(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/US02/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/US02/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO03/ (13) B1 (51) Int.Cl. C12N 5/02 ( ) A01N 1/02 ( ) C12N 15/86 ( ) A01N 63/00 ( ) (54) Zastosowanie przeciwciała specyficznego dla P1H12 do wytwarzania wzbogaconej populacji komórek macierzystych oraz wzbogacona populacja komórek macierzystych i populacja komórek potomnych (30) Pierwszeństwo: , US, 60/343,498 (73) Uprawniony z patentu: IMMUNEX CORPORATION, Thousand Oaks, US (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 20/05 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 03/12 (72) Twórca(y) wynalazku: WILLIAM C. FANSLOW III, Normandy Park, US ANNE-MARIE C. ROUSSEAU, Seattle, US THOMAS O. DANIEL, Bainbridge Island, US (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Ewa Malewska PL B1

2 2 PL B1 Opis wynalazku Dziedzina wynalazku Obecny wynalazek dotyczy zastosowania przeciwciała specyficznego dla P1H12 do wytwarzania wzbogaconej populacji komórek macierzystych, a także wzbogaconej populacji komórek macierzystych i populacji komórek potomnych oraz ich wykorzystania, przy czym komórki macierzyste cechują się zdolnością do odnowy oraz zdolnością do wytworzenia komórek śródbłonkowych i/lub śródbłonkowopodobnych. Tło wynalazku Organizm ssaka składa się z wielu typów komórek o ukierunkowanej linii rozwoju i dojrzewania (lineage-committed cells), z których powstają różne tkanki organizmu ssaka. Pomimo różnorodności natury, morfologii, charakterystyki oraz funkcji takich komórek o ukierunkowanej linii rozwoju i dojrzewania, obecnie uważa się, że większość - jeśli nie wszystkie, komórek o ukierunkowanej linii rozwoju i dojrzewania wywodzi się z różnorodnych komórek macierzystych, z których mogą rozwijać się pojedyncze lub liczniejsze komórki o ukierunkowanej linii rozwoju i dojrzewania organizmu ssaka. Takie komórki macierzyste stanowią jedynie niewielki odsetek wszystkich komórek obecnych w organizmie oraz mogą się zmieniać stosownie do ich względnego ukierunkowania na tworzenie określonego typu komórek. Ponadto, nie jest wiadomo, jakie markery związane z komórkami o ukierunkowanej linii rozwoju i dojrzewania występują również na komórkach macierzystych. Jeden marker, o którym doniesiono, że występuje na komórkach macierzystych - CD34, można znaleźć na znaczącej ilości komórek potomnych, o ukierunkowanej linii rozwoju i dojrzewania. W szczególności, komórki-b (CD19 + ) oraz komórki mieloidalne (CD33 + ) stanowią 80-90% populacji CD34 +. Ponadto, kombinacja CD3, 8, 10, 15, 19, 20 oraz 33 będzie obecna na ponad 90% wszystkich komórek CD34 +. Zatem, z uwagi na niewielki udział komórek macierzystych w ogólnej ilości komórek w szpiku kostnym, niepewność co do markerów związanych z komórkami macierzystymi jako różnymi od bardziej zróżnicowanych komórek oraz generalnie brak możliwości wykrycia metodami prób biologicznych ludzkich komórek macierzystych - identyfikacja oraz oczyszczenie komórek macierzystych była wątpliwa. Komórki śródbłonkowe są komórkowymi jednostkami organizacyjnymi struktur naczyniowych. Ich powstanie, ekspansja oraz wbudowanie w naczynia krwionośne warunkują organogenezę podczas rozwoju embrionalnego. Podczas angiogenezy, komórki śródbłonkowe w istniejących naczyniach są aktywowane przez czynniki angiogenezy takie jak TGF, FGF oraz VEGF. Nowe naczynia powstają w wyniku proliferacji i migracji komórek, a także wydłużania i rozgałęziania istniejących naczyń. Niezbędna jest identyfikacja łatwo dostępnego źródła komórek macierzystych, które mogą powodować powstawanie komórek śródbłonkowych. Potrzeba ta jest szczególnie ostra w stosunku do komórek macierzystych pochodzących od dorosłych w świetle ostatnio wprowadzonych restrykcji w wykorzystywaniu funduszy federalnych do finansowania badań nad embrionalnymi komórkami macierzystymi. Posiadanie takich komórek macierzystych pozwoli na identyfikację czynników wzrostu związanych z regeneracją komórek śródbłonkowych. Ponadto, może okazać się, że istnieją jeszcze nieodkryte czynniki wzrostu lub inne czynniki biologiczne (przykładowo, czynniki transkrypcji) związane ze wczesnymi etapami dedykacji komórek macierzystych do wykształcania komórek śródbłonkowych, z zapobieganiem takiej dedykacji oraz negatywną kontrolą proliferacji komórek macierzystych. Dostępność komórek macierzystych byłaby wysoce pożądana i użyteczna przy transplantacji naczyń, inżynierii tkankowej oraz przy regulacji i zapobieganiu angiogenezie i naczyniogenezie. Komórki macierzyste oraz ich potomstwo mogą znaleźć zastosowanie w leczeniu uszkodzeń i naprawie mięśnia sercowego. Takie komórki macierzyste mogłyby być również stosowane do wprowadzania genu do organizmu w ramach reżimu terapii genowej. Obecny wynalazek odpowiada na to zapotrzebowanie. Wynalazek obejmuje zastosowanie przeciwciała specyficznego dla P1H12 do wytwarzania wzbogaconej populacji komórek macierzystych, na drodze pozytywnej selekcji z populacji oryginalnej, przy czym wspomniane komórki macierzyste cechują się zdolnością do wytworzenia komórek śródbłonkowych i/lub śródbłonkowo-podobnych. Zgodnie z zastosowaniem według wynalazku, wspomniana wzbogacona populacja komórek macierzystych zawiera komórki macierzyste P1H12+ w stężeniu co najmniej około 100-krotnie wyższym niż wspomniana oryginalna populacja komórek, korzystnie w stężeniu co najmniej około krotnie wyższym niż wspomniana oryginalna populacja komórek, a korzystniej - w stężeniu od około 1000-krotnie do około 4000-krotnie wyższym niż wspomniana oryginalna populacja komórek.

3 PL B1 3 Zgodnie z zastosowaniem według wynalazku, wspomniana wzbogacona populacja komórek macierzystych zawiera jeden lub więcej niż jeden z markerów wybranych z grupy obejmującej CD148, AC133, CD45 i CD34 w stężeniu wyższym niż we wspomnianej oryginalnej populacji komórek. Korzystnie, wspomnianym przeciwciałem jest monoklonalne przeciwciało. Zgodnie z zastosowaniem według wynalazku, wspomniane wzbogacanie obejmuje: (a) kontaktowanie wspomnianej oryginalnej populacji komórek z cząsteczką, która specyficznie wiąże się z cząsteczką wybraną z grupy obejmującej CD148, AC133, CD45 i CD34 oraz selekcję pod kątem uzyskania wspomnianej wzbogaconej populacji komórek, komórek związanych ze wspomnianą cząsteczką; (b) kontaktowanie wspomnianej wzbogaconej populacji komórek z cząsteczką, która specyficznie wiąże się z markerem wybranym z grupy obejmującej CD148, AC133, CD45 i CD34 oraz usuwanie ze wspomnianej wzbogaconej populacji komórek, komórek niezwiązanych ze wspomnianą cząsteczką; (c) kontaktowanie wspomnianej oryginalnej populacji komórek z cząsteczką, która specyficznie wiąże się z cząsteczką wybraną z grupy obejmującej CD144, CD202b, VEGFR2 oraz selekcję pod kątem uzyskania wspomnianej wzbogaconej populacji komórek, komórek niezwiązanych ze wspomnianą cząsteczką; (d) kontaktowanie wspomnianej wzbogaconej populacji komórek z cząsteczką, która specyficznie wiąże się z cząsteczką wybraną z grupy obejmującej CD144, CD202b, VEGFR2 oraz usuwanie komórek, które są związane ze wspomnianą cząsteczką ze wspomnianej wzbogaconej populacji komórek. Zgodnie z zastosowaniem według wynalazku, wspomniana wzbogacona populacja komórek macierzystych zawiera komórki macierzyste P1H12+, CD148+, AC133+, CD144-, CD202b- lub VEG- FR2, w stężeniu co najmniej około 100-krotnie wyższym niż wspomniana oryginalna populacja komórek, korzystnie w stężeniu co najmniej około 1000-krotnie wyższym niż wspomniana oryginalna populacja komórek, a korzystniej - w stężeniu od około 1000-krotnie do około 4000-krotnie wyższym niż wspomniana oryginalna populacja komórek. Zgodnie z zastosowaniem według wynalazku, wspomniana wzbogacona populacja komórek macierzystych jest ponadto: (a) wzbogacona w komórki macierzyste CD34+ lub CD45+; (b) wzbogacona w komórki macierzyste CD34- oraz CD45+; (c) wzbogacona w komórki macierzyste CD34+ oraz CD45+. Zgodnie z zastosowaniem według wynalazku, wspomniane przeciwciało połączone jest z wykrywalną jednostką lub jest przyłączone do stałego podłoża. Korzystnie, wspomniana wykrywalna jednostka jest ugrupowaniem fluorescencyjnym, ugrupowaniem kolorymetrycznym lub ugrupowaniem magnetycznym. Korzystnie, wspomniane stałe podłoże jest powierzchnią tworzywa sztucznego, powierzchnią szklaną, agarozą, akrylamidem, lektyną lub cząstką magnetyczną. Zgodnie z zastosowaniem według wynalazku, wspomniana oryginalna populacja komórek pochodzi od ssaka. Korzystnie, wspomnianym ssakiem jest ssak naczelny, a korzystniej wspomnianym naczelnym jest człowiek. Zgodnie z zastosowaniem według wynalazku, wspomniana oryginalna populacja komórek pochodzi z krwi obwodowej, ze szpiku kostnego lub z płodowej tkanki wątroby. Wynalazek obejmuje także wzbogaconą populację komórek macierzystych, zawierającą komórki macierzyste w stężeniu co najmniej około 100-krotnie wyższym niż wyjściowa populacja komórek, wzbogaconą w komórki macierzyste będące P1H12+, CD148+, AC133+, CD144-, CD202b- oraz VEGFR2- i będące CD34+ lub CD45+, przy czym wspomniane komórki macierzyste cechują się zdolnością do wytworzenia komórek śródbłonkowych i/lub śródbłonkowo-podobnych. Wynalazek obejmuje także populację komórek potomnych pochodzących od wzbogaconej populacji komórek macierzystych według wynalazku, przy czym wspomniane komórki potomne są P1H12+, CD144+, AC133-, CD202+, CD45-, VEGFR2+, posiadają wyższą zdolność proliferacji niż komórki HUVEC i MVEC oraz zawierają ciałka Weibel-Palade. Wzbogacona populacja komórek macierzystych jak określono wyżej oraz populacja komórek potomnych jak określono wyżej znajdują zastosowanie w terapii, przy czym zgodnie z wynalazkiem, wzbogacona populacja komórek macierzystych i/lub populacja komórek potomnych znajdują korzyst-

4 4 PL B1 nie zastosowanie w leczeniu zaburzenia lub choroby układu krążenia, albo zaburzenia lub choroby naczyniowej, bądź w działaniu nakierowanym na regenerację lub naprawę tkanek. Dzięki obecnemu wynalazkowi zapewniono możliwość wytwarzania wzbogaconej populacji komórek macierzystych, obejmującą oddzielanie tej wzbogaconej populacji komórek macierzystych od wyjściowej - określanej tu także jako oryginalna lub pierwsza, populacji komórek, gdzie wspomniana wzbogacona populacja komórek macierzystych zawiera komórki macierzyste P1H12+ w stężeniu co najmniej około 100-krotnie większym niż wspomniana pierwsza populacja komórek, korzystniej co najmniej około 1,000-krotnie większym niż wspomniana pierwsza populacja komórek, a nawet w stężeniu od około 1,000-krotnie do około 4,000-krotnie większym niż wspomniana pierwsza populacja komórek. W innym wykonaniu, wspomniana wzbogacona populacja komórek macierzystych zawiera ponadto jeden lub więcej niż jeden spośród markerów wybranych z grupy obejmującej CD148, AC133, CD45 oraz CD34 w stężeniu wyższym niż wspomniana pierwsza populacja komórek. W innym wykonaniu, wspomniany etap oddzielania obejmuje kontaktowanie wspomnianej pierwszej populacji komórek z cząsteczką, która specyficznie wiąże się z P1H12+ oraz selekcję pod kątem uzyskania wspomnianej wzbogaconej populacji komórek, które wiążą się z tą cząsteczką. Zgodnie z wynalazkiem, wspomnianą cząsteczką jest przeciwciało. W innym wykonaniu, wspomniane przeciwciało jest monoklonalnym przeciwciałem. Zgodnie z obecnym ujawnieniem, wspomniana cząsteczka może być uzyskana z przeciwciała, przykładowo może być cząsteczką fuzyjną peptyd-fc. W innym wykonaniu, wspomniany etap oddzielania obejmuje dodatkowo kontaktowanie wspomnianej pierwszej populacji komórek z cząsteczką, która specyficznie wiąże się z cząsteczką wybraną z grupy obejmującej CD148, AC133, CD45 i CD34 oraz selekcję pod kątem uzyskania wspomnianej wzbogaconej populacji komórek wiążących się ze wspomnianą cząsteczką. W innym wykonaniu, wspomniany etap oddzielania obejmuje dodatkowo kontaktowanie wspomnianej wzbogaconej populacji komórek z cząsteczką, która specyficznie wiąże się z markerem wybranym z grupy obejmującej CD148, AC133, CD45 i CD34 oraz usuwanie ze wspomnianej wzbogaconej populacji komórek tych, które nie ulegają związaniu ze wspomnianą cząsteczką. W innym wykonaniu, wspomniany etap oddzielania obejmuje ponadto kontaktowanie wspomnianej pierwszej populacji komórek z cząsteczką, która specyficznie wiąże się z cząsteczką wybraną z grupy obejmującej CD144, CD202b, VEGFR2 oraz selekcję pod kątem uzyskania wspomnianej wzbogaconej populacji komórek, zawierającej komórki, które nie wiążą się ze wspomnianą cząsteczką. W innym wykonaniu, wspomniany etap oddzielania obejmuje ponadto kontaktowanie wspomnianej wzbogaconej populacji komórek z cząsteczką, która specyficznie wiąże się z cząsteczką wybraną z grupy obejmującej CD144, CD202b, VEGFR2 oraz usuwanie ze wspomnianej wzbogaconej populacji komórek, komórek wiążących się ze wspomnianą cząsteczką. W innym wykonaniu, wspomniana wzbogacona populacja komórek macierzystych zawiera komórki macierzyste będące P1H12+, CD148+, AC133+, CD144-, CD202b- lub VEGFR2- w stężeniu co najmniej około 100- krotnie wyższym niż wspomniana pierwsza populacja komórek. W innym wykonaniu, wspomniana wzbogacona populacja komórek macierzystych zawiera komórki macierzyste będące P1H12+, CD148+, AC133+, CD144-, CD202b- lub VEGFR2- w stężeniu co najmniej około 1,000-krotnie wyższym niż wspomniana pierwsza populacja komórek. W innym wykonaniu, wspomniana wzbogacona populacja komórek macierzystych zawiera komórki macierzyste będące P1H12+, CD148+, AC133+, CD144-, CD202b- lub VEGFR2- w stężeniu około 1,000-krotnie do około 4,000-krotnie wyższym niż wspomniana pierwsza populacja komórek. W innym wykonaniu, wspomniana wzbogacona populacja komórek macierzystych jest dodatkowo wzbogacona w komórki macierzyste będące CD34+ lub CD45+. W innym wykonaniu, wspomniana wzbogacona populacja komórek macierzystych jest dodatkowo wzbogacona w komórki macierzyste będące CD34- oraz CD45+. W innym wykonaniu, wspomniana wzbogacona populacja komórek macierzystych jest dodatkowo wzbogacona w komórki macierzyste będące CD34+ oraz CD45+. W innym wykonaniu, wspomniany związek jest związany z wykrywalną jednostką. W innym wykonaniu, wspomniana wykrywalna jednostka jest jednostką fluorescencyjną, kolorymetryczną lub magnetyczną. W innym wykonaniu, wspomniana cząsteczka jest związana ze stałym podłożem. W innym wykonaniu, wspomniane stałe podłoże jest powierzchnią tworzywa sztucznego, powierzchnią szklaną, agarozą, akrylamidem, lektyną lub magnetyczną drobiną. W innym wykonaniu, wspomniany sposób obejmuje ponadto etap prowadzenia hodowli wspomnianej wzbogaconej populacji komórek macierzystych, z wytworzeniem komórek potomnych będących P1H12+, CD144+, AC133, CD202+, CD45-, VEGFR2+, posiadających większą zdolność proliferacyjną niż komórki HUVEC i MVEC oraz zawierających ciałka Weibel-Palade. W innym wykonaniu, wspomniana pierwsza populacja komórek pochodzi od ssaków. W korzystnym wykonaniu, wspomnianym ssakiem

5 PL B1 5 jest ssak z rodziny naczelnych. W innym korzystnym wykonaniu, wspomnianym naczelnym jest człowiek. Korzystnie, wspomniana pierwsza populacja komórek pochodzi z krwi obwodowej. W innym wykonaniu, wspomniana pierwsza populacja komórek pochodzi ze szpiku kostnego. W innym wykonaniu, wspomniana pierwsza populacja komórek pochodzi z płodowej tkanki wątroby. Obecny wynalazek zapewnia populację komórek macierzystych otrzymanych, jak to podano wyżej. W innym wykonaniu, wspomniane komórki macierzyste są pozytywne ze względu na jeden lub więcej niż jeden z markerów wybranych z grupy obejmującej CD148, AC133, CD45 oraz CD34. W innym wykonaniu, wspomniana wzbogacona populacja komórek macierzystych jest wzbogacona w komórki macierzyste będące P1H12+, CD148+, AC133+, CD144-, CD202b- oraz VEGFR2-. W innym wykonaniu, wspomniana wzbogacona populacja komórek macierzystych jest wzbogacona ponadto w komórki macierzyste będące CD34+ lub CD45+. W innym wykonaniu, wspomniana wzbogacona populacja komórek macierzystych jest ponadto wzbogacona w komórki macierzyste będące CD34+ oraz CD45+. W innym wykonaniu, wspomniana wzbogacona populacja komórek macierzystych jest ponadto wzbogacona w komórki macierzyste będące CD34- oraz CD45+. W innym wykonaniu, wspomniane komórki macierzyste zawierają ciałka Weibel-Palade. W innym wykonaniu, wspomniane komórki macierzyste są potomnymi komórkami śródbłonkowymi. Zgodnie z obecnym wynalazkiem populacje te uzyskiwane są ze wspomnianej pierwszej populacji komórek, pochodzącej od ssaków, korzystnie od ssaka z rodziny naczelnych, zwłaszcza człowieka, przy czym ta pierwsza populacja komórek pochodzi z krwi obwodowej. W innym wykonaniu, wspomniana pierwsza populacja komórek pochodzi ze szpiku kostnego. W innym wykonaniu, wspomniana pierwsza populacja komórek pochodzi z płodowej tkanki wątroby. Obecny wynalazek zapewnia także populację potomnych komórek pochodzących ze wzbogaconej populacji komórek macierzystych, gdzie wspomniane komórki potomne są P1H12+, CD144+, AC133-, CD202+, CD45-, VEGFR2+, posiadają większą zdolność do proliferacji niż komórki HUVEC oraz MVEC oraz zawierają ciałka Weibel-Palade. Ujawniono także wyizolowaną komórkę macierzystą P1H12+ oraz AC133+, która może się samoodnawiać oraz różnicować do komórki śródbłonkowej. W innym wykonaniu, wyizolowana komórka macierzysta jest ponadto CD148+, CD144-, VEGFR2- oraz CD202b-. W innym wykonaniu, wspomniana wyizolowana komórka macierzysta jest dodatkowo CD34+ lub CD45+. W innym wykonaniu, wyizolowana komórka macierzysta jest dodatkowo CD34+ oraz CD45+. W innym wykonaniu, wyizolowana komórka macierzysta jest dodatkowo CD34- oraz CD45+. W innym wykonaniu, wspomniana komórka macierzysta pochodzi od ssaka, korzystnie od ssaka z rodziny naczelnych, zwłaszcza od człowieka. Korzystnie, wspomniana pierwsza populacja komórek pochodzi z krwi obwodowej. W innym wykonaniu, wspomniana pierwsza populacja komórek pochodzi ze szpiku kostnego. W innym wykonaniu, wspomniana pierwsza populacja komórek pochodzi z płodowej tkanki wątroby. W innym wykonaniu, wspomniana wyizolowana komórka macierzysta jest zdolna do podlegania hodowli przez co najmniej 14 dni w kompletnej pożywce zawierającej 15% surowicy. W innym wykonaniu, wspomniana wyizolowana komórka macierzysta zawiera ponadto heterologiczną sekwencję polinukleotydu. Ujawniono także linię komórkową obejmującą wyizolowaną komórkę macierzystą, opisaną powyżej lub jej komórki potomne. W innym wykonaniu, obecny wynalazek zapewnia hodowlę komórek macierzystych zawierającą zasadniczo homogeniczną populację komórek macierzystych opisanych powyżej. Ujawniono także kompozycję zawierającą wyizolowaną komórkę macierzystą jak opisana wyżej oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. Korzystnie, wspomniany farmaceutycznie dopuszczalny nośnik jest wybrany z grupy obejmującej solankę, żel, hydrożel, gąbkę oraz matrycę. Ujawniono także wyizolowaną komórkę potomną otrzymaną w wyniku prowadzenia hodowli wyizolowanej komórki macierzystej opisanej wyżej, przez około 6 dni do około 3 tygodni w kompletnej pożywce z dodatkiem 15% surowicy, gdzie komórka potomna jest scharakteryzowana jako P1H12+, CD144+, AC133-, CD202+, CD45-, VEGFR2+, jako posiadająca większą zdolność do proliferacji niż komórki HUVEC i MVEC oraz zawierająca ciałka Weibel-Palade, wskazując także na hodowlę komórek potomnych zawierającą zasadniczo homogeniczną populację wyizolowanej komórki potomnej, opisanej wyżej. Wyizolowana komórka potomna, opisana wyżej może stanowić składnik aktywny kompozycji zawierającej także farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. Korzystnie, farmaceutycznie dopuszczalny nośnik jest wybrany z grupy obejmującej solankę, żel, hydrożel, gąbkę oraz matrycę.

6 6 PL B1 Ponadto, ujawniono konstrukt inżynierii tkankowej zawierający wyizolowaną komórkę macierzystą, opisaną wyżej oraz konstrukt inżynierii tkankowej zawierający potomstwo wyizolowanej komórki macierzystej, opisanej wyżej, a także konstrukt inżynierii tkankowej zawierający wspomnianą wyizolowaną komórkę macierzystą oraz jej komórki potomne. Ujawniono także sposób identyfikacji środka indukującego różnicowanie wyizolowanej komórki macierzystej, opisanej wyżej, obejmujący kontaktowanie wspomnianej wyizolowanej komórki macierzystej z testowanym środkiem oraz wykrywanie zmiany we wspomnianej wyizolowanej komórce macierzystej, gdzie wspomniana zmiana wskazuje, że wspomniany środek indukuje różnicowanie wspomnianej wyizolowanej komórki macierzystej, jak również sposób generowania konstruktu inżynierii tkankowej zawierającego komórki śródbłonka, który to sposób obejmuje hodowlę wyizolowanej komórki macierzystej, opisanej wyżej w konstrukcie inżynierii tkankowej. Wzbogacone populacje komórek według wynalazku mają zastosowanie w terapii, zwłaszcza w leczeniu zaburzenia lub choroby naczyniowej. Krótki opis rysunków Fig. 1 przedstawia wpływ różnych inhibitorów na indukowaną przez PMA migrację komórek śródbłonkowych ludzkiej krwi pochodzących od komórek macierzystych w próbie na zamykanie ran. Fig. 2 przedstawia wpływ różnych inhibitorów na indukowaną przez EGF migrację komórek śródbłonkowych ludzkiej krwi pochodzących od komórek macierzystych w próbie na zamykanie ran. Fig. 3 przedstawia zdolność komórek macierzystych oraz komórek potomnych według wynalazku do proliferacji, wyrażoną poprzez produkcję biomasy. Szczegółowy opis wynalazku Obecny wynalazek - odnoszący się do zastosowania przeciwciała specyficznego dla P1H12 do wytwarzania wzbogaconej populacji komórek macierzystych, zapewnia możliwość pozyskania komórek macierzystych, które mogą podlegać propagacji jako komórki macierzyste oraz mogą powodować wytworzenie komórek śródbłonkowych i/lub komórek śródbłonkowo-podobnych, sposoby wyodrębniania i wykorzystywania kompozycji obejmujących takie komórki macierzyste oraz komórki od nich pochodzące. Populacje komórek macierzystych według wynalazku znajdują zastosowanie w terapii genowej, inżynierii tkankowej, generowaniu tkanek, gojeniu ran, w diagnostyce, w charakterze środków angiogennych i naczyniogennych, jako środków do dostarczania genów i protein, a także w charakterze środków terapeutycznych. W innym aspekcie, obecny wynalazek zapewnia populację komórek macierzystych posiadających charakterystyki obejmujące zdolność do samoodnawiania oraz różnicowania do komórek śródbłonkowych i/lub komórek podobnych do śródbłonkowych. W jednym wykonaniu, komórki macierzyste według wynalazku mają czas podwajania swej liczebności od 18 do 24 godzin hodowli monowarstwowej oraz mają okresy trwałości dłuższe niż pierwotne ludzkie komórki śródbłonkowe znane ze stanu techniki (to znaczy HUVECs). Czas podwojenia jest zależny od ilości dni, w których uprzednio inkubowano komórki macierzyste w hodowli. W hodowli, te komórki macierzyste przyłączają się do i/lub migrują w substratach opartych na kolagenie i są zdolne do różnicowania do komórek o morfologii i/lub funkcji typowej dla komórek śródbłonkowych. Komórki macierzyste według obecnego wynalazku są zdolne do ekspresji jednego lub więcej niż jednego z markerów towarzyszących fenotypowi śródbłonkowej komórki macierzystej i/lub są pozbawione jednego lub więcej niż jednego z markerów towarzyszących komórce uzyskanej w wyniku różnicowania (przykładowo, komórce o obniżonej zdolności do samoodnawiania, regeneracji lub różnicowania) i/lub komórce o pochodzeniu hematopoetycznym. Cząsteczka stanowi "marker" pożądanego rodzaju komórek, jeżeli występuje w wystarczająco wysokim procencie komórek pożądanego rodzaju i w wystarczająco niskim procencie komórek niepożądanego rodzaju tak, że można osiągnąć żądany poziom oczyszczenia pożądanego rodzaju komórek w populacji komórek obejmującej zarówno pożądane, jak i niepożądane rodzaje komórek w wyniku selekcji pod kątem wyodrębnienia z tej populacji, tych komórek, które posiadają marker. Marker może występować, przykładowo, na 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% lub ponad 99% komórek pożądanego rodzaju i może być wykryty na w mniej niż 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1% lub poniżej 1% komórek niepożądanego rodzaju. Przykłady markerów charakterystycznych dla komórki macierzystej według wynalazku obejmują antygen P1H12 (znany również jako MUC18 oraz CD146; Solovey i wsp., 2001, J. Lab. Clin. Med. 138:322-31; przeciwciała rozpoznające ten antygen, dostępne z - przykładowo, CRP Inc., Denver, PA, numer katalogowy MMS-470R) oraz AC133 (Bhatia, 2001, Leukemia 15: ). Przykłady markerów, które typowo nie występują na

7 PL B1 7 komórkach macierzystych według wynalazku, obejmują: CD3, CD14, CD144, CD202b (znany także jako Tek oraz Tie-2; patrz Leukocyte Typing VII, Mason i wsp., (wyd.), Oxford University Press, 2002, strony ) lub dowolną ich kombinację. W pewnym wykonaniu, komórki macierzyste według wynalazku, po wyizolowaniu, są P1H12 + oraz AC Te komórki macierzyste również mogą być nisko CD34 lub CD34 -, CD148 +, i/lub CD45 + w czasie wyizolowywania. Komórka macierzysta według wynalazku może również nie mieć jednego lub więcej niż jednego z fenotypowych markerów CD14 -, CD144, CD202b i/lub VEGRF2. W związku z tym, w innym wykonaniu, komórki macierzyste są P1H12 +, CD148 +, AC133 +, CD34 +, CD45 +, CD144 -, CD202b - oraz VEGRF2 -. Określenia "komórka prekursorowa", "komórka potomna" oraz "komórka macierzysta" stosowane są zamiennie w stanie techniki oraz w obecnej dokumentacji i odnoszą się do pluripotentnej komórki potomnej o nieukierunkowanej linii rozwoju i dojrzewania, która jest potencjalnie zdolna do nieograniczonej ilości podziałów mitotycznych już to w celu odnowy jej linii już to do wytwarzania komórek potomnych, które będą podlegać różnicowaniu do komórek śródbłonkowych lub komórek śródbłonkowo-podobnych; lub do komórki potomnej o ukierunkowanej linii rozwoju i dojrzewania oraz jej potomstwa, które jest zdolne do samoodnawiania oraz do podlegania różnicowaniu do komórki śródbłonkowej. Odmiennie niż pluripotentne, komórki potomne o nieukierunkowanej linii rozwoju i dojrzewania są generalnie uważane za niezdolne do przekształcenia w komórki wielu różnych typów różniących się fenotypowo między sobą. Mogą one natomiast ulegać przekształceniu w komórki o określonej ukierunkowanej linii rozwoju i dojrzewania jednego lub ewentualnie dwóch typów. W innym aspekcie, obecny wynalazek zapewnia wyizolowane komórki macierzyste, pojedyncze lub w populacjach. Określenia "wyizolowany" lub "oczyszczony" - jeżeli odnoszą się do komórek macierzystych według wynalazku oznaczają komórki, które są zasadniczo wolne od komórek z markerami towarzyszącymi przypisaniu do określonej ukierunkowanej linii rozwoju i dojrzewania. W szczególnych wykonaniach, komórki macierzyste są w co najmniej 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% lub 99 procentach wolne od takich rodzajów zanieczyszczeń komórkowych. W innym wykonaniu, wyodrębnione komórki macierzyste są również zasadniczo wolne od rozpuszczalnych związków występujących w naturze. Jak to niżej przedyskutowano bardziej szczegółowo, zasadniczo oczyszczona komórka macierzysta według wynalazku może być otrzymana, przykładowo, w wyniku ekstrakcji (przykładowo, stosując odwirowanie z gradientem gęstości i/lub przepływową cytometrię) z naturalnego źródła takiego jak tkanka lub próbka krwi. Czystość może być mierzona dowolną odpowiednią metodą. Komórka macierzysta według obecnego wynalazku może być oczyszczona w 99%-100%, przykładowo metodą przepływowej cytometrii (przykładowo, analiza FACS), jak to omówiono niżej. Obecny wynalazek zapewnia wzbogaconą populację komórek macierzystych. "Wzbogacona populacja komórek macierzystych" jest populacją, w której komórki macierzyste według wynalazku zostały częściowo oddzielone od innych rodzajów komórek tak, że otrzymana populacja komórek macierzystych ma większe stężenie komórek macierzystych niż oryginalna wyjściowa populacja komórek. Wzbogacona populacja komórek macierzystych może mieć około 10-krotnie, 100-krotnie, 500-krotnie, krotnie, krotnie, krotnie, krotnie, krotnie, krotnie, krotnie, krotnie, krotnie, krotnie lub ponad krotnie większe stężenie komórek macierzystych niż oryginalna populacja przed rozdziałem. Komórki macierzyste według wynalazku mogą, przykładowo, stanowić co najmniej 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% lub ponad 99% wzbogaconej populacji komórek macierzystych. Wzbogacona populacja komórek macierzystych może być otrzymana przez, przykładowo, selekcję ze względu na komórki znaczone markerami związanymi z komórkami po różnicowaniu lub inne niepożądane rodzaje komórek i/lub przez selekcję pod kątem markerów związanych z komórkami macierzystymi według wynalazku, i/lub przez regenerację wyodrębnionych komórek macierzystych w zdefiniowanych systemach hodowli, jak to omówiono poniżej. W innym wykonaniu, obecna dokumentacja ujawnia linie komórkowe komórek macierzystych. W znaczeniu tutaj stosowanym, określenie "linia komórkowa" oznacza hodowlę komórek macierzystych według obecnego wynalazku lub ich komórek potomnych (przykładowo, komórek śródbłonkowych i/lub komórek podobnych do śródbłonkowych), które mogą być reprodukowane przez wydłużony okres czasu, korzystnie bezterminowo, który to termin obejmuje, przykładowo, komórki poddawane hodowli, krio-konserwowane i oraz ponownie hodowane po krio-konserwacji. W znaczeniu tutaj stosowanym określenie "hodowla" oznacza populację śródbłonkowych komórek macierzystych wzrasta-

8 8 PL B1 nych w pożywce oraz ewentualnie poddanych odnośnym przejściom. Hodowla komórki macierzystej może być pierwotną hodowlą (to znaczy hodowlą, która nie była poddawana przejściom) lub może być hodowlą wtórną drugorzędową lub kolejną hodowlą (co znaczy, że jest populacją komórek, które były przeniesione do podhodowli lub poddane przejściu raz lub więcej niż jeden raz). Jak to omówiono wyżej, komórki macierzyste według obecnego wynalazku cechują się obecnością i/lub nieobecnością pewnych markerów, które są specyficznie rozpoznawane przez cząsteczkę (związek). W związku z tym, zgodnie z jednym aspektem, obecny wynalazek zapewnia sposoby znakowania komórek macierzystych według wynalazku. W pewnym wykonaniu, komórki macierzyste są znakowane cząsteczką (przykładowo, przeciwciałem), która specyficznie rozpoznaje marker związany z komórką macierzystą według wynalazku (przykładowo, antygen P1H12). W innym wykonaniu, populacja komórek poddawana jest kontaktowaniu z cząsteczką specyficznie wiążącą się z markerem w warunkach, które pozwalają tej cząsteczce związać się z markerem, przy czym populacja komórek obejmuje co najmniej jedną komórkę macierzystą posiadającą wspomniany marker. W innym wykonaniu, populację komórek poddaje się kontaktowi ze związkiem, który specyficznie wiąże się z markerem w warunkach, które pozwalają na związanie cząsteczek tego związku z markerem, przy czym ta populacja komórek obejmuje komórki macierzyste, które nie posiadają tego markera oraz komórki niemacierzyste posiadające ten marker. Stosowanym związkiem (cząsteczką) może być, przykładowo, przeciwciało, pochodna przeciwciała, ligand, cząsteczka fuzyjna Fc-peptyd (przykładowo, jak to opisano w publikacji zgłoszenia patentowego PCT, nr WO 01/83525 A2) lub inny związek. Cząsteczka takiego związku może ewentualnie obejmować dodatkowe ugrupowanie, przykładowo, ugrupowanie wykrywalne (przykładowo, znakowane fluorescencyjnie lub kolorymetrycznie) wspomagające wyodrębnianie znakowanych komórek (przykładowo ugrupowanie, które jest związane z drugą cząsteczkę lub cząstka magnetyczna). W innym aspekcie, obecny wynalazek zapewnia możliwość wyodrębniania komórek macierzystych według wynalazku. Komórki macierzyste według wynalazku mogą być wyizolowane przez, przykładowo, wykorzystanie cząsteczek (przykładowo, przeciwciał, pochodnych przeciwciał, ligandów lub cząsteczek fuzyjnych Fc-peptyd) które wiążą się z markerem komórek macierzystych (przykładowo, antygen P1H12, CD34, CD45, AC133 oraz CD148) i pozytywną selekcję komórek, które wiążą się z tymi cząsteczkami (tak zwana selekcja pozytywna). Inne przykłady sposobów pozytywnej selekcji obejmują sposoby preferencyjnie promujące wzrost pożądanego typu komórek w populacji stanowiącej mieszaninę pożądanych i niepożądanych rodzajów komórek. Alternatywnie, stosując cząsteczki wiążące się z markerami, które nie występują w pożądanym rodzaju komórek, lecz występują w niepożądanym rodzaju komórek, niepożądane komórki zawierające takie markery mogą być usunięte z populacji pożądanych komórek (tak zwana selekcja negatywna). Inne sposoby selekcji negatywnej obejmują korzystnie zabijanie lub inhibitowanie wzrostu komórek niepożądanego rodzaju w mieszaninie populacji pożądanych i niepożądanych rodzajów komórek. W związku z tym, poprzez stosowanie negatywnej selekcji, pozytywnej selekcji lub ich kombinacji, można wytworzyć wzbogaconą populację komórek macierzystych. Śródbłonkowe komórki macierzyste według wynalazku mogą być wyizolowane z próbki pobranej od ssaka. Dawcą może być dowolny ssak (przykładowo wół, owca, świnia, pies, kot, koń, naczelny), lecz korzystnie człowiek. Próbkę komórek można uzyskać z dowolnego spośród szeregu różnych źródeł w tym, przykładowo, ze szpiku kostnego, tkanek płodowych (przykładowo, z płodowej tkanki wątroby), z krwi obwodowej, krwi pępowinowej oraz tym podobnych. Korzystnym źródłem komórek jest krew obwodowa z uwagi na wykorzystanie mniej inwazyjnych technik pobierania próbek takich komórek oraz łatwo dostępną populację dawców. W celu otrzymania komórek macierzystych według wynalazku, konieczne jest wyizolowanie, oddzielenie lub usunięcie komórek macierzystych według wynalazku spośród innych komórek, z którymi normalnie występują. Przykładowo, jeżeli źródło komórek pochodzi z krwi obwodowej, komórki macierzyste muszą być wzbogacone lub oddzielone od innych komórek (takich przykładowo, erytrocyty, płytki, monocyty, neutrofile, makrofagi oraz tym podobne). W celu oddzielenia komórek macierzystych według wynalazku mogą być zastosowane różne techniki, od wstępnego usunięcia komórek macierzystych według wynalazku z innych rodzajów komórek przez charakterystyczną ekspresję markera i/lub przez usunięcie komórek o ukierunkowanej linii rozwoju i dojrzewania z populacji komórek macierzystych według wynalazku w podobny sposób. Przeciwciała (przykładowo, monoklonalne przeciwciała) są szczególnie przydatne do identyfikacji markerów proteinowych na powierzchni komórkowej związanych z komórkami o ukierunkowanej linii

9 PL B1 9 rozwoju i dojrzewania i/lub w określonej fazie różnicowania. Przeciwciała mogą być przyłączone do stałego podłoża (przykładowo, powleczone przeciwciałem złoża magnetyczne). Przykłady dostępnych w handlu przeciwciał, które rozpoznają markery zależne od określonej ukierunkowanej linii rozwoju i dojrzewania obejmują anty-ac133 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA); anty-cd34 (Becton Dickinson, San Jose, CA), anty-cd31, anty-cd62e, anty-cd104, anty-cd106, anty-cd1a, anty-cd14 (wszystkie dostępne z firmy Pharmingen, Hamburg, Germany); anty-cd144 oraz anty-cd-13 (Immunotech, Marseille, France). Klon P1H12 (Chemicon, Temecula, CA; numer katalogowy MAB16985) wytwarza przeciwciało, które specyficznie reaguje z antygenem P1H12 (znanym także jako CD146, MCAM oraz MUC18). Przeciwciało P1H12 specyficznie lokalizuje komórki śródbłonkowe wszystkich naczyń włączając mikronaczynia normalnej i rakowatej tkanki. Przeciwciało P1H12 nie wybarwia komórek hematopoetycznych. Procedury rozdzielania mogą obejmować magnetyczne rozdzielanie, przy zastosowaniu złoży magnetycznych powleczonych przeciwciałem, chromatografii opartej na powinowactwie, środków cytotoksycznych przyłączonych do monoklonalnego przeciwciała lub takich środków stosowanych w połączeniu z monoklonalnym przeciwciałem, przykładowo, komplementu oraz cytotoksyn oraz "wychwytywania" z przeciwciałem przyłączonym do stałej matrycy (przykładowo, płytka), lub innej odpowiedniej techniki. Techniki zapewniające dokładne rozdzielanie obejmują sortery komórkowe aktywowane fluorescencyjnie, które mogą posiadać różne stopnie złożoności, przykładowo, mnogość kolorowych kanałów, kanały do wykrywania światła padającego pod niskim kątem oraz pod kątem rozwartym, a także kanały impedancyjne. Dogodnie, przeciwciała mogą być związane z markerami, takimi jak złoża magnetyczne, które pozwalają na bezpośrednie rozdzielanie, biotyna, która może być usunięta z awidyną lub streptawidiną związaną z podłożem, fluorochromy, które mogą być stosowane z sorterem komórkowym aktywowanym fluorescencjgnie lub tym podobne, co pozwala na łatwiejsze wyodrębnienie komórki szczególnego rodzaju. Dowolne techniki mogą być stosowane, o ile nie są niepotrzebnie szkodliwe dla żywotności komórek macierzystych. W pewnym wykonaniu, złoża magnetyczne połączone z przeciwciałami selektywnymi względem markerów z powierzchni komórkowej występujących u dużej ilości komórek o różnych liniach rozwoju i dojrzewania należących do systemów hematopoetycznych [przykładowo, komórki-t, komórki-b, (zarówno komórki pre-b oraz komórki-b) oraz komórki szpiczakowi] i/lub mniejszych populacji komórkowych (przykładowo, megakariocyty, komórki tuczne, eozynofile oraz bazofile) są stosowane zarówno przed, równocześnie z -, lub kolejno po stosowaniu selekcji z użyciem antygenu P1H12 w celu usunięcia komórek o ukierunkowanej linii rozwoju i dojrzewania lub innych komórek z komórek macierzystych według wynalazku. Co najmniej około 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% lub więcej wszystkich komórek hematopoetycznych będzie usuniętych; jednakże, nie jest istotne usunięcie wszystkich typów ostatecznie zróżnicowanych komórek. Płytki oraz erytrocyty mogą być usunięte (przykładowo, technikami z gradientem gęstości) przed sortowaniem lub rozdzieleniem komórek macierzystych od pozostałych nie-płytek, komórek nie-erytrocytowych. Gdy stosuje się protokół pozytywnej selekcji, komórki o ukierunkowanej linii rozwoju pozbawione markera, ze względu na który dokonywana jest selekcja pozytywna - będą pozostawione. Jednakże, w pewnym wykonaniu, stosowana jest zarówno pozytywna jak i negatywna selekcja tak, że w etapie końcowej pozytywnej selekcji, ilość obecnych dedykowanych komórek jest zminimalizowana. Biegły w sztuce rozpozna, że na skutek braku zdolności proliferacyjnej wielu rodzajów komórek w krwi obwodowej, większość - jeśli nie wszystkie, pozostałych komórek o określonej linii rozwoju i dojrzewania, po procesie pozytywnej i/lub negatywnej selekcji nie będzie ulegać proliferacji i/lub wiązaniu do substratu opartego na kolagenie oraz będzie usunięta podczas stosowania technik przepuszczania komórkowego. Kompozycje mające więcej niż około 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% lub więcej, mogą być wykonane w ten sposób, gdzie pożądane komórki macierzyste - zidentyfikowane jako P1H12 +, CD148 +, AC133 +, CD34 +, CD45 +, CD144 -, CD202b - oraz VEGRF2 -, są zdolne do samoodnawiania oraz przekształcania we w pełni zróżnicowane śródbłonkowe komórki i/lub komórki podobne do śródbłonkowych komórek. Kombinacje sposobów wzbogacania mogą być stosowane w celu poprawienia czasu lub wydajności oczyszczania lub wzbogacenia. Przykładowo, po etapie wzbogacenia - w celu usunięcia komórek zawierających markery, które nie wskazują na rodzaj badanych komórek, komórki mogą być dalej rozdzielane lub wzbogacane przez aktywowany fluorescencyjnie sorter komórkowy (FACS) lub zgodnie z inną metodologią posiadającą wysoką specyficzność. Można zastosować wielobarwne analizy przy użyciu FACS. Komórki mogą być rozdzielane na zasadzie poziomu wybarwienia szczególnego

10 10 PL B1 antygenu lub jego braku. Fluorochromy mogą być stosowane do znakowania przeciwciał specyficznych względem szczególnego antygenu. Takie fluorochromy obejmują fikobiliproteiny, przykładowo, fikoerytrynę oraz alofikocyjaniny, fluoresceinę, czerwień teksańską oraz tym podobne. Podczas gdy każde z połączeń obecnych w populacji może być rozdzielone w etapie rozdzielania, typowo przez proces negatywnej selekcji, korzystne jest, że badany typ komórek będzie wyodrębniany w jednym etapie w procesie pozytywnej selekcji. Komórki są typowo zbierane w kompletnej pożywce (przykładowo, EGM2, z określonymi uzupełnieniami; Clonetics Corporation) + 15% surowicy. Surowica może być ksenogeniczna, autologiczna, lub allogeniczna. Mogą być zastosowane inne techniki dla pozytywnej selekcji, które pozwalają na dokładne rozdzielenie, przykładowo rozdział na kolumnach oparty na powinowactwie oraz temu podobne. Chociaż szczególny porządek rozdzielania nie jest krytyczny dla obecnego wynalazku, korzystna kolejność obejmuje zgrubne rozdzielanie (przykładowo, odwirowanie z gradientem stężenia), a następnie dokładne rozdzielanie (przykładowo, pozytywna selekcja markera związanego z komórkami macierzystymi (przykładowo, antygen P1H12)). Typowo, po rozdzielaniu z gradientem stężenia następuje pozytywna selekcja komórek P1H12 +, które są następnie hodowane do dalszego namnażania komórek macierzystych według wynalazku. Dowolne markery specyficzne względem określonego rodzaju komórek mogą być stosowane do selekcji ze względu na - lub przeciw określonemu rodzajowi komórek. Przykłady takich markerów obejmują CD10/19/20 (związane z komórkami-b), CD3/4/8 (związane z komórkami-t), CD14/15/33 (związane z komórkami szpikowymi) oraz Thy-1, który nie występuje na ludzkich komórkach-t. Podobnie, rodamina 123 może być stosowana do podzielenia komórek CD34 + na "wysokie" oraz "niskie" podjednostki. Patrz: Spangrude, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. 87:7433, opis stosowania rodaminy 123 z mysimi komórkami macierzystymi. W pewnym wykonaniu, komórki macierzyste według wynalazku są w większości P1H12 +, CD148 +, AC133 +,.CD144 -, CD202b -, VEGRF2 oraz są nisko rodaminowe. Po wyizolowaniu komórek macierzystych, mogą być one ewentualnie propagowane w kompletnej pożywce (przykładowo, EGM2 zawierającej dostępne w handlu uzupełnienia z firmy Clonetics Corp., przykładowo, IGF, EGF, FGF oraz VEGF) + 15% cielęcej surowicy płodowej (FCS), w kondycjonowanej pożywce od innych rodzajów komórek, przykładowo komórek zrębowych (przykładowo, zrębowe komórki otrzymane ze szpiku kostnego, płodowej grasicy oraz płodowej wątroby), w pożywce zawierającej czynniki wzrostu związane z utrzymaniem komórki macierzystej, współhodowane z komórkami zrębowymi lub w pożywce obejmującej czynniki podtrzymujące proliferację komórek macierzystych, gdzie komórki zrębowe mogą być, przykładowo, allogeniczne lub ksenogeniczne. Przed użyciem we współhodowli, zmieszane preparaty komórek zrębowych mogą być uwolnione od komórek hematopoetycznych stosując odpowiednie monoklonalne przeciwciała w celu usunięcia niepożądanych komórek, jak przykładowo, koniugaty toksyny-przeciwciała, przeciwciało oraz komplement i tym podobne. Alternatywnie, można stosować klonowane zrębowe linie komórkowe, przy czym zrębowe linie mogą być allogeniczne lub ksenogeniczne. Ponadto, komórki macierzyste według wynalazku mogą być hodowane w układzie bioreaktora. W innym wykonaniu, obecny wynalazek zapewnia możliwości tworzenia i/lub utrzymywania populacji komórek macierzystych lub ich komórek potomnych, jak również mieszanych populacji obejmujących zarówno komórki macierzyste, jak i komórki potomne podobne do śródbłonkowych oraz tak wytwarzane populacje komórek. Tak jak to jest z komórkami macierzystymi według wynalazku, gdy hodowla komórek podobnych do śródbłonkowych lub mieszana hodowla komórek macierzystych oraz komórek podobnych do śródbłonkowych jest założona, populację komórek poddaje się mitotycznej ekspansji in vitro poprzez przepuszczenie do świeżej pożywki tak, jak to dyktuje gęstość komórek, w warunkach zachęcających do proliferacji komórek, z - lub bez formowania śródbłonka. Takie sposoby hodowli mogą obejmować, przykładowo, prowadzenie przejść komórek w pożywce, w których jest brak IGF, EGF, FGF, VEGF, i/lub innego czynnika wzrostu. Hodowle obejmujące komórki śródbłonkowe i/lub komórki podobne do śródbłonkowych oraz mieszane hodowle obejmujące komórki macierzyste oraz śródbłonkowe i/lub komórki podobne do śródbłonkowych mogą być przenoszone do świeżej pożywki, kiedy wystarczająco zwiększa się gęstość komórek. Chociaż wiele rodzajów komórek według obecnego wynalazku nie przejawia typowego kontaktowego inhibitowania-apoptozy, stają się one nieruchome, kiedy gęstość jest maksymalna. A więc, w pewnym wykonaniu, formowanie konfluentnej monowarstwy komórek jest powstrzymane lub zminimalizowane przez, przykładowo, przeniesienie części komórek do nowego naczynia do hodowli ze świeżą pożywką. Takie usunięcie lub przeniesienie może być wykonane w dowolnym naczyniu do hodowli, które posiada komórkową mono-

11 PL B1 11 warstwę przekraczającą gęstość około 1 x 10 6 komórek na kolbę do hodowli tkankowej T75. Alternatywnie, system hodowli może być mieszany w celu zabezpieczenia komórek przed zlepianiem. Kiedy sporządzono stabilne hodowle komórek macierzystych według wynalazku, jak opisano powyżej, to mogą być one utrzymywane lub przechowywane w komórkowych "bankach" obejmujących ciągłą hodowlę in vitro komórek wymagających regularnego przenoszenia lub korzystnie komórki mogą być krio-zakonserwowane. Krio-konserwowanie komórek macierzystych lub innych komórek według wynalazku, może przebiegać według znanych metod, takich jak metody opisane w: Doyle i wsp., (wyd.), 1995, Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures, John Wiley & Sons, Chichester. Przykładowo, lecz nie wyłącznie, komórki mogą być zawieszone w "pożywce do zamrożenia" takiej, jak przykładowo, pożywka do hodowli obejmująca dodatkowo 15-20% FBS oraz 10% dimetylosulfotlenku (DMSO), z - lub bez 5-10% glicerolu, o gęstości, przykładowo, około 4-10 x 10 6 komórek/ml. Komórki rozkłada się do szklanych lub plastikowych naczynek, które następnie zapieczętowuje się i przenosi do komory zamrażającej programowalnej lub pasywnej zamrażarki. Optymalna szybkość zamrażania może być określona doświadczalnie. Przykładowo, może być stosowany program zamrażania, który daje zmianę temperatury o -1 C/min poprzez ciepło stapiania. Kiedy naczyńka zawierające komórki osiągną temperaturę -80 C, przenosi się je do pomieszczenia do przechowywania w ciekłym azocie. Krio- -zakonserwowane komórki mogą być przechowywane przez lata, chociaż powinny być kontrolowane co najmniej co każde pięć lat pod kątem utrzymania zdolności do przeżycia. Krio-zakonserwowane komórki według wynalazku tworzące bank komórek, których porcje mogą być pobrane przez rozmrożenie, a następnie stosowane do wytwarzania hodowli komórek macierzystych obejmującej komórki macierzyste, śródbłonkowe i/lub komórki podobne do śródbłonkowych, lub w razie potrzeby tkankę śródbłonkową. Rozmrażanie powinno generalnie przebiegać szybko, przykładowo, poprzez przeniesienie naczyńka z ciekłego azotu do kąpieli wodnej o temperaturze 37 C. Rozmrożone zawartości naczyńka powinny być niezwłocznie (bezpośrednio) przeniesione w sterylnych warunkach do naczynia do hodowli zawierającego odpowiednią pożywkę taką, jak kompletna pożywka (przykładowo, pożywka EGM2 zawierająca IGF, EGF, FGF oraz VEGF) + 15% FCS. Warto doradzić, żeby komórki w pożywce do hodowli były doprowadzone do początkowej gęstości około 1-3 x 10 5 komórek/ml tak, żeby komórki mogły kondycjonować pożywkę tak szybko jak to możliwe, a przez to zapobiegać przewlekłej fazie opóźnienia. Podczas hodowli komórki mogą być badane codziennie, przykładowo, za pomocą mikroskopu inwersyjnego w celu wykrycia proliferacji komórkowej oraz tworzenia ich pod-hodowli, gdy tylko osiągną odpowiednią gęstość. Komórki macierzyste według wynalazku mogą być pobrane z banku komórek w razie potrzeby i stosowane do wytwarzania nowych komórek macierzystych, śródbłonkowych i/lub komórek podobnych do śródbłonkowych i/lub śródbłonkowej tkanki in vitro, przykładowo, jako trójwymiarowa śródbłonkowa hodowla, jak opisano poniżej, lub in vivo, przykładowo, przez bezpośrednie podawanie komórek do miejsca, gdzie nowe śródbłonkowe komórki lub tkanka, są potrzebne. Jak tutaj opisano, komórki macierzyste według wynalazku mogą być stosowane do wytwarzania nowej tkanki śródbłonkowej do wykorzystania u osobnika, gdy komórki były pierwotnie wyizolowane z własnej krwi tego osobnika lub z innej tkanki (to znaczy, z komórek autologicznych). Alternatywnie, komórki według wynalazku mogą być stosowane jako wszechobecne komórki donorowe w celu wytwarzania nowej tkanki śródbłonkowej do wykorzystania przez dowolnego osobnika (to znaczy, komórki heterologiczne). Po wytworzeniu, hodowla komórek macierzystych może być stosowana do wytwarzania podobnych do śródbłonkowych komórek potomnych i/lub komórek śródbłonkowych zdolnych do wytwarzania nowej tkanki śródbłonkowej. Zróżnicowanie komórek macierzystych na komórki śródbłonkowe lub komórki podobne do śródbłonkowych, a następnie wytwarzanie z nich tkanki śródbłonkowej, może być zapoczątkowane przez specyficzne egzogenne czynniki wzrostu lub przez zmianę warunków hodowli (przykładowo, gęstości) hodowanych komórek macierzystych. Ponieważ komórki są naiwne, mogą być stosowane do rekonstytucji osobnika po naświetlaniu i/lub osobnika leczonego chemioterapią; lub jako źródło komórek na specyficzne połączenia, przez zapewnienie ich dojrzewania, proliferacji oraz różnicowania do jednego lub więcej niż jednego wybranego połączenia. Przykłady czynników, które mogą być stosowane do indukowania różnicowania obejmują erytropoetynę, czynniki stymulujące kolonie - przykładowo, GM-CSF, G-CSF, lub M-CSF, interleukiny, przykładowo, IL-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8 oraz tym podobne, czynnik inhibitorowy leukemii (LIF), czynnik Steela (Stl) lub tym podobne, współhodowanie z miocytami sercowymi lub innymi rodzajami komórek o ukierunkowanej linii rozwoju

12 12 PL B1 i dojrzewania, do indukowania komórek macierzystych, do ich ukierunkowywania na przekształcanie w komórki o określonej ukierunkowanej linii rozwoju i dojrzewania. W innym aspekcie, wynalazek zapewnia możliwości prowadzenia hodowli komórek macierzystych, powodujące wzrastanie komórek potomnych oraz komórki tak wytworzone. W pewnym wykonaniu, komórka potomna jest P1H12 +, CD144 +, AC133 -, CD202b +, CD45 -, VEGFR2 +, ma wysoką zdolność do proliferacji w porównaniu z komórkami HUVEC i MVEC oraz zawiera ciałka Weibel-Palade. W innym wykonaniu, komórki macierzyste są poddane obróbce metodami inżynierii genetycznej w celu ekspresji genów dla określonych rodzajów czynników wzrostu, takich jak - przykładowo, TGF-β, b-fgf, VEGF, FGF-18 oraz tym podobnych do skutecznego i/lub usprawnionego różnicowania do komórek śródbłonkowych i/lub całkowitej produkcji komórek śródbłonkowych albo przed - lub po implantacji. Inne czynniki lub geny, które mogą być indukowane w - oraz transferowane do komórek macierzystych lub do komórek potomnych komórki macierzystej według wynalazku, dla terapeutycznych korzyści obejmują, przykładowo, IL17R, TNFR, angiopoetynę-1 oraz -2, TWEAK, TWEAKR, jak również inne przeciw-zapalne lub angiogeniczne czynniki znane w sztuce. Uważa się, że ilość natywnych komórek śródbłonkowych (EC) i/lub ich zdolność do przeżycia zmniejszają się w czasie. A więc, w niektórych populacjach pacjentów - przykładowo wśród osób starszych, rezydentna populacja komórek EC zdolnych do odpowiedzi na cytokiny angiogeniczne może być ograniczona. W związku z tym, komórki macierzyste według wynalazku mogą zapewnić pożądaną populację komórek, co skutkuje zwiększeniem aktywności angiogenicznej oraz reperacji tkanek. Komórki według wynalazku mogą być stosowane do leczenia osób wymagających naprawy lub zamiany tkanki śródbłonkowej na skutek choroby lub urazu albo w celu realizacji funkcji kosmetycznych, takich jak wzmocnienie widocznych lub innych cech ciała. Leczenie może pociągać za sobą stosowanie komórek według wynalazku w celu wytwarzania nowej śródbłonkowej tkanki oraz stosowanie tak wytworzonej tkanki śródbłonkowej, według dowolnego ze sposobów obecnie znanych w sztuce lub które będą opracowane w przyszłości. Przykładowo, komórki według wynalazku mogą być implantowane, podawane w postaci iniekcji lub innymi drogami podawania bezpośrednio do miejsca uszkodzenia w tkance tak, że będą one wytwarzać nową śródbłonkową tkankę in vivo. W pewnym wykonaniu, podawanie obejmuje podawanie genetycznie zmodyfikowanych śródbłonkowych komórek macierzystych. W pewnym wykonaniu, formulacja obejmująca komórki według wynalazku jest wytwarzana w postaci nadającej się do bezpośredniej iniekcji do miejsca, w którym pożądane jest wytwarzanie nowej tkanki śródbłonkowej. Przykładowo, lecz nie wyłącznie, komórki według wynalazku mogą być zawieszone w roztworze hydrożelu do iniekcji. Alternatywnie, roztwór hydrożelu zawierający komórki można pozostawić do utwardzenia, przykładowo w formie (jak przykładowo konstrukt naczyniowy lub tkanka rurkowa), uzyskując matrycę posiadającą komórki zdyspergowane w niej przed implantacją. Kiedy matryca stwardnieje, formacje komórkowe mogą być hodowane tak, że komórki są mitotycznie namnażane przed implantacją. Hydrożel jest organicznym polimerem (naturalnym lub syntetycznym), który jest usieciowany poprzez wiązania kowalencyjne, jonowe lub wodorowe, kreując trójwymiarową strukturę otwartej kratownicy, która wyłapuje cząsteczki wody tworząc żel. Przykłady materiałów, które mogą być stosowane do wytwarzania hydrożelu obejmują polisacharydy, takie jak alginian oraz jego sole, polifosfazyny oraz poliakrylany, które są usieciowane jonowo, bądź polimery blokowe takie, jak PLURONICS TM lub TETRONICS (BASF Corp., Mount Olive, NY), kopolimery blokowe tlenek polietylenu - glikol polipropylenowy, które są sieciowane na skutek działania, odpowiednio, temperatury lub ph. Sposoby syntezy materiałów hydrożelowych, jak również sposoby wytwarzania takich hydrożeli, są znane w sztuce. Takie formulacje komórkowe mogą dalej obejmować jeden lub więcej niż jeden inny komponent, w tym wybrane komponenty zewnątrzkomórkowej matrycy, takie jak jeden lub więcej niż jeden spośród rodzajów kolagenu znanych w sztuce, i/lub czynniki wzrostu oraz leki. Czynniki wzrostu, które mogą być użytecznie wprowadzone do formulacji komórkowej, obejmują jeden lub więcej niż jeden spośród tkankowych czynników wzrostu znanych w sztuce lub które będą zidentyfikowane w przyszłości, takie - lecz nie wyłącznie, jak dowolny członek rodziny TGF-β, IGF-I i IGF-II, hormon wzrostu, różne BMP takie jak BMP-13 oraz tym podobne. Alternatywnie, komórki według wynalazku mogą być poddane obróbce metodami inżynierii genetycznej by eksprymować i wytwarzać czynniki wzrostu takie, jak BMP-13 lub TGF-β. Szczegóły obróbki komórki według wynalazku metodami inżynierii genetycznej podano poniżej. Leki, które mogą być korzystnie wprowadzone do formulacji tych komórek obejmują, przykładowo związki przeciwzapalne, jak również środki znieczulające miejscowo. Inne

13 PL B1 13 komponenty, które mogą być również objęte formulacjami obejmują, przykładowo bufory zapewniające odpowiednie ph oraz izotoniczność, środki smarujące, materiały o dużej lepkości w celu utrzymywania komórek w miejscu podawania lub w pobliżu miejsca podawania (przykładowo, alginiany, agary oraz gumy roślinne) oraz inne rodzaje komórek, które mogą powodować pożądany skutek w miejscu podawania (przykładowo wzmocnienie lub modyfikację formowania tkanki śródbłonkowej, lub też jej fizykochemicznych charakterystyk, wsparcie zdolności komórek do życia lub inhibitowanie stanu zapalnego lub odrzucenia). Komórki można pokryć odpowiednim opatrunkiem na ranę, aby zapobiec opuszczaniu przez komórki miejsca, w którym mają być zlokalizowane. Takie opatrunki na rany są znane biegłym w sztuce. Alternatywnie, komórki macierzyste według wynalazku mogą być rozsiane w trójwymiarowym szkielecie lub rusztowaniu i hodowane, powodując wzrost komórek wypełniających matrycę lub bezpośrednio implantowanych in vivo, gdzie rozsiane komórki będą proliferować na powierzchni szkieletowej i formować zastępczą tkankę śródbłonkową in vivo we współdziałaniu z komórkami pacjenta. Taki szkielet może być implantowany w połączeniu z dowolnym jednym lub więcej niż jednym spośród czynników wzrostu, z lekarstwami, dodatkowymi rodzajami komórek lub z innymi komponentami powyżej opisanymi, które stymulują wytwarzanie śródbłonka lub w inny sposób wzmacniają lub poprawiają funkcjonowanie rozwiązania według wynalazku. Komórki według wynalazku mogą być stosowane do wytwarzania nowej, śródbłonkowej tkanki in vitro, która może być następnie implantowana, transplantowana lub w inny sposób wstawiana do miejsca wymagającego naprawy tkanki śródbłonkowej, zamiany lub zwiększenia jej ilości u pacjenta. W nieograniczających przykładach wykonania, komórki macierzyste według wynalazku są stosowane do wytwarzania trójwymiarowego konstruktu tkanki in vitro, który jest następnie implantowany in vivo. Jeśli chodzi o przykład wytwarzania trójwymiarowych konstruktów tkankowych, to patrz: patent nr US 4,963,489, wydany 16 października 1990 roku, na rzecz Naughton'a i wsp., który jest przywołany tutaj jako odnośnik literaturowy. Przykładowo, śródbłonkowe komórki macierzyste oraz śródbłonkowe i/lub podobne do śródbłonkowych komórki według wynalazku mogą być wszczepione lub "rozsiane" w trójwymiarowym szkielecie lub rusztowaniu oraz proliferowane lub poddane wzrostowi in vitro tworząc żywą tkankę śródbłonkową, która może być implantowana in vivo. Trójwymiarowy szkielet może być wykonany z dowolnego materiału i/lub w dowolnym kształcie, który pozwala na przymocowanie do niego komórek (lub może być zmodyfikowany tak, by pozwalać na przymocowanie do niego komórek) oraz pozwala na wzrost komórek w więcej niż jednej warstwie. Wiele różnych materiałów może być stosowanych do formowania matrycy, w tym - lecz nie wyłącznie, materiały takie jak: nylon (poliamidy), dakron (poliestry), polistyren, polipropylen, poliakrylany, związki poliwinylowe (przykładowo polichlorek winylu), poliwęglan (PVC), politetrafluoroetylen (PTFE, teflon), THERMANOX (TPX), nitroceluloza, bawełna, kwas poliglikolowy (PGA), kolagen (w postaci gąbek, splotów lub gładkich nitek oraz tym podobnych), szwy katgutowe, celuloza, żelatyna lub inne naturalnie występujące biodegradowalne materiały lub syntetyczne materiały, w tym przykładowo rozmaite polihydroksyalkany. Dowolne z tych materiałów mogą być utkane w siatkę, przykładowo, w celu formowania trójwymiarowego szkieletu lub rusztowania. Pory lub przestrzenie w matrycy mogą być dobrane przez biegłego w sztuce, aby pozwalać na migrację lub zapobiegać migracji komórek do materiału matrycy lub przez materiał matrycy. Trójwymiarowa matryca, hydrożel oraz tym podobne, mogą być kształtowane do postaci odpowiedniej dla tkanki, która będzie zastępowana lub naprawiana. Przykładowo, gdy pożądany jest przeszczep naczyniowy, trójwymiarowy szkielet może być ukształtowany jako rurkowa struktura oraz zaszczepiony śródbłonkowymi komórkami macierzystymi według wynalazku, samymi lub w kombinacji z komórkami zrębowymi (jak przykładowo fibroblasty), które następnie są hodowane w odpowiednich warunkach. Przykładowo, poza komórkami według wynalazku, do trójwymiarowego szkieletu mogą być dodane inne komórki w tym celu, aby polepszyć ich wzrost lub zmieniać jedną lub więcej niż jedną z charakterystyk nowej śródbłonkowej tkanki formowanej na nim. Komórki takie mogą obejmować, lecz nie wyłącznie: między innymi fibroblasty, perycyty, makrofagi, monocyty, komórki plazmy, komórki tuczne oraz adipocyty. W jeszcze innym wykonaniu, komórki macierzyste według wynalazku mogą być stosowane w połączeniu z trójwymiarowym systemem hodowli w "bioreaktorze", by wytwarzać śródbłonkowe konstrukty tkankowe, które posiadają krytyczne biochemiczne, fizyczne i strukturalne właściwości natywnej, ludzkiej tkanki śródbłonkowej, na drodze hodowli komórek i uzyskanej tkanki w takich warunkach środowiska, jakie są typowo doświadczane przez natywną, śródbłonkową tkankę. A więc,

14 14 PL B1 trójwymiarowy system hodowli może być utrzymywany w warunkach nadciśnienia stosowanych z przerwami oraz okresowo, a komórkom według wynalazku zapewnia się właściwe zaopatrzenie w czynniki odżywcze przez konwekcję. Utrzymywanie odpowiednich dostaw substancji odżywczych do komórek według wynalazku w całym konstrukcie wymienianej tkanki śródbłonkowej o grubości około 2-5 mm jest doniosłe w miarę jak pozorna gęstość konstruktu wzrasta. Ciśnienie ułatwia przepływ płynu przez trójwymiarowy śródbłonkowy konstrukt, co polepsza dostarczanie odżywek oraz usuwanie odpadów z komórek osadzonych w konstrukcie. Bioreaktor może obejmować wiele wzorów. Typowo, warunki hodowli będą obejmowały wywieranie na konstrukt zawierający komórki stresu fizjologicznego podobnego do warunków, jakie wystąpią in vivo. Przykładowo, konstrukt naczyniowy może być hodowany w warunkach, które symulują ciśnienie oraz siły ścinające obserwowane w naczyniach krwionośnych (patrz, przykładowo, patent nr US 6,121,042, który jest tu włączony jako odnośnik literaturowy). Komórki macierzyste, ich komórki potomne oraz tkanka śródbłonkowa według obecnego wynalazku mogą być stosowane w różnorodnych zastosowaniach. Obejmują one, lecz nie wyłącznie, transplantację lub implantację komórek w postaci nieprzyłączonej lub przyłączonej, przykładowo, do trójwymiarowego szkieletu, jaki tu opisano. Ponadto, iniekcja zewnątrzkomórkowej matrycy wytworzona z nowej, śródbłonkowej tkanki wytworzonej przez komórki według wynalazku może być podawana osobnikowi lub może być wykorzystana do dalszej hodowli komórek. Takie komórki, tkanki oraz zewnątrzkomórkowa matryca mogą służyć do naprawiania, zamiany lub zwiększenia tkanki śródbłonkowej, uszkodzonej w następstwie choroby lub urazu, lub której normalny rozwój nie nastąpił, lub też w celach kosmetycznych. Tkanka śródbłonkowa wytworzona według wynalazku, może być stosowana do naprawiania lub zamiany uszkodzonej lub zniszczonej tkanki śródbłonkowej, do zwiększenia istniejącej tkanki śródbłonkowej, do wprowadzenia nowej lub zamienionej tkanki, do modyfikacji sztucznych protez albo do połączenia biologicznych tkanek lub struktur. Przykładowo, lecz nie wyłącznie, szczególne przykłady wykonania wynalazku mogłyby obejmować zastępczą zastawkę sercową wytworzoną ze śródbłonkowych komórek macierzystych według wynalazku lub ich komórek potomnych oraz tkankę naczyniową lub przeszczep. W innym wykonaniu, komórki według wynalazku są podawane w kombinacji z czynnikami angiogenicznymi, by indukować lub promować formowanie nowych naczyń (krwionośnych) lub naczyń włoskowatych u osobnika. Komórki według wynalazku mogą być podawane przed, jednocześnie lub po iniekcji czynnika angiogenicznego. Ponadto, komórki według wynalazku mogą być podawane w bezpośrednim sąsiedztwie, w to samo miejsce lub z dala od miejsca podawania czynnika angiogenicznego. Przez czynnik angiogeniczny należy rozumieć czynnik wzrostu, proteinę lub środek, który promuje lub indukuje angiogenezę u osobnika. Ponadto, komórki lub tkanka śródbłonkowa według wynalazku mogą być stosowane, przykładowo, do skriningu in vitro pod kątem skuteczności i/lub cytotoksyczności związków, alergenów, czynników wzrostowych/regulatorowych, związków farmaceutycznych oraz tym podobnych, w stosunku do śródbłonkowych komórek macierzystych, w celu wyjaśnienia mechanizmu pewnych chorób poprzez określenie zmian w aktywności biologicznej śródbłonkowych komórek macierzystych (przykładowo, zdolności do proliferacji, adhezji), w celu badania mechanizmu, dzięki któremu leki i/lub czynniki wzrostu oddziałują na modulowanie aktywności biologicznej śródbłonkowych komórek macierzystych, w celu diagnozowania oraz monitorowania raka u pacjenta, dla terapii genowej, dostarczania genu lub dostarczania proteiny, a także w celu wytwarzania produktów aktywnych biologicznie. Obecne śródbłonkowe komórki macierzyste mogą być również stosowane przy izolowaniu i ocenie czynników związanych z różnicowaniem oraz dojrzewaniem śródbłonkowych komórek macierzystych. Tak więc, komórki macierzyste mogą być stosowane w próbach określających aktywność pożywki, przykładowo pożywki kondycjonowanej, przy ocenie płynów do prowadzenia wzrostu komórek, zaangażowania w tryb ukierunkowania określonej linii rozwoju i dojrzewania lub w tym podobnych. Różne systemy dają się zastosować i mogą być projektowane pod kątem indukowania różnicowania komórek macierzystych w oparciu o różne stresy fizjologiczne. Przykładowo, systemy bioreaktorów, które mogą być zastosowane do komórek według obecnego wynalazku, obejmują bioreaktory symulujące tkankę naczyniową. Obecne śródbłonkowe komórki macierzyste, ich komórki potomne (przykładowo, zróżnicowane komórki śródbłonkowe i/lub podobne do śródbłonkowych) oraz pochodzące od nich śródbłonkowe tkanki według wynalazku mogą być stosowane in vitro do skriningu szerokiego wachlarza środków pod kątem skuteczności oraz cytotoksyczności środków farmaceutycznych, czynników wzrostowych/regulatorowych, środków przeciwzapalnych oraz tym podobnych. W tym celu, hodowle komór-

15 PL B1 15 kowe lub tkankowe według wynalazku mogą być podtrzymywane in vitro oraz eksponowane na działanie badanego środka. Aktywność środka cytotoksycznego może być mierzona jego zdolnością do uszkadzania lub zabijania śródbłonkowych komórek macierzystych lub ich komórek potomnych w hodowli. Może być to łatwe do oszacowania technikami z wybarwianiem. Wpływ czynników wzrostowych/regulatorowych może być oszacowany przez analizę ilości żyjących komórek in vitro, przykładowo, przez zliczenie całkowitej ilości komórek oraz różnicowe zliczenie komórek. Może to być wykonane przy zastosowaniu standardowych technik cytologicznych i/lub histologicznych, włączając stosowanie technik immunocytochemicznych wykorzystujących przeciwciała, które definiują komórkowe antygeny specyficzne ze względu na rodzaj. Wpływ różnych leków na komórki według wynalazku może być oszacowany w hodowli w zawiesinie lub w systemie trójwymiarowym. Śródbłonkowe komórki macierzyste, ich komórki potomne oraz śródbłonkowe tkanki z nich pochodzące według obecnego wynalazku, mogą stanowić nośnik dla wprowadzania genów oraz produktów genowych in vivo by wspierać lub poprawiać rezultaty implantacji i/lub do stosowania w terapiach genowych. Śródbłonkowe komórki macierzyste, które eksprymują produkty genowe będące obiektem zainteresowania lub śródbłonkowa tkanka wytwarzana z nich in vitro, mogą być implantowane pacjentowi, który w przeciwnym wypadku miałby niedobór tego produktu genowego. Przykładowo geny, które eksprymują produkty zdolne do zapobiegania lub łagodzenia symptomów różnych rodzajów chorób lub zaburzeń naczyniowych, bądź które zapobiegają lub promują stany zapalne, są przedmiotem szczególnego zainteresowania. W jednym przykładzie wykonania, komórki według wynalazku poddaje się obróbce metodami inżynierii genetycznej, by eksprymowały przeciwzapalny produkt genowy, który mógłby służyć do redukcji ryzyka niepowodzenia implantacji lub dalszej degeneracyjnej zmianie w tkance śródbłonkowej na skutek reakcji zapalnej. Przykładowo, śródbłonkowa komórka macierzysta według wynalazku może być poddana obróbce metodami inżynierii genetycznej by eksprymować jeden lub więcej niż jeden spośród przeciwzapalnych produktów genowych, obejmujących - przykładowo, peptydy lub polipeptydy odpowiadające idiotypom przeciwciał, które neutralizują czynnik stymulacji kolonii granulocyt-makrofag (GM-CSF), TNF, IL-1, IL-2 lub inne zapalne cytokiny. Wykazano, że IL-1 obniża syntezę proteoglikanów oraz kolagenów typu II, IX oraz XI (Tyler i wsp., 1985, Biochem. J. 227:69-878; Tyler i wsp., 1988, Coll. Relat. Res. 82: ; Goldring i wsp., 1988, J. Clin. Invest. 82: oraz Lefebvre i wsp., 1990, Biophys. Acta. 1052:366-72). TNF również inhibituje syntezę proteoglikanów oraz kolagenu typu II, chociaż jest znacznie słabszy niż IL-1 (Yaron, I., i wsp., 1989, Arthritis Rheum. 32:173-80; Ikebe, T., i wsp., 1988, J. Immunol. 140: oraz Saklatvala, J., 1986, Nature 322:547-49). Również, przykładowo, komórki według wynalazku mogą być poddane obróbce metodami inżynierii genetycznej by eksprymować gen kodujący ludzką komplementarną proteinę regulatorową, która zapobiega odrzuceniu przeszczepu przez gospodarza. Patrz, przykładowo, McCurry i wsp., 1995, Nature Medicine 1: W innym wykonaniu, obecne śródbłonkowe komórki macierzyste mogą być poddane obróbce metodami inżynierii genetycznej tak by zawierały gen lub sekwencję polinukleotydową, która eksprymuje lub powoduje, że następuje ekspresja czynnika angiogenicznego. Genetycznie zmienione komórki macierzyste są użyteczne w wytwarzaniu zarówno nie-terapeutycznych, jak i terapeutycznych protein rekombinacyjnych in vivo oraz in vitro. Obecne śródbłonkowe komórki macierzyste są izolowane od dawcy (ludzkiego lub nie-ludzkiego) jak opisano powyżej, transfekowane lub transformowane rekombinacyjnym polinukleotydem in vitro lub ex vivo i transplantowane do odbiorcy lub hodowane in vitro. Obecne genetycznie zmienione śródbłonkowe komórki macierzyste lub ich potomstwo wytwarzają pożądaną rekombinacyjną proteinę in vivo lub in vitro. Wytworzona proteina lub związek (cząsteczka) może wywoływać bezpośredni lub pośredni efekt terapeutyczny lub wytwarzać diagnostyczną proteinę lub cząsteczkę. Alternatywnie, śródbłonkowe komórki macierzyste lub ich potomstwo według wynalazku mogą być poddane obróbce metodami inżynierii genetycznej by eksprymować oraz wytwarzać czynniki wzrostu, takie jak VEGF, FGF, EGF, IGF, jak również - środki terapeutyczne, takie jak TWEAK, TWE- AKR, TNFR, inne środki przeciwzapalne lub środki angiogeniczne. Przykładowo, gen lub sekwencja kodująca takie czynniki wzrostu lub środki terapeutyczne mogłyby pozostawać w operacyjnym związku z regulowanym promotorem tak, by wytwarzanie czynnika wzrostu lub środka w hodowli mogło być kontrolowane. Komórki według wynalazku mogą być poddane obróbce metodami inżynierii genetycznej by wytwarzać inne rekombinacyjne produkty o dobroczynnym wpływie na transplantację takie, jak czynniki przeciwzapalne, przykładowo, anty-gm-csf, anty-tnf, anty-il-1, anty-il-2 oraz tym podob-

16 16 PL B1 ne. Alternatywnie, komórki mogą być poddane obróbce metodami inżynierii genetycznej by powodować "knock out" ekspresji natywnych produktów genowych, które promują stan zapalny, przykładowo, GM-CSF, TNF, IL-1, IL-2, lub powodować "knock out" ekspresji MHC w celu obniżenia ryzyka odrzucenia. Ponadto, komórki mogą być poddane obróbce metodami inżynierii genetycznej z przeznaczeniem do stosowania w terapii genowej, by dostosować poziom aktywności genowej u pacjenta aby wspomagać lub poprawić wyniki transplantacji śródbłonka. Komórki poddane obróbce metodami inżynierii genetycznej mogą być przesiewane w celu selekcji tych linii komórkowych, które powodują łagodzenie symptomów choroby reumatycznej lub reakcji zapalnych in vivo i/lub pozwalają uniknąć immunologicznego nadzoru i odrzucenia. Konwencjonalne rekombinacyjne techniki DNA są stosowane do wstawiania pożądanego polinukleotydu do obecnych komórek macierzystych lub ich potomstwa. Precyzyjny sposób stosowany do wprowadzenia polinukleotydu (przykładowo, genu zamieniającego) nie ma krytycznego znaczenia dla obecnego wynalazku. Przykładowo, fizyczne sposoby wstawiania polinukleotydów do komórek obejmują mikroiniekcję oraz elektroporezę. Chemiczne sposoby, takie jak współstrącanie z fosforanem wapnia oraz wstawianie polinukleotydów do lipozomów są również standardowymi metodami wstawiania polinukleotydów do ssaczych komórek. Przykładowo, DNA lub RNA mogą być wstawione przy użyciu standardowych wektorów, takich jak te pochodzące z mysich i ptasich retrowirusów (patrz, przykładowo, Gluzman i wsp., 1988, Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.). Standardowe metody rekombinacyjnej biologii molekularnej są dobrze znane (patrz, przykładowo, Ausubel i wsp., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York), a wirusowe wektory dla terapii genowej opracowano i z powodzeniem stosowano klinicznie (Rosenberg, i wsp., 1990, N. Engl. J. Med, 323:370). Inne sposoby, takie jak wchłanianie nieosłoniętego polinukleotydu z matrycy powleczonej DNA są również objęte obecnym wynalazkiem (patrz, przykładowo, patent nr US 5,962,427, który jest tu włączony jako odnośnik literaturowy). Przykłady protein, polinukleotydów lub związków, które mogą być wytwarzane przez rekombinacyjne komórki macierzyste według wynalazku obejmują GMCSF, IGF, EGF, VEGF, FGF oraz tym podobne. W dalszym przykładzie wykonania, śródbłonkowe komórki macierzyste według wynalazku mogą być hodowane in vitro w celu wytwarzania produktów biologicznych z dużą wydajnością. Przykładowo, takie komórki, które w naturalny sposób wytwarzają szczególny biologiczny produkt będący przedmiotem zainteresowania (przykładowo, czynnik wzrostu, czynnik regulatorowy lub hormon peptydowy i tym podobne) lub były poddane obróbce metodami inżynierii genetycznej w celu wytwarzania produktu biologicznego, mogą być namnażane przez klonowanie. Jeżeli komórki wydzielają produkt biologiczny do odżywczej pożywki, produkt może być łatwo wyizolowany z wyczerpanej lub kondycjonowanej pożywki przy użyciu standardowych technik wydzielania, przykładowo, takich jak różnicowe strącanie protein, chromatografia jonowymienna, chromatografia filtracyjna na żelu, elektroforeza oraz HPLC, żeby wymienić jedynie kilka. Alternatywnie, produkt biologiczny będący przedmiotem zainteresowania może pozostawać w obrębie komórki, a zatem jego zebranie może wymagać poddania komórek lizie. Wówczas ów produkt biologiczny może następnie być oczyszczony przy użyciu dowolnej, jednej lub więcej niż jednej z wyżej wymienionych technik. Terapeutyczne zastosowania komórek macierzystych według wynalazku obejmują transplantowanie komórek macierzystych, populacji komórek macierzystych lub ich komórek potomnych do osobników, w celu leczenia różnych patologicznych stanów, w tym chorób i zaburzeń będących następstwem uszkodzenia mięśnia sercowego, zaburzeń czy chorób krążeniowych lub naczyniowych, jak również regenerację i naprawę tkanek. Komórki macierzyste lub populacje komórek macierzystych (włączając w to genetycznie zmienione komórki macierzyste) wprowadzane są do organizmu osobnika potrzebującego takich komórek macierzystych lub potrzebującego proteiny lub związku kodowanego lub wytwarzanego przez genetycznie zamienioną komórkę. Przykładowo, w pewnym wykonaniu, komórki macierzyste mogą być podawane pacjentowi choremu na raka, który przebył chemoterapię, która zabiła, zredukowała lub uszkodziła śródbłonkowe komórki macierzyste, komórki śródbłonkowe lub śródbłonek osobnika. Jeżeli komórki macierzyste pochodzą ze źródła heterologicznego względem podmiotu będącego ich odbiorcą, typowo jest stosowana towarzysząca terapia immunosupresyjna, w której przykładowo podaje się cyklosporynę lub FK506 jako środek immunosupresyjny. Jednakże w związku z niedojrzałym stanem komórek macierzystych według wynalazku, taka terapia immunosupresyjna może nie być wymagana. W związku z tym, w pewnym wykonaniu, komórki macierzyste według wynalazku mogą być podawane odbiorcy pod nieobecność terapii immunomodulatorowej (przykładowo, im-

17 PL B1 17 munsupresyjnej). Alternatywnie, komórki mogą być zakapsułkowane w błonie, która pozwala na wymianę płynów, lecz zapobiega kontaktowi komórka/komórka. Transplantacja komórek w formie mikrokapsułek jest znana w stanie techniki, przykładowo, Balladur i wsp., 1995, Surgery 117:189-94, 1995 oraz Dixit i wsp., 1992, Cell Transplantation 1: Komórki mogą być bezpośrednio wprowadzone do krwi obwodowej lub zdeponowane w obrębie innych lokalizacji w organizmie, przykładowo, w śledzionie, w trzustce lub na perełkach mikronośnika w otrzewnej. Przykładowo, od 10 2 do 10 9 komórek może być transplantowanych jednorazowo, a jeżeli jest to wymagane mogą być przeprowadzone dodatkowe transplantacje. Różnicowanie komórek macierzystych może być indukowane ex vivo lub alternatywnie, może być indukowane in vivo poprzez kontakt z tkanką (przykładowo, przez kontakt ze śródbłonkowymi komórkami lub komponentami matrycy komórkowej), opcjonalnie, środek różnicujący może być współ- -podawany lub podawany następczo osobnikowi, by promować różnicowanie komórek macierzystych. Jeżeli nie zdefiniowano inaczej, wszystkie terminy techniczne i naukowe tutaj stosowane posiadają takie samo znaczenie, jak powszechne przyjęte przez osoby posiadające zwykłe umiejętności z dziedziny, do której należy obecny wynalazek. Wszystkie tytuły oraz podtytuły tutaj występujące są stosowane wyłącznie dla ułatwienia czytania i nie powinny być interpretowane jako ograniczenie zakresu wynalazku. Rozumie się, że wszelkie przypadki użycia liczby pojedynczej [partykuł "a", "an" oraz "the" w oryginale angielskim] obejmują również liczbę mnogą, jeżeli tylko ich kontekst nie wskazuje wyraźnie na liczbę pojedynczą. Chociaż sposoby i materiały podobne lub równoważne tu opisanym mogą być stosowane w praktyce wynalazku lub przy testowaniu wynalazku, odpowiednie sposoby oraz materiały opisano poniżej. Wszystkie publikacje, zgłoszenia patentowe, patenty oraz inne odnośniki literaturowe tu wymienione są włączone w całości jako odnośniki literaturowe. W razie konfliktu, niniejszy opis wraz z definicjami ma charakter nadrzędny. Ponadto, materiały, sposoby oraz przykłady są jedynie ilustracją, nie mają na celu ograniczenia zakresu wynalazku. Następujące przykłady zamieszczono dla ilustracji szczególnych przykładów realizacji, nie zaś w celu ograniczenia zakresu wynalazku. P r z y k ł a d y P r z y k ł a d 1. Wyodrębnianie śródbłonkowej komórki macierzystej Objętość 200 cm 3 sodowo heparynizowanej ludzkiej krwi rozfrakcjonowano przez odwirowanie na FICOLL (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) o ciężarze właściwym 1,077 w celu wyizolowania PBMC. Wyizolowane komórki PBMC, obecne w "kożuszku" przeprowadzono ponownie w zawiesinę o stężeniu około i w nie większym niż 100x10 6 komórek/ml w kompletnej pożywce (EGM2 zawierającej IGF, FGF, EGF oraz VEGF + 15% FCS; Cambrex Bioscience, Inc., Baltimore, MD). Dziesięć μg/ml mysich przeciwciał anty-p1h12 (Chemicon MAB16985) dodano do tych komórek i inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Komórki przemyto dwukrotnie kompletną pożywką lub solanką buforowaną fosforanami (PBS) i przeprowadzono ponownie w zawiesinę o stężeniu około - lecz nie większym niż 100x10 6 komórek w 1 ml PBS. Dwadzieścia μl wypełnienia magnetycznego anty-muigg-macs (numer katalogowy , Miltenyi Biotec, Auburn, CA) dodano do 20 μl zawierających około 10 x 10 6 komórek aby oznakować komórki przeciwciałem i inkubowano komórki w temperaturze 4 C przez 15 minut. Komórki znakowane przeciwciałem przemyto jeden raz w PBS + 3% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i przeprowadzono w zawiesinę o końcowej objętości 5 ml PBS + 3% BSA. Komórki znakowane przeciwciałem przepuszczono następnie przez wstępnie przygotowaną kolumnę MACS LS umieszczoną w magnetycznym separatorze VARIOMAC TM (Miltenyi Biotec). Zebrano frakcję wypływającą z kolumny i odrzucono, a kolumnę przemyto trzykrotnie PBS + 3% BSA. Znakowane komórki usunięto z kolumny przemywając kolumnę pod nieobecność pola magnetycznego. Wymytą frakcję przemyto i zliczono. Pozytywną frakcję komórek hodowano w kompletnej pożywce w stężeniu około - lecz typowo nie wyższym niż, 1-5x10 6 komórek na wgłębienie stosując płytkę o 6 wgłębieniach pokrytą kolagenem IV (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Po 48 godzinach, nieprzyczepione komórki usunięto. Pożywka ulegała połowicznemu wyczerpaniu dwa razy na tydzień. P r z y k ł a d 2. Badanie właściwości śródbłonkowych komórek macierzystych Komórki scharakteryzowano metodą FACS w momencie wyodrębnienia oraz w różnych punktach czasowych wskazanych w poniższych Tablicach. W momencie wyodrębnienia, komórki eksprymowały antygen P1H12, CD148 oraz AC133 na stosunkowo wysokich poziomach. Komórki były negatywne względem CD202b oraz CD144. W niektó-

18 18 PL B1 rych izolatach subpopulacja komórek CD45 + eksprymowała również CD34 +. Ilość tych podwójnie pozytywnych komórek CD45 + /CD34 + wyrażona jako procent ogólnej ilości komórek była zmienna i w niektórych przypadkach wynosiła 100%. W Tablicy 1 przedstawiono zmierzone markery obecne na komórkach w momencie wyodrębnienia. Jako kontrolę do cytometrii przepływowej zastosowano mysią IgG1; dane dla kontroli przedstawiono w Tablicy 1. T a b l i c a 1. Analiza przeprowadzona metodą cytometrii przepływowej oraz fenotyp komórek po wzbogaceniu względem komórek P1H12+ Powierzchniowe markery Dzień próby dawca 46 dawca 526 dawca 55 dawca 374 dawka 119b dawca 301 dawca 512 dawca 143 dawca 546 d0 d0 d0 d0 d0 d0 d0 d0 d0 kontrola 3,6 6,93 8,54 7,96 3,97 2,32 3,27 2,3 3,05 P1H12 23,43 50,2 53,99 31,71 44,81 88,18 20,58 28,77 17,97 CD148 NW 76,17 93,08 37,23 88,76 51,99 NW NW NW CD144 NW 20,34 36,35 3,5 18,06 2,4 4,43 3,9 1,78 AC133 NW 89,79 96,01 73,01 92,23 95,44 33, CD45 98,56 98,61 93,02 95,16 99, ,08 96,3 96,3 CD34 NW 0,86 1,51 4,72 NW 50,02 1,4 96,3 1,96 CD202b NW 7,65 12,23 0,16 7,26 0,87 3,31 0,56 0,59 CD45/CD34 podwójnie pozytywne NW 0,86 1,51 4,72? 99,24 50,02 1,4 96,3 1,96 avegfr2 NW NW NW NW NW NW 9,63 1,6 0,79 P1H12/AC133 podwójnie pozytywne CD34/AC133 podwójnie pozytywne NW - niewykrywalny NW NW NW NW NW NW 16,42 54,25 28,49 NW NW NW NW NW NW 8,92 30,06 47,96 Podczas hodowli wygląd śródbłonkowych komórek macierzystych uległ zmianie i zmieniły się a markery obecne na komórkach, jak to przedstawiono w Tablicy 2. T a b l i c a 2. Podsumowanie zmian w czasie markerów powierzchniowych dla pojedynczego dawcy w czasie tuż przed przeniesieniem tuż przed przeniesieniem Przejście 5 Przejście 7 Przejście DAWCA #46 wyjściowe wyodrębnienie Dzień 14 Dzień 22 Dzień 35 Dzień 45 Dzień 59 kontrola 3,6 6,9 9,31 6,26 9,93 5,27 P1H12 23,43 33,28 97,85 75,06 99,27 91,44 CD148 NW 97,53 51,31 87,74 92,66 91,93 CD144 NW 8,48 98,96 83,88 66,85 89,05 AC133 NW NW 20,15 8,56 31,56 NW CD45 98,56 16,45 2,8 0,56 0,45 0,25

19 PL B1 19 cd. tablicy CD34 NW 0 70,44 3,56 2,14 16,06 CD202b NW 2,07 97,25 95,07 88,44 94,09 CD45/CD34 podwójnie pozytywny NW - niewykrywalny NW 83,5 7,77 1,44 0,54 2,28 P r z y k ł a d 3. Powierzchniowa migracja komórek śródbłonkowych pochodzących od komórek macierzystych z ludzkiej krwi obwodowej w odpowiedzi na bodziec oraz wpływ inhibitorów migracji Zastosowano próbę na powierzchniową migrację komórek śródbłonkowych (na zamykanie rany) do ilościowego oznaczenia migracji komórek śródbłonkowych pochodzących od komórek macierzystych z ludzkiej krwi obwodowej w odpowiedzi na PMA, EGF oraz inne bodźce migracyjne. W tej próbie, migrację komórek śródbłonkowych mierzono jako szybkość zamykania okrągłej rany w hodowanej monowarstwie komórek. Szybkość zamknięcia rany jest liniowa w przypadku nerkowych oraz skórnych mikronaczyniowych komórek śródbłonkowych i jest dynamicznie regulowana przez środki, które stymulują oraz inhibitują angiogenezę in vivo. Zarówno nerkowe mikronaczyniowe komórki śródbłonkowe, jak i skórne mikronaczyniowe komórki migrują w odpowiedzi na PMA oraz EGF, a migracja ta może być regulowana poprzez dodanie antyangiogenicznych środków do hodowli testującej migrację (Wiley i wsp., 2001, Immunity 15: ). Wyodrębniono komórki macierzyste z ludzkiej krwi obwodowej tak jak to tu opisano, po czym wyodrębniono i prowadzono hodowlę ich komórek potomnych - pierwotnych komórek śródbłonkowych pochodzących z ludzkiej krwi obwodowej, hpbec, oraz stosowano między przejściami 6-11, jak tutaj opisano. Powtarzalne okrągłe uszkodzenia, "rany" (o średnicy mikronów), wytworzono w konfluentnych monowarstwach hpbec hodowanych przez noc przy niedoborze surowicy (DMEM + 0,5% FES), w stężeniu około komórek/wgłębienie stosując punktak o końcu pokrytym silikonem. W momencie kaleczenia pożywkę (DMEM + 0,1% FES) wzbogacono 5 ng/ml PMA (12-myrystynian-13-octan forbolu), 40 ng/ml EGF lub kombinacją 5 ng/ml PMA lub EGF i inhibitorów migracji. Resztkowy obszar rany mierzono w funkcji czasu (0-14 godzin) przy użyciu mikroskopu oraz programu analizującego obraz (Bioquant; Nashville, TN). Względną szybkość migracji obliczono dla każdego środka i kombinacji środków jako liniową regresję resztkowego obszaru rany w czasie. Wyniki przedstawiono na rysunkach Fig Komórki hpbec dobrze migrowały w odpowiedzi na PMA (>=50%) (Fig. 1) oraz wolniej w odpowiedzi na EGF (>=35%) (Fig. 2). Dodanie anty-angiogenicznych środków hutek Fc (WO 00/75323), TweakR.Fc (WO 01/45730), nektyny-3α-fc (E7L4.Fc) (WO 02/28902) oraz CD148 mab w podanych stężeniach hamowało migrację hpbec indukowaną przez PMA, odpowiednio w 40%, 40%, 70% oraz 100% w porównaniu z proteiną kontrolną huigg (Fig. 1). Dodanie antyangiogenicznych środków: hutek Fc, TweakR.Fc, nektyny-3α-fc (B7L4.Fc) oraz anty-cd148 mab we wskazanych stężeniach inhibitowało migrację hpbec indukowaną przez EGF, odpowiednio w 50%, 100%, 95% oraz 100% w porównaniu z proteiną kontrolną huigg (Fig. 2). P r z y k ł a d 4. Próba na migrację przez barierę Śródbłonkowe komórki macierzyste hodowano przez noc (18 godzin) w pożywce (przykładowo, pożywka EGM-2, Clonetics, Walkersville, MD) oraz w obecności lub pod nieobecność PMA (50 ng/ml), po czym komórki przemyto i znakowano w PBS zawierającej 4 μm barwnika kalceinowego w ciągu dwóch godzin. Po znakowaniu kalceiną komórki wzbudzono do fluorescencji poprzez wzbudzanie przy 488 nm. Komórki przemyto w PBS, ponownie rozproszono w podstawowej pożywce (EBM +/-0,1% FBS) oraz umieszczono w hodowli we wkładkach fluoroblokowych z porami o wymiarach 3 mikrony do płytek o 24 wgłębieniach. Pięćdziesiąt tysięcy komórek macierzystych zawierających zróżnicowane śródbłonkowe komórki potomne hodowano w 300 mikrolitrach podstawowej pożywki we wkładce fluoroblokowej, a wkładki zawierające te komórki umieszczono na sterylnych płytkach do hodowli o 24 wgłębieniach, zawierających 1 ml pożywki z cytokinami i/lub surowicą posiadającej zdolność spowodowania migracji lub ruchu (haptotaksa) komórek według wynalazku przez ścięty 3 mikronowy filtr w formie wkładki do płytki o 24 wgłębieniach. Migrację komórek przez filtr wykrywano przez pomiary poziomu fluorescencyjnej emisji obserwowanej przez 530 nm w dolnym wgłębieniu przy użyciu licznika wieloznacznikowego. Wyniki migracji były podobne do wyników badań w próbie na migrację po powierzchni z przykładu 3, powyżej.

20 20 PL B1 P r z y k ł a d 5. Próba z kapilarą na tworzenie strun Matrycę typu MATRIGEL TM (Becton Dickinson, Bedford, MA), solubilizowany podstawowy preparat membranowy wyekstrahowany z mysiego mięsaka Engel-bretha-Holma-Swarma (EHS), rozmrożono przez noc na lodzie w temperaturze 4 C. Płytkę o 24 wgłębieniach (BD Labware, Franklin Lakes, NJ) oraz czubki 1000 μl pipet chłodzono również przez noc w temperaturze 4 C. W dniu przeprowadzania próby, wgłębienia płytki równomiernie powleczono 300 μl MATRIGEL TM na wgłębienie, dbając aby nie wprowadzić pęcherzyków. Powleczone płytki inkubowano w temperaturze 37 C przez 30 minut, pozwalając matrycy na polimeryzację. Śródbłonkowe komórki macierzyste i/lub śródbłonkowe komórki potomne komórek macierzystych poddano trypsynizacji, przemyto w świeżej, kompletnej pożywce (jak to opisano w przykładzie 1) oraz zliczono. Trzydzieści tysięcy komórek na wgłębienie naniesiono na płytkę w 100 μl pożywki wzrostowej i inkubowano w temperaturze 37 C przez 30 minut. Dodano pięćset mikrolitrów świeżej pożywki wzrostowej. Przeprowadzono obserwację komórek po 4 oraz 5 godzinach po naniesieniu na płytkę. Kontrolne komórki identycznie traktowane, lecz bez naniesienia na MATRIGEL użyto do porównań. Po czterech godzinach komórki kontrolne wykazywały ogólną charakterystykę rozproszonego przylegania wyhodowanych komórek tkankowej hodowli na plastiku. Komórki wzrastane na MATRIGEL TM przez 4 godziny utworzyły liczne ogniska z komórkami łączącymi te ogniska wyglądających jak świetliste struny. Pojawienie się obfitych świetlistych struktur było wyraźne przy obserwacji po 24 godzinach w hodowli. P r z y k ł a d 6. Umiejscowienie in vivo podawanych komórek macierzystych oraz ich komórek potomnych Niniejszy przykład wykazuje, że komórki wyizolowane w sposób tu opisany migrują in vivo do obszarów wykazujących aktywność angiogeniczną i/lub naczyniogeniczną. Komórki śródbłonkowe pochodzące z ludzkiej krwi obwodowej od Dawcy 1017 (hpbec; rozmnożone ze śródbłonkowych komórek potomnych pochodzących z krwi tak jak to opisano w przykładzie 3) znakowano in vitro jednomikronowymi perełkami o zielono-żółtej fluorescencji (emisja przy 515 nm; Molecular Probes, Eugene, OR). Znakowanie komórek przeprowadzono poprzez inkubowanie 1017 hpbec od Dawcy 1017 (5x10 6 perełek na 1x10 6 komórek) przez 18 godzin. Przylegające komórki, które wchłonęły perełki, usunięto poprzez krótkotrwałą trypsynizację i przemyto raz w PBS w celu usunięcia nieprzyswojonych perełek i ponownie naniesiono na płytkę w pożywce wzrostu EC (jak to opisano w przykładzie 1) i pozwolono im na ponowne przylgnięcie. Znakowanie komórek potwierdzono mikroskopowo w odwróconym świetle oraz przez immunofluorescencję. W dniu iniekcji (patrz niżej), znakowane hpbec od Dawcy 1017 usunięto na drodze krótkotrwałej trypsynizacji i ponownie przeprowadzono w zawiesinę w PBS w celu dokonania doskórnej (i.d.) lub dożylnej (i.v.) iniekcji. Znakowane ludzkie mikronaczyniowe śródbłonkowe komórki skórne (hmvec-d) służyły jako kontrola, a 5 x 10 6 samych fluorescencyjnych perełek, jako takich - podanych doskórnie stanowiło kontrolę negatywną. Serca nowonarodzonych - młodszych niż 24 godziny, myszy BALB/c prze-transplantowano pod narkozą do małżowiny usznej (obustronnie) myszy BALB/c SCID (Jackson Labs, Bar Harbor, ME) płci żeńskiej w wieku 12 tygodni. Bezpośrednio po transplantacji, myszom podano w iniekcji do ucha, w odległości 4-5 mm od przeszczepionego serca albo znakowane komórki hpbec od Dawcy 1017 (1x10 6 komórek i.d. - doskórnie lub 2x10 6 komórek i.v. - dożylnie), same perełki fluorescencyjne (5x10 6 perełek i.d. - doskórnie) lub znakowane komórki hmvec-d (1x10 6 komórek). Bezpośrednio po doskórnym wstrzyknięciu, sporządzano obraz ucha uśpionej myszy przy zastosowaniu systemu mikroskopowego zawierającego odwrócony mikroskop z napędem wyposażony w obiektywy 4x oraz 10x oraz w kamerę CCD w celu wykrycie niskiego poziomu światła fluorescencyjnego, sterowanego przez program OPENLAB TM (Improvision, Inc., Lexington, MA), w celu potwierdzenia depozytu zielonych immunofluorescencyjnych komórek w miejscu iniekcji. Sporządzano obrazy izograftów wszczepionych w uszy każdej myszy w 24 godziny oraz 144 godziny po transplantacji/wstrzyknięciu komórek. Obserwowano, że depozyty zarówno żywych znakowanych hpbec (Dawca 1017) lub samych fluorescencyjnych perełek były bezpośrednio (1-2 godziny) po iniekcji ograniczone do miejsca iniekcji. W 24 godziny po iniekcji, zaobserwowano, że znakowane hpbec migrowały od miejsca wstrzyknięcia w kierunku ischemicznego serca. Po 144 godzinach po iniekcji, izografty serc pulsowały, a większa ilość znakowanych, podanych w doskórnej iniekcji hpbec, uległa migracji z miejsca iniekcji w kierun-