH pod nieobecność substratu (2-oksoglutaranu). Wyniki podać w nmolach x min -1 x mg -1 białka mitochondrialnego na minutę. Milimolowy współczynnik absorbcji NADH wynosi 6,22. 22

OZNACZANIE FOSFORU METODĄ FISKE -SUBBAROWA Podstawą metody jest reakcja jonów ortofosforanowych z molibdenianem amonowym w środowisku kwaśnym. Powstającą sól amonową o żółtym zabarwieniu poddaje się reakcji z odczynnikiem redukującym (Eiokonogen), w ktrórej wyniku molibd en związany w soli kompleksowej ulega redukcji do niższych tlenków molibdenu dając tzw błekit molibdenowy. Odczynniki 1. Roztwór fosforanu zawierający 1 mg fosforu/ml 2. Roztwór wzorcowy fosforanu o stężeniu 10 µg fosforu/ml. (Przygotować odpowiednio rozcieńczając roztwór 1) 3. 10 % kwas trójchlorooctowy (TCA) (zrobiony, pod wyciągiem) 4. 25 % molibdenian amonu w 2,5 M kwasie siarkowym (zrobiony, pod wyciągiem) 5. Odczynnik redukujący (Eikonogen) ) (zrobiony, RT) (przygotowanie krzywej wzorcowej) Wykonanie Do próbówek na 10 ml odmierzyć wg schematu (w ml): Nr probówki Roztwór wzorcowy Woda Fosfor w próbie (µg) fosforanu 1-2,5 0 2,3 0,5 2,0 5 4,5 1,0 1,5 10 6,7 1,5 1,0 15 8,9 2,0 0,5 20 Do każdej probówki odmierzyć wg kolejności; 1,5 ml roztworu TCA, 0,5 ml roztworu molibdenianu i 0,2 ml roztw. Eikonogenu. Próby wymieszać i po 10 min zmierzyć absorbcję prób przy 660 nm wobec próby odniesienia. 23

OZNACZANIE BIAŁKA METODĄ BIURETOWĄ Metoda polega na pomiarze stężenia barwnego kompleksu powstałego między wiązaniami peptydowymi i jonami miedziowymi w środowisku alkalicznym. Odczynniki 1. Odczynnik biuretowy (gotowy) 2. 10 % roztwór dezoksycholanu sodowego (gotowy) Wykonanie Przygotować 3 czyste probówki. Do probówki nr 1 odpipetować 0,9 ml wody i 0,1 ml dezoksycholanu; do probówek 2 i 3; 50 zawiesiny mitochondriów, 0,1 ml dezoksycholanu i 0, 85 ml wody destylowanej. Następnie do wszystkich probówek dodać 4 ml odczynnika biuretowego, zawartość wymieszać i po 30 min zmierzyć absorbancję prób przy 540 nm wobec próby odniesienia (nr 1). Zawartość białka obliczyć posługując się podanym przez prowadzącego ćwiczenia współczynnikiem [F], wyznaczonym wcześniej dla odczynnika biuretowego. F x Absorb. = [ mg białka w próbie kolorymetrycznej]. 24