RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 1989293 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 28.02.2007 07721969.9 (13) (51) T3 Int.Cl. A61L 27/38 (2006.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: 05.01.2011 Europejski Biuletyn Patentowy 2011/01 EP 1989293 B1 (54) Tytuł wynalazku: Wstępnie unaczynione konstrukty transplantu tkankowego do rekonstrukcji narządu ludzkiego lub zwierzęcego (30) Pierwszeństwo: 28.02.2006 DE 102006009539 (43) Zgłoszenie ogłoszono: 12.11.2008 w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2008/46 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: 30.06.2011 Wiadomości Urzędu Patentowego 2011/06 (73) Uprawniony z patentu: UroTec GmbH, Dresden, DE (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP 1989293 T3 GOUYA RAM-LIEBIG, Dresden, DE MANFRED WIRTH, Dresden, DE (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Anna Rożkowicz WTS RZECZNICY PATENTOWI WITEK, ŚNIEŻKO I PARTNERZY ul. R. Weigla 12 53-114 Wrocław Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).
EP 1 989 293 B1 Opis [0001] Wynalazek dotyczy konstruktów transplantu tkankowego do rekonstrukcji narządu ludzkiego lub zwierzęcego, sposobu wytwarzania takiego konstruktu transplantu tkankowego jak również zastosowań tego konstruktu transplantu tkankowego. Wynalazek dotyczy zwłaszcza konstruktu transplantu tkankowego do rekonstrukcji narządów dolnych moczowo-płciowych, a zwłaszcza pęcherza moczowego. [0002] Celem inżynierii tkankowej ("tissue engineering") jest zastąpienie uszkodzonych, zranionych lub brakujących tkanek ciała przez biologicznie zgodny materiał zastępczy. Obecnie dla przyspieszenia regeneracji tkanek w inżynierii tkankowej są badane zarówno technika podłoży nie powlekanych komórkami jak i technika podłoży powlekanych komórkami (Alberti et al., 2004). Technika podłoży powlekanych komórkami (albo komórkowa inżynieria tkankowa) wykorzystuje biodegradowalne membrany, które powleczono in vitro komórkami z hodowli pierwotnej, przy czym komórki otrzymano w drodze biopsji z własnej tkanki gospodarza. Ten złożony transplant jest następnie umieszczany w ciele gospodarza w celu kontynuacji procesu regeneracji. Technika podłoży nie powlekanych komórkami obejmuje bezpośrednie umieszczenie in vivo w ciele gospodarza nie powlekanego biodegradowalnego materiału, który ma następnie służyć jako rusztowanie, aby mógł mieć miejsce naturalny proces regeneracji in vivo. Te techniki wspomagają regenerację tkanek, która jest podobna do normalnego rozwoju embrionalnego danego narządu. [0003] Bezkomórkowe biologiczne materiały dają dobre wyniki na polu generowania tkanek in vivo jako membrany powlekane komórkami oraz nie powlekane komórkami (Atala et al., 2000). Istotnie te biodegradowalne materiały znalazły zastosowanie w
2 inżynierii tkankowej różnych narządów jako naturalny, degradowalny i porowaty materiał, i są znane z tego, że dostarczają biologicznie specyficzne sygnały molekularnej interakcji z wyhodowanymi komórkami in vitro a poza tym wchodzą w interakcję z komórkami tkanki docelowej po wszczepieniu. [0004] Gdy jednak transplant został juz wszczepiony do ciała gospodarza, zdolność utrzymania przy życiu komórek, które rosły na powierzchni lub wewnątrz macierzy in vitro (technika podłoży powlekanych komórkami) lub które wniknęły do macierzy po wszczepieniu (technika podłoży nie powlekanych komórkami), jest krytyczną przeszkodą. Wykazano, że fragment tkanki o objętości przekraczającej parę milimetrów sześciennych nie może przeżyć dzięki dyfuzji substancji odżywczych, tylko wymaga obecności kapilar krwionośnych do dostarczania ważnych substancji odżywczych i tlenu (Mooney et al.,1999). Stąd opóźnienie unaczynienia (waskularyzacji) może powodować niepowodzenie implantacji. Do dziś sukcesy technik implantacji były ograniczone do struktur względnie cienkich lub beznaczyniowych (na przykład skóra i chrząstki), gdzie tworzenie naczyń po wszczepieniu przez organizm gospodarza wystarcza do tego, by wypełnić wymagania implantu co do tlenu i substancji odżywczych (Jam et al., 2005). Waskularyzacja pozostaje krytyczną przeszkodą w rozwoju grubszych, pod względem metabolicznym wymagających narządów, jak serce, mózg i pęcherz moczowy. [0005] Zdolność unaczynienia wstępnego rusztowań tkankowych jest zasadniczą strategią terapeutyczną i znaczącym krokiem w inżynierii tkankowej przez omijanie ograniczeń regeneracji tkanek. Wstępnie unaczyniona macierz przyspiesza ich waskularyzację i poprawia ich ukrwienie oraz ich przeżycie in vivo. Zwłaszcza złożone tkanki i narządy potrzebują
3 zaopatrywania poprzez naczynia krwionośne, aby zapewnić przeżycie transplantu i aby biosztuczne narządy uczynić zdolnymi do funkcjonowania (Mertsching et al., 2005). Jedną z metod neowaskularyzacji jest tworzenie nowych naczyń z komórek śródbłonkowych. Ta metoda, określana jako waskulogeneza (tworzenie naczyń), ma miejsce zazwyczaj podczas rozwoju embrionalnego podczas wykształcania się narządów (Risau et al., 1995). [0006] Szczególne znaczenie ma unaczynienie wstępne materiałów do rekonstrukcji dolnych dróg moczowych (pęcherz moczowy, moczowód oraz cewka moczowa). Te narządy wykazują intensywne zaopatrywanie poprzez naczynia krwionośne. W technice podłoży powlekanych komórkami inżynierii tkankowej dolnych narządów moczowych próby ograniczały się dotąd jedynie do hodowli komórek urotelialnych i komórek mięśniowych (Alberti et al., 2004) na biologicznych membranach. Te komórki można łatwo uzyskać z małych biopsji pęcherza. [0007] Otwartym pytaniem jest obecnie pytanie, który rodzaj komórek śródbłonka może zostać zastosowany do wstępnego unaczynienia biologicznych rusztowań, które mają zostać wszczepione in vivo. Wiadomo, że fenotypy komórek śródbłonka różnią się znacznie w zależności od typu naczynia i od narządu, i ta specyficzność tkankowa gra ważną rolę w lokalnej fizjologii narządów (Jam et al., 2005). [0008] Schultheiß et al. opisują w "Biological vascularized matrix for bladder tissue engineering: matrix preparation, reseeding technique and short-term implantation in a porcine model", J. Urol. Jan 2005; 173 (1): 276-80, biologiczną macierz bezkomórkową, która jest zasiedlona przez komórki mięśni gładkich, komórki urotelialne i komórki prekursorowe śródbłonka. Te komórki prekursorowe uzyskano z frakcji krwi.
4 Celem wytworzenia konstruktu transplantu tkankowego macierz jest powlekana dodatkowo komórkami mięśni gładkich oraz komórkami urotelialnymi komórkami prekursorowymi śródbłonka z krwi. Te komórki nie są jednak w stanie stworzyć w matrycy struktur naczyniowych. Dodatkowo komórki prekursorowe śródbłonka nie są narządowo specyficzne. Nie są poza tym dojrzałymi komórkami śródbłonka. [0009] Zadaniem wynalazku jest przezwyciężenie wad stanu techniki. Zwłaszcza dostarcza się przedstawiony konstrukt transplantu tkankowego, który umożliwi w przypadku pokrycia membrany za pomocą komórek (i stworzenie struktur naczyniowych wewnątrz membrany) szybsze i lepsze wygenerowanie otaczającej tkanki w rusztowaniu po wszczepieniu lub który umożliwi w przypadku pokrycia membrany za pomocą komórek śródbłonka jak również kolejnych narządowo specyficznych komórek (jak komórki urotelialne, komórki mięśniowe i/lub komórki interstycjalne) lepsze zaopatrywanie zawartych w nim komórek po wszczepieniu. [0010] To zadanie rozwiązują cechy zastrzeżeń 1 oraz 7. Zgodne z celem formy realizacji wynalazku wynikają z cech zastrzeżeń zależnych. [0011] US 2004/0006395 A1 opisuje membranę, która jest zasiedlona wyłącznie przez komórki śródbłonka, w której jednak nie są wykształcone żadne struktury mikronaczyniowe, ponieważ komórki śródbłonka nie wnikają do membrany; lub (ii) membranę, która jest zasiedlona przez komórki śródbłonka oraz kolejne komórki (komórki mięśni gładkich lub komórki 3T3) i w której są wykształcone struktury mikronaczyniowe. [0012] Velazquez Omaida C. et al. (Database Biosis [Online] Biosciences Information Service, Philadelphia, PA, US, August 2002 (2002-08) "Fibroblast-dependent differentiation of human microvascular endothelial cells into capillary-like 3-
5 dimensiorial networks" (nr dostępu do bazy danych: Nr. PREV200200441299) ujawniają, że dla wykształcenia trójwymiarowych sieci podobnych do kapilar komórki śródbłonka są pokrywane ludzkim kolagenem I oraz drugą warstwą z kolagenu zawierają fibroblasty. [0013] Hopkins Richard et al. (www.oulo.fi) ujawniają metodę przyspieszania proliferacji komórek HUVEC na usieciowionym kolagenie z pomocą mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego oraz fibroblastów skóry. [0014] US 2001/051824 A1 ukazuje membranę która została zasiedlona miofibroblastami. Hodowla miofibroblastów następuje w pulsujących warunkach przepływu. Membrana może zostać dodatkowo zasiedlona także komórkami śródbłonka. [0015] DE 10 2004 037 184 B3 ujawnia metodę wytwarzania konstruktu transplantu tkankowego, która obejmuje (a) naniesienie narządowo specyficznych komórek (konkretnie ujawniono w owym przykładzie komórki urotelialne) na biologiczną membranę, (b) proliferację tych komórek w obecności indukcji zrębowej oraz (c) finalne róznicowanie części namnożonych komórek urotelialnych, przez co uzyskuje się membranę, która posiada większą ilość warstw komórek urotelialnych. Według wynalazku przewidziany jest konstrukt transplantu tkankowego do rekonstrukcji narządu ludzkiego lub zwierzęcego, składający się z (a) biologicznie kompatybilnej bezkomórkowej membrany; oraz z (b) komórek śródbłonka mikronaczyniowego, które przenikają membranę, przy czym komórki śródbłonka mikronaczyniowego są to komórki śródbłonka mikronaczyniowego skóry lub komórki śródbłonka mikronaczyniowego pęcherza;
6 przy czym wewnątrz membrany struktury mikronaczyniowe są wykształcone z komórek śródbłonka mikronaczyniowego. [0016] Struktury mikronaczyniowe powstałe z naniesionych komórek śródbłonka mikronaczyniowego umożliwiają zaopatrywanie pozostałych komórek dolnych narządów moczowych, zwłaszcza komórek urotelialnych, komórek mięśniowych, komórek interstycjalnych w substancje odżywcze i tlen po wszczepieniu konstruktu. Zaopatrywane są również inne komórki, które wnikną do konstruktu po wszczepieniu. [0017] Konstrukt transplantu tkankowego według wynalazku może obejmować kolejne, tkankowo specyficzne komórki, np. komórki urotelialne i/lub komórki mięśni gładkich i/lub komórki interstycjalne, które zostały naniesione na membranę i tam były hodowane przed wszczepieniem. Także te komórki są wówczas po wszczepieniu konstruktu transplantu tkankowego zaopatrywane przez strukturę mikronaczyniową. [0018] Wynalazek dostarcza w ten sposób po raz pierwszy konstrukt transplantu tkankowego, który umożliwia zaopatrywanie komórek wewnątrz konstruktu a nie tylko na jego powierzchni. Te konstrukty nadają się dlatego doskonale do rekonstrukcji narządów. [0019] Wynalazek używa korzystnie narządowo specyficznych komórek śródbłonka mikronaczyniowego pęcherza moczowego (komórek śródbłonka mikronaczyniowego pęcherza) do unaczynienia wstępnego matryc, które mają zostać zastosowane do rekonstrukcji dolnych narządów moczowych. Komórki śródbłonka mikronaczyniowego pęcherza udało się wyizolować z małej porcji materiału pochodzącego z biopsji z tego narządu i zastosować do utworzenia sieci naczyń śródbłonkowych w różnych biologicznych bezkomórkowych matrycach. Korzystnie preferowanymi matrycami są bezkomórkowa macierz pęcherza,
7 bezkomórkowa macierz cewki moczowej, bezkomórkowa błona podśluzowa pęcherza moczowego, błona śluzowa jelita cienkiego, bezkomórkowa macierz skóry, bezkomórkowa macierz aorty. [0020] Alternatywnie do komórek śródbłonka mikronaczyniowego pęcherza można też stosować komórki śródbłonka mikronaczyniowego skóry. Komórki śródbłonka mikronaczyniowego skóry mogą być stosowane do wytwarzania konstruktu transplantu tkankowego, który może być użyty do rekonstrukcji dolnych narządów moczowych, ale także innych narządów. Do rekonstrukcji pęcherza moczowego jednak preferuje się korzystnie zastosowanie komórek śródbłonka mikronaczyniowego pęcherza z powodu specyficzności tkankowej. [0021] Wynalazek umożliwia korzystnie hodowlę in vitro komórek śródbłonka mikronaczyniowego na różnych biologicznych matrycach i tworzenie się stabilnej sieci naczyniowej do rekonstrukcji tkanki narządów miękkich, korzystnie pęcherza moczowego, moczowodów oraz cewki moczowej. Hodowla następuje w systemach hodowli, które dostarczają angiogenne czynniki wzrostu, aby indukować unaczynienie wstępne matryc za pomocą komórek śródbłonka mikronaczyniowego pęcherza. Tworzenie się struktur naczyniowych w gotowych konstruktach transplantu tkankowego indukowane jest przez komórki zrębowe pęcherza, komórki progenitorowe zrębu szpiku kostnego i komórki urotelialne pęcherza, korzystnie przez pożywkę, która została skondycjonowana za pomocą tych komórek. Komórki zrębowe, komórki progenitorowe zrębu szpiku kostnego i komórki nabłonkowe jak również komórki urotelialne są znane z tego, że mają związek z indukcją tworzenia się naczyń krwionośnych in vitro (Velazquez et al., 2002; Markowicz et al., 2005; Thompson et al., 2006).
8 [0022] Wynalazek nie ogranicza się jednak do konstruktu transplantu tkankowego do rekonstrukcji dolnych moczowodów, ale może być także przenoszony na inne narządy, korzystnie na narządy miękkie. [0023] Pojęcie "narządowo specyficzne należy przy tym rozmieć tak, że na membranę nanoszone są komórki tego samego lub takiego samego narządu, który ma być zrekonstruowany. Jeśli np. ma być zrekonstruowany pęcherz moczowy, to przez narządowo specyficzne komórki śródbłonka mikronaczyniowego rozumie się komórki śródbłonka mikronaczyniowego z pęcherza moczowego. [0024] Narządy to funkcjonalne moduły ciała. Preferowanym przykładem jest pęcherz moczowy. [0025] Pod pojęciem "struktura mikronaczyniowa" należy rozumieć wykształcenie kapilarnej struktury wewnątrz membrany. Struktura kapilarna składa się korzystnie z modułów o postaci sznura i/lub rurek, utworzonych z komórek śródbłonka mikronaczyniowego. Rurkowate moduły posiadają korzystnie kompletnie wykształcone światło naczyniowe. Moduły o postaci sznura i/lub rurek, są korzystnie powiązane ze sobą w sieć. Po wszczepieniu konstruktu według wynalazku do rekonstruowanego narządu i połączeniu struktury mikronaczyniowej konstruktu ze strukturą naczyniową in vivo zapewnione jest zaopatrywanie komórek śródbłonka i innych komórek konstruktu. W ten sposób bezpośrednio po wszczepieniu konstrukt może być zaopatrywany poprzez struktury mikronaczyniowe w substancje odżywcze i tlen. Proces tworzenia się naczyń krwionośnych jest określany także jako waskularyzacja albo unaczynienie. Przez unaczynienie wstępne rozumie się, że struktura mikronaczyniowa istnieje już przed wszczepieniem.
9 [0026] Pojęcia "membrana" oraz "macierz" używane są tu, o ile nie podano inaczej, jako synonimy. Membrana powinna zawierać składniki macierzy pozakomórkowej (ECM), korzystnie jej czynniki wzrostu. Membrana jest korzystnie biologiczną membraną. Membrana tworzy trójwymiarowe biologiczne rusztowanie, w które wnikają naniesione komórki śródbłonka mikronaczyniowego podczas hodowli. [0027] Membrana to korzystnie bezkomórkowy ludzki lub świński pęcherz moczowy, bezkomórkowa ludzka lub świńska błona podśluzowa pęcherza moczowego, bezkomórkowa ludzka lub świńska skóra właściwa, bezkomórkowe ludzkie lub świńskie jelito cienkie, bezkomórkowe ludzka lub świńska aorta lub bezkomórkowa ludzka lub świńska cewka moczowa. Membrana zawiera kolagen. Zgodnie z celem membrana jest stabilna mechanicznie. [0028] Powierzchnia zewnętrzna membrany wynosi korzystnie do 40 cm 2, może też być jednak większa. Grubość membrany wynosi korzystnie między 100 μm a 100 mm. [0029] Przez rekonstrukcję rozumie się zastąpienie uszkodzonych lub chorych obszarów narządu ludzkiego lub zwierzęcego, korzystnie pęcherza moczowego, cewki moczowej lub moczowodu. [0030] Pojęcie "przenikać" należy tu rozumieć w ten sposób, że komórki śródbłonka mikronaczyniowego wniknęły z powierzchni membrany do jej wnętrza, i wnętrze membrany jest zasiedlone przez komórki śródbłonka mikronaczyniowego. Pojęcie "przenikanie " ma tu odpowiadać pojęciu "inwazja". [0031] Przez indukcję zrębową rozumie się proliferację komórek śródbłonka mikronaczyniowego indukowaną przez zrąb. Indukcja zrębowa jest korzystnie indukcją za pomocą komórek zrębowych pęcherza i komórek progenitorowych zrębu szpiku kostnego.
10 [0032] Przez indukcję nabłonkową rozumie się proliferację komórek śródbłonka mikronaczyniowego indukowaną przez komórki nabłonkowe. W przypadku dolnych dróg moczowych komórki nabłonkowe to komórki urotelialne, tak że wówczas mówi się o indukcji urotelialnej. [0033] Przez indukcję nabłonkowo-zrębową rozumie się proliferację komórek śródbłonka mikronaczyniowego indukowaną przez mieszaninę komórek zrębowych i komórek nabłonkowych. Indukcja urotelialno-zrębowa jest korzystnie indukcją za pomocą komórek urotelium i zrębu pęcherza. W przypadku dolnych dróg moczowych komórki nabłonkowe to komórki urotelialne, tak że wówczas mówi się o indukcji urotelialnozrębowej. [0034] Mieszanina komórek zrębowych pęcherza oraz komórek urotelialnych pęcherza jest określana poniżej także jako komórki urotelium i zrębu pęcherza, komórki urotelialne i zrębowe, lub komórki zrębowe i urotelialne. [0035] Pęcherz moczowy składa się z błony śluzowej (komórki urotelialne) oraz zrębu (fibroblasty, komórki mięśni gładkich i komórki śródbłonka) [0036] Konstrukt transplantu tkankowego według wynalazku jest stosowany korzystnie do rekonstrukcji dolnych dróg moczowych, szczególnie korzystnie pęcherza moczowego, cewki moczowej lub moczowodu. W tym przypadku ludzkim lub zwierzęcym narządem, który ma być zrekonstruowany, jest pęcherz moczowy, podczas gdy narządowo specyficznymi komórkami śródbłonka mikronaczyniowego są komórki śródbłonka mikronaczyniowego pęcherza i/lub komórki śródbłonka mikronaczyniowego skóry. [0037] Szczególnie korzystnie komórki śródbłonka mikronaczyniowego są autologicznymi komórki śródbłonka mikronaczyniowego, tj. komórki śródbłonka mikronaczyniowego są izolowane z tkanki pacjenta, którego narząd ma zostać
11 zrekonstruowany za pomocą konstruktu transplantu tkankowego według wynalazku. [0038] Również korzystnie komórki śródbłonka mikronaczyniowego mogą być izolowane ze skóry i zastosowane do unaczynienia wstępnego membrany. [0039] Według wynalazku przewidziany jest ponadto sposób wytwarzania konstruktu transplantu tkankowego do rekonstrukcji narządu ludzkiego lub zwierzęcego, przy czym konstrukt transplantu tkankowego składa się z membrany oraz komórek śródbłonka mikronaczyniowego, przy czym metoda ta obejmuje następujące kroki: (a) izolację komórek śródbłonka mikronaczyniowego skóry lub komórek śródbłonka mikronaczyniowego pęcherza; (b) naniesienie komórek śródbłonka mikronaczyniowego na biologicznie kompatybilną bezkomórkową membranę; (c) hodowlę komórek śródbłonka mikronaczyniowego, które zostały naniesione na biologicznie kompatybilną bezkomórkową membranę, w obecności indukcji zrębowej lub w obecności indukcji nabłonkowo-zrębowej, przy czym następuje wykształcenie się w membranie struktur mikronaczyniowych, składających się z komórek śródbłonka mikronaczyniowego. [0040] Indukcja zrębowa jest korzystnie przeprowadzana przy użyciu ludzkich lub zwierzęcych komórek zrębowych pęcherza albo ludzkich lub zwierzęcych komórek progenitorowych zrębu szpiku kostnego. [0041] Hodowla w obecności indukcji zrębowej przeprowadzana jest szczególnie korzystnie za pomocą pożywki kondycjonowanej, przy czym ta pożywka kondycjonowana została
12 skondycjonowana za pomocą ludzkich lub zwierzęcych komórek zrębowych pęcherza albo ludzkich lub zwierzęcych komórek progenitorowych zrębu szpiku kostnego. Pożywkę kondycjonowaną można otrzymać w ten sposób, że na nie kondycjonowanej pożywce hoduje się kultury ludzkich lub zwierzęcych komórek zrębowych pęcherza albo ludzkich lub zwierzęcych komórek progenitorowych zrębu szpiku kostnego a następnie pożywkę oddziela się jako supernatant od komórek zrębowych pęcherza lub komórek progenitorowych zrębu szpiku kostnego. Ta pożywka kondycjonowana jest określana poniżej także jako pożywka kondycjonowana komórkami zrębu lub pożywka kondycjonowana za pomocą komórek zrębowych. [0042] Indukcja nabłonkowo-zrębowa jest korzystnie indukcją urotelialno- zrębową, która jest przeprowadzana przy użyciu komórek urotelium i zrębu pęcherza [0043] Hodowla w obecności indukcji nabłonkowo- zrębowej jest przeprowadzana szczególnie korzystnie za pomocą pożywki kondycjonowanej, przy czym ta pożywka kondycjonowana została skondycjonowana za pomocą ludzkich lub zwierzęcych komórek nabłonkowych, korzystnie komórek urotelialnych, oraz komórek zrębowych pęcherza. Pożywkę kondycjonowaną można otrzymać w ten sposób, że na nie kondycjonowanej pożywce hoduje się kultury ludzkich lub zwierzęcych komórek nabłonkowych a następnie pożywkę oddziela się jako supernatant od mieszaniny komórek nabłonkowych i komórek zrębowych. [0044] Hodowla w obecności indukcji nabłonkowej jest przeprowadzana szczególnie korzystnie za pomocą pożywki kondycjonowanej, przy czym ta pożywka kondycjonowana została skondycjonowana za pomocą ludzkich lub zwierzęcych komórek nabłonkowych, korzystnie komórek urotelialnych. Pożywkę kondycjonowaną można otrzymać w ten sposób, na nie kondycjonowanej pożywce hoduje się kultury ludzkich lub
13 zwierzęcych komórek nabłonkowych, a następnie pożywkę oddziela się jako supernatant z komórek nabłonkowych. Komórki śródbłonka mikronaczyniowego mogą zostać pozyskane z tkanki zrębowej narządu mającego być zrekonstruowanym (nie według wynalazku). To może się odbyć w ten sposób, że (i) tkankę zrębową trawi się za pomocą kolagenazy; (ii) z mieszaniny uzyskanej w kroku (i) oddziela się komórki śródbłonka mikronaczyniowego przy użyciu paramagnetycznych cząsteczek złączonych z lektyną lub przeciwciałami, przy czym te przeciwciała są monoklonalnymi przeciwciałami przeciw cząsteczce adhezji komórkowej płytek i śródbłonka-1 (PECAM 1) lub CD105; (iii) tak uzyskane komórki śródbłonka mikronaczyniowego namnaża się; oraz (iv) z mieszaniny uzyskanej w kroku (iii) odziela się komórki śródbłonka mikronaczyniowego przy użyciu paramagnetycznych cząsteczek złączonych z lektyną lub przeciwciałami, przy czym te przeciwciała są monoklonalnymi przeciwciałami przeciw cząsteczce adhezji komórkowej płytek i śródbłonka-1 1 (PECAM 1) lub CD105 oraz przy czym tak uzyskane komórki śródbłonka mikronaczyniowego są mieszaniną o czystości przynajmniej 95 %, względem liczby wszystkich odseparowanych komórek. [0045] Reszta mieszaniny pozostałej w kroku (ii) używana jest szczególnie korzystnie do wytwarzania pożywki kondycjonowanej. Alternatywnie reszta mieszaniny może być hodowana za pomocą komórek urotelialnych na wstępnie
14 unaczynionej membranie bezpośrednio po kroku (c) i w ten sposób tworzyć złożony żywy konstrukt transplantu tkankowego. [0046] Wynalazek daje możliwość rekonstrukcji dolnych dróg moczowych za pomocą zgodnych z wynalazkiem wstępnie unaczynionych biologicznych matryc, w których generacja tkanek rozpoczyna się in vitro, przy czym równocześnie proliferacja komórek śródbłonka mikronaczyniowego pęcherza ulega przyspieszaniu a proces tworzenia się z nich mikronaczyń ulega polepszeniu. Konstrukt transplantu tkankowego według wynalazku może obok komórek śródbłonka mikronaczyniowego zawierać inne, tkankowo specyficzne komórki, jak np. komórki nabłonkowe i komórki zrębowe. [0047] Korzystne wyniki wynalazków bazują na następujących wnioskach wynalazców: angiogeneza jest złożoną metodą, która angażuje macierz pozakomórkową (ECM) oraz komórki śródbłonka naczyniowego i jest regulowana przez różne czynniki naczyniotwórcze. Zdolność tworzenia sieci struktur kapilarnych/ rurkowatych jest specjalną funkcją komórek śródbłonka (EC) i wymaga specjalnej kaskady procesów, składającej się z inwazji komórek śródbłonka, migracji, proliferacji, tworzenia się rurek i anastomozy między strukturami (Cameliet et al., 2000; Yancopoulos et al., 2000; Blau et al., 2001; Ferrara et al., 1999; Keshet et al., 1999). W ten sposób komórki śródbłonka są kierowane przez sygnały z mikrootoczenia otaczającej je macierzy (Berthod et al., 2006). [0048] Aby wspomagać tworzenie się mikronaczyń oraz ich utrzymanie in vitro, używane są korzystnie bezkomórkowa macierz pęcherza moczowego lub bezkomórkowa macierz moczowodu, które obejmują główne składniki interstitium pęcherzy wzgl. moczowodów jako fizjologiczne macierze dla inwazji i różnicowania komórek śródbłonka. Również korzystnie
15 mogą być użyte inne biologiczne bezkomórkowe matryce, które obejmują kolagen jako główny składnik, który jest również głównym składnikiem interstycjum. Fakt, że zaobserwowano tworzenie się struktury mikronaczyniowej wewnątrz wszystkich matryc, pokazuje, że zdolność ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego nie jest ograniczona tylko do jednego typu biologicznych macierzy. [0049] Komórki śródbłonka znane są również z tego, że są aktywowane przez sygnały z innych komórek ich mikrootoczenia (Berthod et al., 2006; Velasquez et al., 2002). Komórki zrębowe (fibroblasty i komórki mięśni gładkich) często odkładają się przy komórkach śródbłonka, co przyczynia się do morfogenezy i ostatecznego różnicowania się do kapillarnego/rurkokształtnego fenotypu. Komórki zrębowe a szczególnie fibroblasty mają związek z produkcją białek macierzy, które służą jako rusztowanie do rozmieszczenia naczyń i innych układów narządowych. Te komórki są również bogatym źródłem angiogennych czynników wzrostu (Honorati et al., 2005), aby kierować proliferacją i różnicowaniem komórek śródbłonka (Erdag et al., 2004; Hudon et al. 2003) i być kojarzonymi ze stabilizacją naczyń krwionośnych in vitro (Velazquez et al., 2002). Ponadto wiadomo, że komórki nabłonkowe wydzielają czynniki wzrostu, które indukują tworzenie się naczyń (Thompson et al., 2006). [0050] Darland et al., 2001, zaobserwowali, że komórki zrębowe, jak zróżnicowane perycyty w hodowli z komórkami śródbłonka wytwarzają czynniki wzrostu, które wspomagają przeżycie i/lub stabilizację komórek śródbłonka. [0051] Dorosłe mezenchymalne komórki macierzyste szpiku kostnego są multipotentymi i silnie proliferującymi komórkami, które mogą uwalniać różne czynniki wzrostu (Tang et al., 2004), które wspomagają przeżycie i/lub stabilizację
16 komórek śródbłonka (Markowicz et al., 2005). Te komórki są znane z tego, że dostarczają lokalne otoczenie, które wspomagają wrastanie naczyń krwionośnych w uszkodzone miejsce (Gruber et al., 2005). [0052] W wynalazku zbadane zostało działanie indukcyjne komórek zrębowych pęcherza, komórek progenitorowych zrębu szpiku kostnego oraz komórek urotelialnych pęcherza poprzez pożywkę kondycjonowaną (Velazquez et al., 2002; Gruber et al., 2005; Thomson et al., 2006). W tym celu użyto supernatantów z komórek zrębowych pochodzących ze szpiku kostnego, narządowo specyficznych komórek zrębowych pęcherza oraz specyficznych narządowo komórek urotelialnych pęcherza, aby za pomocą parakrynnej funkcji komórek zrębowych i komórek urotelialnych przyspieszyć proliferację izolowanych komórek śródbłonka mikronaczyniowego pęcherza i komórek śródbłonka mikronaczyniowego skóry, przywarłych do biologicznych rusztowań. [0053] W eksperymentach, które leżały u podstaw wynalazku, najpierw hodowano ludzkie komórki śródbłonka mikronaczyniowego pęcherza lub komórki śródbłonka mikronaczyniowego skóry jako monowarstwę na matrycach. Następnie wyhodowane komórki były karmione pożywką kondycjonowaną komórkami zrębu lub komórkami zrębu i urotelium. W eksperymentach kontrolnych wyhodowane komórki były karmione pożywką kondycjonowaną komórkami urotelium lub nie kondycjonowaną. Aby ustalić zdolność komórek zrębowych i komórek urotelialnych do modulowania proliferacji, różnicowania i stabilizacji komórek śródbłonka mikronaczyniowego na bezkomórkowych biodegradowalnych materiałach, angiogeneza in vitro została oceniona za pomocą histologicznych i immunohistochemicznych analiz dla ustalenia proliferacji, penetracji, tworzenia się sieci
17 kapilarnego/rurkokształtnego fenotypu. Trzy naczyniotwórcze parametry zostały zaproponowane w literaturze do badania tworzenia się sieci rurkowatych naczyń: długość kapilar, liczba kapilar i względny obszar kapilar. W tych przeprowadzonych eksperymentach określono długość kapilar w teście (Watanable et al., 2005). Długość kapilar ustalono przy tym każdorazowo w trzech histologicznych przekrojach wzdłużnych trzech różnych konstruktów komórek, uzyskanych każdy z innego pęcherza moczowego, analizą metodą mikroskopii optycznej. [0054] Histologiczne i immunohistochemiczne badania komórek śródbłonka mikronaczyniowego na trójwymiarowych biologicznych matrycach, które zostały skondycjonowane za pomocą komórek zrębowych i mieszaniny komórek zrębowych i urotelialnych, ukazały uaktywnione inwazyjnie komórki, które zdegradowały swoją macierz okołokomórkową, podczas gdy równocześnie ich zróżnicowany fenotyp został zachowany. Gdy tylko komórki te uwolniono do trójwymiarowej pozakomórkowej macierzy, zaczęły się one przemieszczać ku innym komórkom i ułożyły się w sznury śródbłonkowe. Te kształtujące się mikrorurki rozrastały się ku sobie i tworzyły zespolenia z innymi mikrorurkami w obecności parakrynnych sygnałów cytokinowych z komórek zrębowych oraz mieszanin komórek zrębowych i urotelialnych. W porównaniu do tego systemu hodowle, które zostały zasilone pożywkami nie kondycjonowanymi lub pożywką kondycjonowaną komórkami urotelium, wykazywały tylko niewielki wzrost liczby struktur komórek śródbłonka, mniejszą powierzchnię, która została przykryta przez komórki śródbłonka, oraz mniejszy odsetek struktur naczyniopodobnych posiadających światło w porównaniu do hodowli kondycjonowanych komórkami zrębu i hodowli kondycjonowanych komórkami urotelium i zrębu.
18 [0055] Test proliferacji za pomocą KI-67 pokazał, że w nie kondycjonowanych systemach hodowli lub w systemach kondycjonowanych tylko komórkami urotelium hodowli jak również w kondycjonowanych komórkami urotelium komórki śródbłonka w okresie jednego do dwóch tygodni w większości przypadków dwa tygodnie były latentne. W systemach hodowli kondycjonowanych komórkami zrębu lub komórkami urotelium i zrębu komórki śródbłonka zachowały aktywność proliferacyjną przez co najmniej cztery tygodnie, co dawało konstrukty o wyższej gęstości komórek niż w konstruktach w systemach hodowli nie kondycjonowanych lub kondycjonowanych tylko komórkami urotelium. [0056] Test do określania tworzenia się sieci kapillarnycho/rurkokształtnych naczyń pokazał również dłuższe twory kapilarne przypadające na pole w systemach kondycjonowanych komórkami zrębu lub komórkami urotelium i zrębu. [0057] W ten sposób komórki zrębowe jak również mieszanina komórek zrębowych i urotelialnych dostarczają w swoim supernatancie czynniki, które mogą stymulować inwazję komórek śródbłonka i tworzenie się struktur mikrorurek. Te wyniki sugerują, że komórki zrębowe lub mieszaniny komórek zrębowych i urotelialnych dostarczają krytyczne sygnały o śródbłonkowym działaniu mitogennym i motogennym, co wspomaga budowę struktur rurek z komórek śródbłonka. [0058] Rozwój kapilarnych struktur mikronaczyniowych wymaga nie tylko komórek zrębowych lub mieszaniny komórek zrębowych i urotelialnych, ale również obecności macierzy pozakomórkowej (ECM). Istotnie w dwuwymiarowych konwencjonalnych szalkach hodowlanych komórki śródbłonka w obecności indukcji zrębowej lub indukcji urotelialno-zrębowej nie tworzą żadnych struktur rurek. Składniki ECM
19 biologicznych membran mogą funkcjonować zarówno jako rusztowanie jak również jako inicjator dla komórek śródbłonka. Najwyraźniej synergistycznie wobec aktywacji komórek śródbłonka, następującej przez wystawienie ich na macierz pozakómorkową, przez komórki zrębowe lub mieszaniny komórek zrębowych i urotelialnych dostarczane są sygnały przyspieszające migrację, przeżycie i różnicowanie komórek śródbłonka do prawdziwej morfogenezy kapilar. [0059] Fakt, że zwiększona proliferacja i różnicowanie komórek śródbłonka dzięki pożywkom, które zostały skondycjonowane za pomocą komórek zrębowych pęcherza, komórek progenitorowych zrębu szpiku kostnego lub mieszaniny komórek urotelialnych i zrębowych, nie wskazuje na jakąkolwiek specyficzność narządową w odniesieniu do wywieranych przez komórki zrębowe lub przez mieszaniny komórek zrębowych i urotelialnych wpływów na kapilarnopodobną morfologię, implikuje krytyczną rolę komórek zrębowych lub mieszaniny komórek urotelialnych i zrębowych w kontroli zachowania komórki śródbłonka. [0060] Czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) stanowi jeden z najbardziej skutecznych mitogenów komórek śródbłonka (Pepper et al., 1992 - Lazarous et al., 1997). Jest jednym z tych czynników, które stymulują ekspresję metaloproteinaz macierzy pozakomórkowej, proliferację, migrację i tworzenie rurek izolowanych komórek śródbłonka in vitro oraz rozwój naczyń krwionośnych in vivo (Gruber et al., 2005). [0061] Aby ustalić obecność tego kluczowego czynnika naczyniotwórczego w pożywkach kondycjonowanych, zbadano zagęszczenie czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) w testach ELISA. Wyniki wykazały niezbicie zagęszczenia VEGF, które wskazują na to, że mierzalne zagęszczenia tej cytokiny są wydzielane przez komórki zrębowe. Konstrukty według
20 wynalazku bazują zatem korzystnie na zdolności do ekspresji czynników wzrostu przez komórki zrębowe i mieszaniny komórek zrębowych i urotelialnych. W odniesieniu do tego czynnika wzrostu komórki urotelialne produkowały wyższe wartości. Hodowle mieszane komórek urotelialnych i zrębowych tworzyły tę cytokinę najaktywniej, przy czym najwyższe zagęszczenie VEGF zostało zmierzone w pożywce kondycjonowanej za pomocą mieszaniny komórek zrębowych i urotelialnych. [0062] Fakt, że pożywka kondycjonowana jedynie z komórkami urotelialnymi (mimo produkcji VEGF przez te komórki) tylko w niewielkim stopniu indukowała proliferację i tworzenie rurekkapilar, wskazuje na to, że dodatkowa obecność komórek zrębowych jest korzystna dla indukcji komórek śródbłonka. Indukujące działanie komórek zrębowych z ich strony może w ten sposób zostać powiększone przez komórki urotelialne. [0063] Z drugiej strony po wyhodowaniu komórek śródbłonka mikronaczyniowego jako warstwy pojedynczej na bezkomórkowych matrycach dalsza hodowla bez pożywki kondycjonowanej ( d. h. bez indukcji zrębowej lub urotelialno-zrębowej) lub z pożywką kondycjonowaną tylko komórkami urotelium prowadziła do uwolnienia się komórek z warstwy pojedynczej i inwazji tych komórek do macierzy, ale inwazja do leżącej poniżej macierzy nie była tak duża jak w kondycjonowanych warunkach za pomocą komórek zrębowych lub mieszaniny komórek zrębowych i urotelialnych. Poza tym komórki śródbłonka ułożyły się tylko w nieliczne spolaryzowane sznury z małą ilością rozgałęzień, i tylko nieliczne z nich wykazały kompletnie wykształcone światło naczynia. Dlatego bezkomórkowa macierz jest istotna dla początkowej migracji do dolnej bezkomórkowej warstwy, ale nie jest wystarczająca do wspierania dalszego przemieszczania się i tworzenia dojrzałych struktur rurek wewnątrz bezkomórkowej macierzy. Te wyniki pokazują, że indukcja
21 zrębowa lub indukcja urotelialno-zrębowa jest konieczna do adekwatnej migracji i inwazji i do tworzenia się dojrzałych struktur naczyniowych. [0064] Tak więc wyniki in vitro, na których bazuje wynalazek, pokazują, że unaczynienie wstępne biologicznych bezkomórkowych matryc za pomocą wyizolowanych autologicznych komórek śródbłonka mikronaczyniowego, zebranych z małej biopsji pęcherza lub skóry, i indukowanych za pomocą komórek zrębowych pęcherza, komórek progenitorowych zrębu szpiku kostnego lub mieszaniny komórek urotelialnych pęcherza i komórek zrębowych pęcherza stanowi udaną możliwość leczenia wad dolnych dróg moczowych. [0065] Te wnioski nie ograniczają się jednak do dolnych dróg moczowych, korzystnie pęcherza moczowego, ale mogą być przenoszone także na inne narządy, korzystnie na narządy miękkie. [0066] Wynalazek jest objaśniony poniżej za pomocą przykładów z odniesieniem do rysunków, na których Fig. 1 ukazuje wykres słupkowy pokazujący zagęszczenie VEGF w pożywkach kondycjonowanych i nie kondycjonowanych; Fig. 2 - wykres słupkowy pokazujący populację komórek śródbłonka mikronaczyniowego po hodowli za pomocą różnych pożywek kondycjonowanych wewnątrz membrany; Fig. 3 - wykres słupkowy, pokazujący długość struktur mikronaczyniowych w konstruktach transplantu tkankowego, których komórki śródbłonka mikronaczyniowego były hodowane na różnych pożywkach hodowlanych;
22 Fig. 4A - histologiczne zdjęcie do charakteryzacji hodowli in-vitro wysianych komórek śródbłonka mikronaczyniowego pęcherza na powierzchni bezkomórkowej macierzy w obecności indukcji zrębowej wzgl. urotelialno-zrębowej w dniu 14, gdzie komórki śródbłonka pęcherza w obecności indukcji za pomocą rozpuszczalnych czynników zrębowych wzgl. urotelialnozrębowych oderwały się od powierzchni macierzy i wniknęły do rusztowania macierzy. Początkowo tworzy się struktura w formie sznura wyścielona komórkami. Stopniowo można rozpoznać kompletnie wykształcone światło (strzałka); Fig. 4B - histologiczne zdjęcie do charakteryzacji hodowli in-vitro wysianych komórek śródbłonka mikronaczyniowego pęcherza na powierzchni bezkomórkowej macierzy w obecności indukcji zrębowej wzgl. urotelialno-zrębowej w dniu 14, które w obecności indukcji stworzyły rurkę we wnętrzu rusztowania; Fig. 4C - zdjęcie histologiczne do charakteryzacji hodowli in-vitro wysianych komórek śródbłonka mikronaczyniowego pęcherza na powierzchni bezkomórkowej macierzy w obecności indukcji za pomocą pożywki kondycjonowanej komórkami zrębu wzgl. urotelium i zrębu w dniu 21, przy czym dają się rozpoznać nowe rozgałęzienia (strzałki) rurki z kompletnie wykształconym światłem, które jest wyścielone komórkami śródbłonka mikronaczyniowego pęcherza; oraz Fig. 4D - zdjęcie immunohistochemiczne do charakteryzacji hodowli in-vitro wysianych komórek śródbłonka mikronaczyniowego pęcherza na powierzchni bezkomórkowej macierzy w obecności indukcji za pomocą pożywki kondycjonowanej komórkami zrębu wzgl. urotelium i zrębu w dniu 28, przy czym struktura naczyniowa jest wyścielona
23 komórkami śródbłonka pęcherza, i przy czym rozpoznawalna jest pozytywna ekspresja markera śródbłonkowego czynnik von Willebranda. Wielokrotna warstwa wysianych komórek śródbłonka mikronaczyniowego pęcherza na powierzchni macierzy ekspresjonowała również pozytywnie wspomniane przeciwciało. Przykłady [0067] Poniższe przykłady obrazują zgodny z wynalazkiem sposób wytwarzania konstruktów transplantu tkankowego dla dolnych narządów moczowych. [0068] O ile nie podano oddzielnych objaśnień, użyte skróty mają następujące znaczenie: FGF b-czynnik wzrostu fibroblastów DMEM (Dulbecco s modified Eagle s Medium) - modyfikowana pożywka hodowlana Eagle'a UEA-1 Ulex Europeaus Agglutinin 1 Lectin Materiały i metody : (a) Wytworzenie bezkomórkowych matryc [0069] Ludzkie lub świńskie pęcherze moczowe i błona podśluzowa pęcherza moczowego, cewka moczowa, skóra właściwa i jelita cienkie zostały przepłukane za pomocą roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami PBS (Invitrogen, Niemcy) i poddane działaniu surfaktantu Triton X 1 % przez 24 do 48 godzin z ostrożnym mieszaniem przy 37 C. Nieobecność komórek na matrycach została skontrolowana histologicznie.
24 (b) izolacja, hodowla i charakteryzacja ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego pęcherza i komórek śródbłonka mikronaczyniowego skóry [0070] W celu izolacji komórek śródbłonka mikronaczyniowego pęcherza pozyskano ludzką tkankę pęcherza moczowego od czwórki pacjentów, którzy poddani zostali otwartej operacji pęcherza moczowego. Urotelium zostało oddzielone drogą mikrodysekcji, a tkanka zrębowa rozdrobniona do rozkładu enzymatycznego oraz poddana trawieniu za pomocą roztworu 1 mg/ml kolagenazy typu II (Worthington Biochemical Corporation, USA) /dyspazy (0,05 mg/ml) (Invitrogen)/ μg/ml dezoksyrybonukleazy typu I (Boeringer Mannheim GmbH, Niemcy) w pożywce DMEM, zawierającej 0,2 % albuminy surowiczej (Sigma Aldrich, Niemcy) przez 2 godziny w 37 C z ciągłym mieszaniem. Materiał uzyskany z trawienia odwirowano przy 2000 rpm, zawiesina komórek została zebrana, rozcieńczona w pożywce DMEM i przefiltrowana przez urządzenie filtrujące z sitem nylonowym 40μm (BD Labware, Niemcy). Przefiltrowany materiał rozcieńczono pożywką DMEM (Invitrogen, Niemcy), zawierającą 2,5 % ludzkiej surowicy. Paramagnetyczne kuleczki polistyrenowe (kulki Dynabeads) (Dynal, Niemcy) zostały związane z lektyną UEA-1 (Sigma Aldrich, Niemcy) lub z monoklonalnym przeciwciałem przeciw cząsteczce adhezji komórkowej płytek i śródbłonka-1 (PECAM-1; CD 31) (Dakocytomation, Dania) przez inkubację 10 7 kulek Dynabeads z lektyną lub przeciwciałem CD 31 przez 24 godziny w temperaturze pokojowej, zgodnie z zaleceniami producenta. Kuleczki Dynabeads zostały zebrane przy użyciu urządzenia do koncentracji cząsteczek magnetycznych i przepłukane trzy razy w PBS/0,1 % albuminy surowiczej. Komórki śródbłonka mikronaczyniowego pęcherza zostały policzone i inkubowane w 4
25 C przez 10 min. razem z kuleczkami Dynabeads powleczonymi UEA 1 lub CD 31. Pozytywnie wyselekcjonowane komórki zostały następnie usunięte z mieszanej populacji komórek przy użyciu urządzenia do koncentracji cząsteczek magnetycznych (proporcja kulek Dynabeads do komórek śródbłonka wynosiła 10 : 1). Komórki związane z kulkami Dynabeads (komórki śródbłonka) zostały odzyskane i 10 razy przepłukane w DMEM/2,5 % ludzkiej surowicy. Negatywnie wyselekcjonowane nie związane komórki (komórki zrębu pęcherza) zostały przepłukane w PBS i hodowane w butelkach hodowlanych w warunkach wymienionych w punkcie (c). Oczyszczone komórki śródbłonka zawieszono ponownie w pożywce hodowlanej przy czym 10 4 komórki/cm 2 wysiano w szalkach hodowlanych. Pożywka była zmieniana co 2-3 dni. Komórki pasażowano przy konfluencji 70%. Po drugim pasażu komórki znów oczyszczono za pomocą kulek Dynabeads związanych z lektyną UEA-1 lub CD 31. Fenotyp śródbłonkowy komórek został potwierdzony przez immunohistochemiczne barwienie przy użyciu przeciwciał przeciwko czynnikowi von Willebranda i CD-34 (oba Dako). Komórki można było rozdzielać również za pomocą kulek Dynabeads z przyłączonymi CD105 wzgl. CD31. [0071] Otrzymane w ten sposób komórki śródbłonka mikronaczyniowego pęcherza trzeciego do szóstego pasażu zostały złożone w ciekłym azocie i użyte do eksperymentów. [0072] Celem izolacji ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego skóry ludzki napletek od pacjentów poddanych obrzezaniu został kilkakrotnie przemyty za pomocą PBS. Skóra właściwa została za pomocą mikronożyczek mechanicznie oddzielona od tłuszczu podskórnego. Dla oddzielenia skóry właściwej od naskórka tkanka była inkubowana przez 2 godziny w roztworze dyspazy 0,25 % (Boeringer Mannheim, Niemcy). Skóra właściwa została
26 następnie rozdrobniona i 30 min inkubowana w roztworze trypsyny (0,05 %)/EDTA (0,01 %) (Invitrogen, Niemcy). Uzyskana z trawienia zawiesina komórek została przefiltrowana przez sito nylonowe (rozmiar oka 40μm) i odwirowana. Pelety komórkowe rozcieńczono w EGM-2 (Cambrex, Niemcy) aż do subkonfluencji. Komórki zostały następnie wyjęte z szalek hodowlanych, komórki śródbłonka mikronaczyniowego skóry zostały wyselekcjonowane pozytywnie przy użyciu kulek Dynabeads, do których przyłączony był CD-31. Komórki trzeciego pasażu poddano drugiemu procesowi separacji. Fenotyp śródbłonkowy komórek został potwierdzony przez immunohistochemiczne barwienie przy użyciu przeciwciał przeciwko czynnikowi von Willebranda i CD-34. Komórki trzeciego do piątego pasażu zostały złożone w ciekłym azocie i użyte do dalszych eksperymentów. (c) izolacja i hodowla ludzkich dorosłych komórek zrębu pęcherza i komórek progenitorowych zrębu szpiku kostnego [0073] Pozostałe (negatywnie wyselekcjonowane) komórki zrębu pęcherza, które nie zostały przyłączone do kulek Dynabeads, zostały przepłukane w PBS a następnie hodowane w DMEM (Invitrogen, Niemcy) z dodatkową surowicą oraz penicylinąstreptomycyną. Charakterystyka immunohistochemiczna została oceniona za pomocą przeciwciał przeciw alfa-aktynie mięśni gładkich, wimentynie i pancytokeratynie. [0074] Komórki progenitorowe zrębu szpiku kostnego otrzymano ze szpiku kostnego kości grzebienia biodrowego sześciu zdrowych dorosłych pacjentów za pomocą biopsji igłowej i zebrano w heparynizowanej próbówce 50 ml. Pobrany materiał został zmieszany z identyczną objętością DMEM/10 % surowicy. Zawiesina komórek została naniesiona na górną stronę 10 ml
27 Ficoll-Paque (Amersham Pharmacia Biotech AB, Schweden) i wirowana przy 400xg przez 35 min w 4 C. Mononuklearne komórki zostały zebrane z interfazy, przefiltrowane przez urządzenie filtrujące z sitem nylonowym 100 μm (Becton Dickinson; Niemcy) i ponownie zawieszona w DMEM, uzupełnionym surowicą i penicyliną/streptomycyną, przy zagęszczeniu 10 6 komórek/cm 2. Komórki zostały scharakteryzowane za pomocą cytometrii przepływowej. Do tego celu komórki progenitorowe zrębu szpiku kostnego poddano trypsynizacji, przepłukano w PBS i inkubowano z przeciwciałami przeciw CD34, CD45, CD44, CD73, CD90 (wszystkie BectonDickinson) oraz CD133 (Miltenyi Biotech; Niemcy). Analizę przeprowadzono za pomocą cytometru przepływowego FACScalibur (Becton Dickinson). Komórki były namnażane do konfluencji przy czym pożywka hodowlana była zmieniana co 3 do 4 dni. [0075] Komórki zrębu pęcherza i komórki progenitorowe zrębu szpiku kostnego pierwszych pięciu pasaży zostały złożone w ciekłym azocie i użyte do eksperymentów. (d) izolacja i hodowla komórek urotelialnych oraz komórek urotelium i zrębu pęcherza [0076] Celem hodowli komórek urotelialnych pęcherza moczowego, błona śluzowa pęcherza moczowego, którą otrzymano drogą mikrodysekcji z biopsji pęcherza, została pocięta na wąskie fragmenty, poddana trawieniu w kolagenazie typu II 1 mg/ml przez 2 godziny, odwirowana przy 2000 rpm przez 5 min i hodowana w 25-ml szalkach z surowicą bez keratynocytów(cambrex). [0077] Aby otrzymać mieszaninę z komórek urotelialnych pęcherza i komórek zrębowych pęcherza, biopsje z pęcherza, składające się z urotelium pęcherza i zrębu pęcherza zostały
28 pocięte na małe fragmenty i w sposób opisany wyżej poddane trawieniu i zebrane. Komórki pierwszych pięciu pasaży zostały złożone w ciekłym azocie i użyte do dalszych eksperymentów. (e) Wytworzenie pożywki, które zostały skondycjonowane za pomocą komórek zrębowych pęcherza, komórek progenitorowych zrębu szpiku kostnego, komórek urotelialnych oraz komórek urotelium i zrębu pęcherza [0078] W każdym wypadku namnażano niezależnie od siebie komórki zrębowe pęcherza, komórki progenitorowe zrębu szpiku kostnego, komórki urotelialne oraz komórki urotelium i zrębu pęcherza do konfluencji, zanim zmieniono pożywkę na 20 ml DMEM, uzupełnioną surowicą i antybiotykami, na 72 h. Pożywki kondycjonowane poddano sterylnemu filtrowaniu. Dodano b-fgf 20 ng/ml do każdej pożywki kondycjonowanej. Następnie pożywki rozdzielono na części i zmagazynowano w temp. -80 C. [0079] Zastosowano test ELISA, żeby ustalić zagęszczenie czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) w pożywkach kondycjonowanych. Dla zmierzenia zagęszczenia cytokin opracowano test ilościowy ELISA przy użyciu komercyjnych zestawów dla czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (systemy R&D). Do tych testów pożywki kondycjonowane były zbierane po 72 godzinach hodowli, wirowane przy 2000 rpm przez 10 minut i przepuszczane przez filtr 0,3 μm. Wszystkie testy zostały przeprowadzone trzykrotnie na płytkach mikrotitracyjnych. (f) hodowla komórek śródbłonka mikronaczyniowego pęcherza i komórek śródbłonka mikronaczyniowego skóry na biologicznych rusztowaniach
29 [0080] Uzyskane według (a) komórki śródbłonka mikronaczyniowego pęcherza lub komórki śródbłonka mikronaczyniowego skóry hodowano w szalkach z trypsyną/edta, przy 70 % konfluencji usunięto, policzono i odwirowano, aby uzyskać pelety w pożądanej liczbie komórek. Komórki zostały ponownie zawieszone w pożywce hodowlanej i rozdzielone homogenicznie na górnej powierzchni matryc z końcowym zagęszczeniem 10 4 /cm 2. Hodowla komórek została przeprowadzona przez 28 dni w 37 C. Komórki były hodowane w (a) DMEM, uzupełnionej surowicą i b-fgf (grupa kontrolna a); lub (b) pożywce kondycjonowanej komórkami zrębu, uzupełnionej za pomocą b-fgf (grupa hodowlana b); lub (c) pożywce kondycjonowanej za pomocą komórek prekursorowych zrębu szpiku kostnego, uzupełnionej za pomocą b-fgf (grupa hodowlana c); lub (d) pożywce kondycjonowanej komórkami urotelium, uzupełnionej za pomocą b- FGF (grupa kontrolna d); lub (e) pożywce kondycjonowanej komórkami urotelium i zrębu pęcherza, uzupełnionej za pomocą b-fgf (grupa hodowlana e). [0081] Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone co najmniej podwójnie i niezależnie od siebie trzy razy powtórzone.
30 (g) Analizy mikroskopowe wyhodowanych komórek śródbłonka mikronaczyniowego pęcherza lub komórek śródbłonka mikronaczyniowego skóry na biologicznych rusztowaniach [0082] Na końcu każdego eksperymentu zakonserwowane w formalinie rusztowania biologiczne zostały zdehydratyzowane za pomocą cyklicznie zwiększanych stężeń alkoholu, ułożone w parafinie i pocięte na odcinki o szerokości 6 mm. Skład konstruktów zanalizowano za pomocą hematoksyliny i eozyny (HE) oraz immunohistochemicznie przy użyciu anty-ludzkiego przeciwciała czynnika von Willebranda, śródbłonkowospecyficznej lektyny UEA-1, anty-ludzkiego CD34 oraz antyludzkiego CD31 (PECAM-1) oraz oceniono przy użyciu mikroskopu z kontrastem fazowym (Zeiss, Niemcy). Proliferację komórek oceniono markerem proliferacji komórkowej Ki-67. Istnieją trzy parametry, których można użyć do oceny angiogenezy: długość kapilar, liczba kapilar i względny obszar kapilar. Oceniliśmy długość kapilar w trzech różnych przekrojach wzdłużnych z każdej próby za pomocą testu (Watanable et al., 2005). Długość kapilar ustalono przy tym każdorazowo w trzech histologicznych przekrojach wzdłużnych z trzech różnych konstruktów komórek, uzyskanych każdy z innego pęcherza moczowego podczas analiz metodą mikroskopii optycznej. Do tego celu zmierzono długość kapilarnych/rurkokształtnych struktur w histologicznych odcinkach wewnątrz macierzy w drodze ręcznego pomiaru rurek. Gęstości komórek reprezentatywnych histologicznych odcinków zmierzono w ten sam sposób. Wyniki
31 Izolacja i hodowla ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego pęcherza i komórek śródbłonka mikronaczyniowego skóry [0083] Najpierw należało stworzyć metodę selekcji, aby wyizolować i wytworzyć pierwotne hodowle komórek śródbłonka mikronaczyniowego tkanki zrębowej pęcherza, który składa się w pierwszym rzędzie z komórek mięśni gładkich, fibroblastów i komórek śródbłonka (vide uprzedni etap (a)). W tym celu użyto powlekanych lektyną lub przeciwciałami kulek Dynabeads. Stwierdzono, że dodatkowe czyszczenie kulkami Dynabeads podczas pierwszych pięciu pasaży było konieczne, aby wytworzyć > 95 % czyste kultury komórek śródbłonka mikronaczyniowego pęcherza. Przylegające kulki Dynabeads zostały w ciągu pierwszych dwóch pasaży wypłukane i nie interferowały ze wzrostem lub przeżyciem komórek śródbłonka mikronaczyniowego. Separacja komórek śródbłonka mikronaczyniowego skóry dała hodowlę, która zawierała 80 % komórki śródbłonka mikronaczyniowego. Druga separacja trzeciego pasażu dała czystość rzędu ponad 90 %. Budowa pierwotnych komórek śródbłonka mikronaczyniowego pierwszego pasażu wykazywała pewne zróżnicowanie wielkości i formy. Wraz z rosnącą liczbą pasaży populacja komórek wykazywała homologiczną budowę. Hodowane ludzkie komórki śródbłonka mikronaczyniowego pęcherza wykazywały charakterystyczne cechy komórek śródbłonka. Ekspresjonowały antygen czynnika VIII oraz CD 34. Izolacja, hodowla i charakteryzacja komórek zrębowych pęcherza, komórek progenitorowych zrębu szpiku kostnego oraz komórek urotelium i zrębu pęcherza.
32 [0084] Pierwotne kultury komórek zrębowych pęcherza i komórek progenitorowych zrębu szpiku kostnego zostały wytworzone pomyślnie ze zrębu pęcherza i pobrane przez aspirację szpiku kostnego. Hodowla mieszana komórek urotelialnych pęcherza i komórek zrębowych pęcherza udała się także i zawierała komórki urotelialne, komórki mięśni gładkich oraz fibroblasty. Czyste komórki urotelialne udało się uzyskać z błony śluzowej pęcherza moczowego. Izolowane komórki zaczęły przywierać i rosły podczas pierwszych 2 dni. Pozostały nieaktywne przez 3 do 5 dni; następnie zaczęły się szybko mnożyć. Hodowle komórek zrębowych pęcherza wykazywały jednolitą budowę z wrzecionowatymi komórkami. W pierwotnej hodowli (P0) komórki progenitorowe zrębu szpiku kostnego wykazywały trochę różnorodności w wielkości i formie składając się z trzech różnych typów budowy. Po pierwszym pasażu komórki te wykazywały jednolitą, wrzecionowatą budowę. Komórki zrębowe pęcherza i komórki prekursorowe zrębu szpiku kostnego wykazywały wzajemnie podobny potencjał proliferacyjny i typ wzrostu. W obu hodowlach uzyskano konfluencję po ok. 10 dniach. W ostatnich pasażach (>P 5 ) wrzecionowate komórki zaczęły wykazywać poszerzoną, płaską budowę. Dlatego pożywki kondycjonowane zbierano tylko na komórkach pasaży 1 do 5 (P 1 do P 5 ). [0085] Wyhodowane komórki urotelialne wykazywały ich typową nabłonkową budowę, która była jednolita przy kondycjonowaniu bez surowicy. Hodowla mieszana komórek urotelialnych i komórek zrębowych pęcherza pokazała równocześnie komórki o fenotypie urotelialnym oraz o fenotypie zrębowym wrzecionowatym. Hodowle komórek urotelialnych oraz hodowle komórek urotelium i zrębu pęcherza były pasażowane w stanie subkonfluencji. Tutaj komórki pierwszych pięciu pasaży także zostały użyte do wytwarzania pożywek kondycjonowanych.
33 [0086] Komórki progenitorowe zrębu szpiku kostnego zostały przetestowane za pomocą cytometrii przepływowej na obecność lub nieobecność charakterystycznych markerów hematopoetycznych. Ekspresjonowały one zazwyczaj antygeny CD105 i CD73. Poza tym komórki ekspresjonowały CD90 i CD44. Dla typowego limfocytycznego markera CD45 oraz dla wczesnych markerów hematopoetycznych CD34 i CD133 dawały wynik negatywny. [0087] Immunohistochemiczne analizy komórek zrębu pęcherza wykazały, że komórki te składały się z dwóch populacji komórek zawierającej ok. 50 do 60 % komórek wykazujących dodatnią ekspresję alfa-aktyny mięśni gładkich, i 40 do 50 % komórek zawierających wimentynę bez ekspresji alfa-aktyny mięśni gładkich. Hodowle komórek urotelialnych tworzyły populację komórek, która ekspresjonowała wyłącznie pancytokeratynę. Hodowla mieszana z komórek urotelium i zrębu pęcherza składała się równocześnie z trzech populacji komórek, mianowicie komórek wykazujących ekspresję pancytokeratyny, komórek ekspresjonujących alfa-aktynę mięśni gładkich oraz komórek ekspresjonujących wimentynę. Oba ostatnie typy komórek nie barwiły się przy użyciu przeciwciał przeciw pancytokeratynie. Test ELISA [0088] Pożywki, które uzyskano z wyhodowanych komórek zrębowych pęcherza, komórek progenitorowych zrębu szpiku kostnego, komórek urotelialnych lub mieszaniny komórek urotelialnych pęcherza i komórek zrębowych pęcherza, wykazały w teście ELISA zagęszczenie VEGF, przy czym najwyższe zagęszczenie zostało wyliczone z hodowli mieszanej komórek urotelialnych pęcherza i komórek zrębowych pęcherza (Fig. 1).
34 Analizy mikroskopowe wyhodowanych komórek śródbłonka mikronaczyniowego na biologicznych rusztowaniach [0089] Badania mikroskopowe wyhodowanych komórek śródbłonka mikronaczyniowego na biologicznych rusztowaniach wykazały przywieranie i przeżywanie komórek śródbłonka mikronaczyniowego na biologicznych rusztowaniach. Po 24 h komórki śródbłonka mikronaczyniowego zaczęły migrować na powierzchni bezkomórkowych membran, zachowując jednocześnie swój zróżnicowany fenotyp (pozytywna immunoreaktywność z czynnikiem von Willebranda, CD31 i CD 34 oraz wiązanie UEA- 1). Pokrywały do 45 cm 2 powierzchni macierzy i osiągały konfluencję jako pojedyncza warstwa w ciągu dwóch tygodni, co pokazuje wyższą zdolność migracji w systemach kondycjonowanych (grupy hodowlane b, c i e). Przybrały dwa różne typy budowy o fenotypie okrągłym oraz o fenotypie wydłużonym, podłużnym w pożywkach kondycjonowanych (grupy hodowlane b, c i e) oraz najczęściej okrągłą budowę w systemach nie kondycjonowanych (grupa kontrolna a) i w systemach kondycjonowanych tylko za pomocą komórek urotelialnych (grupa kontrolna d). Hodowle, które zostały zasilone kondycjonowanymi pożywkami zrębowymi (grupy hodowli b, c i e), wykazywały wyższą całościową gęstość komórek po 28 dniach hodowli w porównaniu do nie kondycjonowanych rusztowań kontrolnych (grupa kontrolna a). Całościowa gęstość komórek była najwyższa w tych systemach hodowli, które były kondycjonowane komórkami urotelium i zrębu pęcherza (grupa hodowlana e). Pożywka kondycjonowana tylko za pomocą komórek urotelialnych (grupa kontrolna d) nie wykazywała podwyższonej liczby komórek w porównaniu do nie kondycjonowanych systemów. Faktycznie w kondycjonowanych systemach hodowli (grupy
35 hodowli b, c i e) obserwowano proliferację komórek śródbłonka mikronaczyniowego w macierzy do 28 dni, jak pokazano przez barwienie dla markera proliferacji Ki67, a gęstość komórek rosła z czasem. W porównaniu z tym komórki śródbłonka mikronaczyniowego w nie kondycjonowanych systemach hodowli oraz w pożywkach kondycjonowanych tylko za pomocą komórek urotelialnych (grupa hodowlana d) zachowały aktywność proliferacyjną tylko w pierwszych 7 do 14 dniach, ale obumierały powoli przez ostatnie dwa do trzech tygodni hodowli. Obserwowany czas hodowli wynosił dla wszystkich grup 28 dni. [0090] Między pożywką kondycjonowaną za pomocą komórek zrębowych pęcherza (grupa kontrolna a) a pożywką kondycjonowaną za pomocą komórek progenitorowych zrębu szpiku kostnego (grupa hodowlana b) nie stwierdzono żadnych znaczących różnic. W obu tych systemach hodowli liczba komórek śródbłonka mikronaczyniowego pęcherza była 2,1- do 2,2 raza wyższa niż w grupie kontrolnej a (Fig. 2). Liczba komórek śródbłonka mikronaczyniowego skóry była w obu tych systemach hodowli (grupy hodowli b i c) 1,5- do 1,7 raza wyższa niż w grupie kontrolnej a. (Fig. 2). W systemach hodowli na pożywce skondycjonowanej za pomocą komórek urotelium i zrębu pęcherza (grupa hodowlana e), liczba komórek śródbłonka mikronaczyniowego pęcherza i komórek śródbłonka mikronaczyniowego skóry powiększyła się do 3,2- wzgl. 2,9 razy wyższej, każdorazowo w porównaniu z grupą kontrolną a (Fig. 2). [0091] Zastosowanie pożywek kondycjonowanych (grupy hodowli b, c i e) prowadziło do penetracji komórek śródbłonka mikronaczyniowego pęcherza do matryc na głębokość przenikania do 2,3 mm. W tych kondycjonowanych systemach zostało ponadto wyindukowane tworzenie się sznurów (rurek) (Fig. 4a) a po 10
36 do 14 dniach tworzenie się sieci kapilarnych. Stopień wykształcenia sieci był zależny od czasu trwania hodowli do dnia 28. Zgodnie z kapilarnym różnicowaniem stwierdzono, że komórki śródbłonka mikronaczyniowego pęcherza wzgl. komórki śródbłonka mikronaczyniowego skóry połączyły się tworząc kompletnie wykształcone światło kapilar, które były wyścielone monowarstwą komórek śródbłonka mikronaczyniowego (Fig. 4B, 4C i 4D) a dla czynnika von Willebranda (Fig. 4D) wykazywały pozytywne zabarwienie. [0092] Pod nieobecność pożywki kondycjonowanej (grupa kontrolna a) oraz w systemach hodowli, które były kondycjonowane tylko za pomocą komórek urotelialnych (grupa kontrolna d) komórki śródbłonka mikronaczyniowego pęcherza oraz komórki śródbłonka mikronaczyniowego skóry wykazywały minimalną penetrację macierzy i tworzyły tylko niewielką liczbę niedojrzałych poprzerywanych sznurów w czasie hodowli. [0093] Do oceny aktywności angiogenezy długość kapilar ustalono każdorazowo w trzech histologicznych przekrojach wzdłużnych z trzech różnych konstruktów komórek, uzyskanych każdy z innego pęcherza moczowego. Ocena ilościowa trójwymiarowej angiogenezy in-vitro została przeprowadzona za pomocą mikroskopowego pomiaru długości uformowanych rurek w trzech polach obserwacji. Wartości są przedstawione na fig. 3. Największą długość kapilar wykazywały komórki śródbłonka mikronaczyniowego skóry w obecności indukcji urotelialnozrębowej (grupa e). [0094] W tych systemach hodowli komórki śródbłonka mikronaczyniowego pęcherza osiągały długość całkowitą kapilar wynoszącą 240μm a komórki śródbłonka mikronaczyniowego skóry długość całkowitą kapilar wynoszącą 2100μm (Fig. 3). [0095] W obecności cytokin zrębowych lub urotelialnozrębowych nie wszystkie komórki śródbłonka mikronaczyniowego
37 pęcherza wzgl. komórki śródbłonka mikronaczyniowego skóry wydawały się być zdolne do inwazji. Pozostałe przyległe komórki śródbłonka mikronaczyniowego pęcherza wzgl. komórki śródbłonka mikronaczyniowego skóry nie wnikały do macierzy, a jedynie migrowały na powierzchni macierzy i tworzyły na niej wielokrotne warstwy komórek, reprezentowały przez to prawdopodobnie subpopulację heterogenicznej populacji komórek. [0096] Mimo, że komórki urotelialne są źródłem produkcji VEGF, nie stwierdzono żadnego działania indukującego ze strony pożywki kondycjonowanej za pomocą komórek urotelialnych na komórki śródbłonka mikronaczyniowego. Ten wynik wskazuje na to, że komórki urotelialne potrzebują dodatkowego efektu komórek zrębowych pęcherza, aby indukować tworzenie się naczyń in vitro. Synergistyczny efekt komórek urotelialnych i komórek zrębowych pokazał najsilniejszy efekt indukujący na komórki śródbłonka mikronaczyniowego w odniesieniu do proliferacji komórek i tworzenia rurekkapilar. Literatura [0097] Alberti C, Tizzani A, Piovano M, Greco A. What s in the pipeline about bladder econstructive surgery? Some remarks on the state of the art Int J Artif Organs. 2004; 27(9): 737-43. Atala A. New methods of bladder augmentation. BJU Int. 2000; 85Supp13: 2434; discussion36.
38 Blau, H. M., and Banfi, A. The well-tempered vessel. Nature Med.2001; 7, 532-534 Berthod F, Germain L, Tremblay N, Auger FA.J Cell Physiol. Extracellular matrix deposition by fibroblasts is necessary to promote capillary-like tube formation in vitro.2006 Feb 1. Carmeliet, P., and Jam, R. K. Angiogenesis in cancer and other diseases. Nature (London). 2000; 407,249-257 Darland DC, D Amore PA. TGF beta is required for the formation of capillary-like structures in three-dimensional cocultures of 10Tl12 and endothelial cells.angiogenesis.2001 4(1): 11-20. Erdag G, Sheridan RL. Fibroblasts improve performance of cultured composite skin substitutes on athymic mice.burns.2004;30(4):322-8. Ferrara, N., and Alitalo, K. Clinical applications of angiogenic growth factors and their inhibitors.nature Med.1999; 5, 1359-1 364. Gruber R, Kandler B, Holzmann P, Vogele-Kadletz M, Losert U, Fischer MB, Watzek G. Bone marrow stromal cells can provide a local environment that favors migration and formation of tubular structures of endothelial cells. Tissue Eng.2005; 11 (5-6): 896-903. Honorati MC, Neri S, Cattini L, Facchini A. lnterleukin- 17, a regulator of angiogenic factor release by synovial fibroblasts. Osteoarthritis artilage.2005; 23;
39 Epub ahead of print]. Hudon V, Berthod F, Black AF, Damour 0, Germain L, Auger FA. A tissueengineered endothelialized dermis to study the modulation of angiogenic and angiostatic molecules on capillary-like tube formation in vitro. Br J Dermatol.2003; 148(6):1094-104. Jam RK, Au P, Tam J, Duda DG, Fukumura D. Engineering vascularized tissue. Nat Biotechnol.2005; 23(7):821-3. Keshet, E., and Ben-Sasson, S. A. Anticancer drug targets: approaching angiogenesis. J.CIin. lnvest.1 999;1 04, 1497-1501. Lazarous DF, Shou M, Stiber JA, Dadhania DM, Thirumurti V, Hodge E, Unger EF. Pharmacodynamics of basic fibroblast growth factor: route of administration determines myocardial and systemic distribution. Cardiovasc Res.1997;36(1):78-85. Markowicz*, E. Koellensperger, S. Neuss, G.C.M. Steffens and N. PaIlua. Enhancing the Vascularization of Three-Dimensional Scaffolds: New strategies in Tissue Regeneration and Tissue Engineering. Topics in Tissue Engineering, Volume 2, 2005. Mertsching H, Walles T, Hofmann M, Schanz J, Knapp WH. Engineering of a vascularized scaffold for artificial tissue and organ generation. Biomaterials. 2005;26(33):661 0-7. Mooney DJ, Mikos AG. Growing new organs. Sci Am. 1999 Apr;280(4):60-5.
40 Omaida C. Velazquez, Ruthanne Snyder,Zhao-Jun Liu, Ronald M. Fairman., and Meenhard Herlyn Fibroblast- dependent differentiation of human microvascular endothelial cells into capillary-like, threedimensional networks. The FASEB Journal express article 10.1096/fj.01-lOllfje. Published online June 7,2002. Pepper MS, Ferrara N, Orci L, Montesano R. Potent synergism between vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor in the induction of angiogenesis in vitro. Biochem Biophys Res Commun. 1992;189(2):824-31. Risau W, Flamme I. Vasculogenesis. Annu Rev Cell Dev Biol. 1995;11:73-91. Tang YL, Zhao Q, Zhang YC, Cheng L, Liu M, Shi J, Yang YZ, Pan C, Ge J, Phillips Ml. Autologous mesenchymal stem cell transplantation induce VEGF and neovascularization in ischemic myocardium. Regul Pept2004;117:3-10. Thompson H. G., Truong D. T., Griffith C. K., George S. C. A three-dimensional in vitro model of angiogensis in the airway mucosa. Pulm Pharmacol Ther. 2006, Jan 13. Velazquez O. C., Snyder R., Lin Z., Fairman R. M., Herlyn M. Fibroblast-dependent differentiation of human microvascular endothelial cells into capillarylike, three-dimensional networks. The FASEB Journal 10.1096;06.2002. Watanabe M, Fujioka-Kaneko Y, Kobayashi H, Kiniwa M, Kuwano M, Basaki Y. Involvement of integrinlinked kinase in capillary/tube-like network formation of human vascular
41 endothelial cells.biol Proced Online. 2005;7:41-7. Epub 2005 Apr 27. Yancopoulos, G. D., Davis, S., Gale, N. W., Rudge, J. S., Wiegand, S. J., Holash, J. Vascular-specific growth factors and blood vessel formation. Nature (London).2000;407,242-248. Objaśnienia do fig. 1 do 3 Fig. 1: [0098] Analiza ilościowa VEGF w pożywkach, kondycjonowanych za pomocą wyhodowanych ludzkich komórek zrębowych pęcherza (b), ludzkich komórek progenitorowych zrębu szpiku kostnego (c), ludzkich komórek urotelium (d) oraz ludzkich komórek urotelium i zrębu pęcherza (e), w porównaniu do pożywek nie kondycjonowanych (a), jak oceniono za pomocą analizy ELISA. Pożywki zebrano 72 godziny po osiągnięciu konfluencji przez komórki. Każdy słupek pokazuje wartość średnią+odchylenie standardowe. Fig. 2: [0099] Populacje względne wyhodowanych komórek śródbłonka mikronaczyniowego (A) pęcherza oraz (B) skóry na bezkomórkowej macierzy, zasilone różnymi pożywkami hodowlanymi: a- pożywka nie kondycjonowana, b- pożywka, kondycjonowana za pomocą komórek zrębowych pęcherza, c- pożywka, kondycjonowana za pomocą komórek progenitorowych zrębu szpiku kostnego, d- pożywka, kondycjonowana za pomocą komórek urotelialnych, e- pożywka, kondycjonowana za pomocą
42 komórek urotelium i zrębu pęcherza. (wartość średnia+odchylenie standardowe) Fig. 3: [0100] Wartości średnie analizy metodą mikroskopii optycznej całkowitych długości sieci utworzonych rurek przez komórki śródbłonka mikronaczyniowego (A) pęcherza moczowego oraz (B) skóry, hodowane na bezkomórkowych matrycach w dniu 28 po wysianiu. Całościową długość sieci ustalono przez mikroskopowe uwidocznienie trzech histologicznych przekrojów wzdłużnych, z trzech różnych konstruktów komórek, uzyskanych każdy z innego pęcherza moczowego. Długość rurek została obliczona w drodze ręcznego pomiaru. Hodowle komórek śródbłonka mikronaczyniowego były zasilane: a- nie kondycjonowaną pożywką, b- pożywką, kondycjonowaną za pomocą komórek zrębowych pęcherza, c- pożywką, kondycjonowaną za pomocą komórek progenitorowych zrębu szpiku kostnego, d- pożywką, kondycjonowaną za pomocą komórek urotelialnych, e- pożywką, kondycjonowaną za pomocą komórek urotelium i zrębu pęcherza (wartość średnia+odchylenie standardowe).
43 Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób wytwarzania konstruktu transplantu tkankowego do rekonstrukcji narządu ludzkiego lub zwierzęcego, przy czym konstrukt transplantu tkankowego składa się z membrany oraz komórek śródbłonka mikronaczyniowego, obejmujący następujące kroki: (a) izolację komórek śródbłonka mikronaczyniowego skóry lub komórek śródbłonka mikronaczyniowego pęcherza; (b) naniesienie komórek śródbłonka mikronaczyniowego na biologicznie kompatybilną bezkomórkową membranę; (c) hodowlę komórek śródbłonka mikronaczyniowego, które zostały naniesione na biologicznie kompatybilną bezkomórkową membranę, w obecności indukcji zrębowej lub w obecności indukcji nabłonkowo- zrębowej w celu wykształcenia się w membranie struktur mikronaczyniowych, składających się z komórek śródbłonka mikronaczyniowego. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ludzki lub zwierzęcy narząd wybierany jest z grupy narządów obejmującej pęcherz moczowy, moczowód oraz cewkę moczową. 3. Sposób według zastrz. 1 albo zastrz. 2, znamienny tym, że komórki śródbłonka mikronaczyniowego są narządowo specyficznymi komórkami śródbłonka mikronaczyniowego. 4. Sposób według dowolnego z zastrz. 1 do 3, znamienny tym, że komórki śródbłonka mikronaczyniowego są autologicznymi komórkami śródbłonka mikronaczyniowego.
44 5. Sposób według dowolnego z zastrz. 1 do 4, znamienny tym, że indukcja zrębowa jest przeprowadzana przy użyciu ludzkich lub zwierzęcych komórek zrębowych pęcherza albo ludzkich lub zwierzęcych komórek progenitorowych zrębu szpiku kostnego. 6. Sposób według dowolnego z zastrz. 1 do 5, znamienny tym, że po zakończeniu hodowli komórek śródbłonka mikronaczyniowego, które zostały naniesione na biologicznie kompatybilną bezkomórkową membranę, w obecności indukcji zrębowej lub w obecności indukcji urotelialno-zrębowej (krok (c)) na tę membranę nanoszone są i hodowane na niej następne, tkankowo specyficzne komórki. 7. Konstrukt transplantu tkankowego do rekonstrukcji narządu ludzkiego lub zwierzęcego, składający się z (a) biologicznie kompatybilnej bezkomórkowej membrany; oraz z (b) komórek śródbłonka mikronaczyniowego, które przenikają membranę, przy czym komórki śródbłonka mikronaczyniowego są to komórki śródbłonka mikronaczyniowego skory lub komórki śródbłonka mikronaczyniowego pęcherza; przy czym wewnątrz membrany struktury mikronaczyniowe są wykształcone z komórek śródbłonka mikronaczyniowego. 8. Konstrukt transplantu tkankowego według zastrz. 7, znamienny tym, że ludzki lub zwierzęcy narząd wybierany jest z grupy narządow obejmującej pęcherz moczowy, moczowód oraz cewkę moczową. 9. Konstrukt transplantu tkankowego według zastrz. 7 albo zastrzeżenia 8, znamienny tym, że komórki śródbłonka
45 mikronaczyniowego są narządowo specyficznymi komórkami śródbłonka mikronaczyniowego. 10. Konstrukt transplantu tkankowego według dowolnego z zastrz. 7 do 9, znamienny tym, że komórki śródbłonka mikronaczyniowego są autologicznymi komórkami śródbłonka mikronaczyniowego. 11. Konstrukt transplantu tkankowego według dowolnego z zastrz. 7 do 10, znamienny tym, że struktury mikronaczyniowe obejmują światło naczyń. 12. Konstrukt transplantu tkankowego według dowolnego z zastrz. 7 do 11, znamienny tym, że struktury mikronaczyniowe są powiązane w sieć. 13. Konstrukt transplantu tkankowego według dowolnego z zastrz. 7 do 12, znamienny tym, że struktury mikronaczyniowe zostały wykształcone in vitro.
46
47
48
49
50
51