(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) (13) T3 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (13) T3 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (1) Int. Cl. C12N/071 (06.01) (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej Europejski Biuletyn Patentowy /04 EP B1 (4) Tytuł wynalazku: Sposób wytwarzania autologicznej hodowli endometrialnej do współhodowli endometrium/zarodek () Pierwszeństwo: FR (43) Zgłoszenie ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 07/31 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono:.06. Wiadomości Urzędu Patentowego 06/ (73) Uprawniony z patentu: Laboratoires Genevrier SA, Antibes, FR (72) Twórca (y) wynalazku: PL/EP T3 VACHER Dominique Domaine de la Peyrière, MOUGINS, FR CAZALS Florence, VALBONNE, FR SOLER Christophe, NICE, FR (74) Pełnomocnik: Polservice Kancelaria Rzeczników Patentowych Sp. z o.o. rzecz. pat. Kawczyńska Marta Warszawa skr. pocz. 33 Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 3 Opis 1 2 Niniejszy wynalazek należy do dziedziny zapłodnienia in vitro i dotyczy w szczególności sposobu wytwarzania układu hodowli autologicznego endometrium do współhodowli endometrium-zarodek. Zapłodnienie pozaustrojowe, czyli zapłodnienie in vitro (IVF) polega na odtworzeniu w laboratorium zjawisk zachodzących w sposób naturalny w jajowodach: zapłodnienia i pierwszych etapów rozwoju zarodka. Od 1978, roku narodzin Louise Brown, do dnia dzisiejszego, technika ta pozwoliła na urodzenie się setek tysięcy dzieci na całym świecie. Do oceny odsetka powodzenia technik IVF w piśmiennictwie stosuje się kilka parametrów. W odniesieniu do liczby punkcji, mających na celu pobranie oocytów, można biorąc pod uwagę: - punkcje dodatnie (ponad 9%); - transfery zarodków (około 80%); - liczbę ciąż stwierdzanych klinicznie (stan ciąży zdefiniowany przez obecność wewnątrzmacicznego pęcherzyka ciążowego i czynności serca); - liczbę porodów; - liczbę urodzonych dzieci żywych. Powodzenie techniki IVF najlepiej prawdopodobnie charakteryzuje liczba porodów, w wyniku których urodziło się przynajmniej jedno żywe, zdrowe dziecko, przy czym współczynnik ten jest rzędu 12-1%. Współczynnik ten w dużym stopniu zależy od wieku kobiety, od liczby cykli leczenia i liczby przeniesionych zarodków. Niepowodzenie zagnieżdżenia po IVF może mieć przyczynę leżącą po stronie matki lub zarodka. Niepowodze-

3 4 1 2 nie zagnieżdżenia wiązano, między innymi, ze zdolnością zarodków do osiągnięcia w hodowli stadium blastocysty, co z kolei zależy od warunków hodowli. Klasycznie, po zapłodnieniu in vitro, zarodek u- mieszcza się w swoistych, syntetycznych pożywkach hodowlanych, dobranych w zależności od dnia hodowli (od dnia 1 do dnia 6). Zarodek następnie umieszcza się ponownie w macicy pacjentki w dniu 2 lub 3, to znaczy w stadium 4 lub 8 komórek po hodowli w pożywce syntetycznej. Odsetek zagnieżdżenia zarodków w wieku od 2 do 3 dni pozostaje niewielki (rzędu 1% na zarodek). Ten niewielki odsetek zagnieżdżenia można częściowo tłumaczyć nadmierną aktywnością macicy i nieodpowiednim momentem przeniesienia: w istocie zarodki te umieszcza się w nieodpowiednim środowisku, ponieważ in vivo zarodki w tym stadium rozwoju pozostają jeszcze w jajowodach, a zarodek dociera do macicy dopiero w stadium blastocysty, to znaczy dni po zapłodnieniu. Techniki współhodowli (hodowli zarodka do stadium blastocysty na warstwie komórek służących jako podłoże odżywcze) zaproponowano po raz pierwszy u człowieka w roku 1989, po udowodnieniu w wielu, prowadzonych od roku 1962, badaniach na zwierzętach, że ta technika zwiększa odsetek zarodków dochodzących do stadium blastocysty. Poza synchronizacją endometrium-zarodek, możliwość hodowli zarodka do stadium blastocysty pozwala na selekcję zarodków o zwiększonej zdolności rozwoju i na wykonywanie diagnostyki preimplantacyjnej. Ponadto techniki współhodowli zarodków umożliwiają uzyskanie

4 1 2 blastocyst o jakości lepszej w porównaniu z blastocystami hodowanymi w pożywkach syntetycznych. Techniki współhodowli zarodka do stadium blastocysty na liniach komórek zwierzęcych, takich jak na przykład komórki Vero, pochodzące z nabłonka nerkowego zielonej małpy afrykańskiej, pozwoliły uzyskać wyniki lepsze niż w przypadku transferów wczesnych, w dniach 2-3, w pożywkach syntetycznych. Tych komórek zwierzęcych nie poddano jednak żadnym procedurom walidacji pod kątem bezpieczeństwa sanitarnego, zgodnie z obowiązującymi przepisami prawa, w celu zastosowania terapeutycznego. Rozporządzenie z dn , ustalające zasady dobrej praktyki w zakresie medycznego wspomagania rozrodu we Francji, precyzuje, że tylko współhodowla na komórkach autologicznych nie wiąże się z ryzykiem zakażenia egzogennego. Wobec zasady ostrożności laboratoria IVF zarzuciły w latach metodę współhodowli na rzecz pożywek syntetycznych. Pojawiły się wówczas nowe pożywki syntetyczne, zwane pożywkami sekwencyjnymi, umożliwiające hodowlę zarodka do stadium blastocysty. Żadna z tych pożywek nie pozwoliła jednak uzyskać efektu takiego, jak współhodowla. W istocie, badania porównawcze między blastocystami pochodzącymi z pożywek sekwencyjnych a blastocystami pochodzącymi ze współhodowli wykazują, że odsetek blastulacji jest większy we współhodowli (około 4% w stosunku do - 3%), niezależnie od współhodowli, i że uzyskane blastocysty są lepszej jakości (większa liczba blastomerów, wyższego stopnia i o mniejszym stopniu fragmentacji). Dodatni wpływ współhodowli na rozwój zarodka

5 6 1 2 jest związany z interakcjami zarodek-komórki, z przygotowaniem cytokin i(lub) czynników embriotroficznych i trofoblastycznych i z detoksykacją pożywki hodowlanej przez komórki somatyczne. Zastosowanie współhodowli autologicznych komórek somatycznych wydaje się wobec tego idealnym rozwiązaniem, umożliwiającym zwiększenie odsetka zagnieżdżania i zapobiegającym jednocześnie zanieczyszczeniu zarodka wirusami egzogennymi. Wśród ludzkich komórek somatycznych komórki endometrium zajmują miejsce szczególne. Są to w istocie komórki fizjologiczne zagnieżdżania, co przemawia za tym, że będą idealnym podłożem dla zarodka w trakcie współhodowli. Znane są układy hodowli autologicznego endometrium przeznaczone do wykorzystania do współhodowli endometrium-zarodek w czasie IVF, składające się z hodowli oczyszczonych komórek nabłonkowych. Ich zastosowanie pozostaje jednak ograniczone, gdyż hodowla komórek nabłonkowych gruczołów jest bardzo delikatna, czas jej życia ogranicza się do 2-4 dni, można na niej przeprowadzić zaledwie jeden pasaż hodowli i zawsze występuje w niewielkiej ilości. Zgłaszający stwierdził, i jest to jedna z zalet niniejszego wynalazku, że w czasie rozdzielania poszczególnych frakcji komórkowych z bioptatu endometrium można uzyskać, oprócz pierwszej frakcji endometrium, zwanej nabłonkową (zawierającej głównie gruczoły) i drugiej frakcji endometrium, zwanej zrębową (zawierającej głównie komórki zrębowe), trzecią frakcję endometrium, zwaną mieszaną, która prowadzi, po

6 7 1 2 rozdzieleniu i oczyszczeniu gruczołów i komórek zrębowych, które wchodzą w jej skład, i rozpoczęciu ich hodowli, do uzyskania dobrej jakości hodowli mieszanej (komórek nabłonkowych i zrębowych), nadającej się do zastosowania do współhodowli endometrium-zarodek w czasie IVF. Celem niniejszego wynalazku jest zatem zaproponowanie sposobu wytwarzania nowego układu hodowli autologicznego endometrium do współhodowli endometrium-zarodek w czasie IVF. W tym celu i według pierwszego aspektu, przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania układu hodowli autologicznego endometrium przeznaczonego do zastosowania we współhodowli endometrium-zarodek w czasie IVF, przy czym ten układ hodowli zawiera komórki nabłonkowe i komórki zrębowe, i przy czym sposób ten obejmuje etapy prowadzące do uzyskania pierwszej frakcji endometrium, zwanej nabłonkową, drugiej frakcji endometrium, zwanej zrębową i trzeciej frakcji endometrium, zwanej mieszaną, zawierającej mieszaninę gruczołów i komórek zrębowych, i obejmuje ponadto etap oczyszczania tej trzeciej frakcji. W jednej z odmian wykonania, etap oczyszczania trzeciej frakcji obejmuje: a) uzyskanie komórek zrębowych z trzeciej frakcji, b) uzyskanie gruczołów z trzeciej frakcji i c) zmieszanie tak uzyskanych komórek zrębowych i gruczołów. W jednej z odmian wykonania, etap a) uzyskiwania komórek zrębowych z trzeciej frakcji endometrium, zwanej mieszaną, obejmuje następujące operacje:

7 8 1 2 a1. wytworzenie zawiesiny z tej trzeciej frakcji endometrium w odpowiedniej pożywce hodowlanej, prowadzące do uzyskania pierwszej zawiesiny; a2. filtracja tej pierwszej zawiesiny, prowadząca do uzyskania pierwszego filtratu i pierwszej frakcji zatrzymanej na filtrze; a3. odwirowanie tego pierwszego filtratu, prowadzące do uzyskania pierwszego osadu, zawierającego komórki zrębowe z trzeciej frakcji endometrium; a4. wprowadzanie tego pierwszego osadu do pożywki IVF, prowadzące do uzyskania drugiej zawiesiny komórek zrębowych trzeciej frakcji endometrium. W jednej z odmian wykonania, etap b) uzyskiwania gruczołów z trzeciej frakcji endometrium, zwanej mieszaną, obejmuje filtrację tej pierwszej zatrzymanej frakcji i wytworzenie zawiesiny z tak uzyskanej zatrzymanej drugiej frakcji, prowadzące do uzyskania trzeciej zawiesiny, zawierającej gruczoły z trzeciej frakcji endometrium, w pożywce IVF. W jednej z odmian wykonania, etap c) składa się ze zmieszania wymienionych wyżej drugiej i trzeciej zawiesiny, celem uzyskania oczyszczonej trzeciej frakcji endometrium. Mieszaninę gruczołów i komórek zrębowych trzeciej frakcji endometrium, uzyskaną w etapie c), hoduje się następnie w pożywce IVF. Komórki utrzymuje się w hodowli przez kilka dni. W korzystnej odmianie wykonania, bioptat endometrium poddaje się kriokonserwacji tuż po pobraniu, po czym, mniej więcej w dniu rozpoczęcia jajeczkowania u pacjentki, bioptat rozmraża się i poddaje obróbce we-

8 9 1 2 dług opisanego sposobu, po czym zakłada się hodowlę gruczołów i komórek zrębowych oczyszczonej trzeciej frakcji endometrium. W innej odmianie wykonania bioptat endometrium traktuje się sposobem według wynalazku natychmiast po jego otrzymaniu przez laboratorium. Tak uzyskaną mieszaninę gruczołów i komórek zrębowych oczyszczonej trzeciej frakcji endometrium hoduje się przez kilka dni; tę hodowlę komórkową poddaje się kriokonserwacji i rozmraża się ją mniej więcej w dniu rozpoczęcia jajeczkowania u pacjentki. We wszystkich przypadkach, sposób wytwarzania układu hodowli autologicznego endometrium, przeznaczonego do zastosowania do współhodowli endometrium-zarodek w czasie IVF, może obejmować dodatkowy etap pakowania tego układu hodowli autologicznego endometrium z użyciem półstałej pożywki IVF, do zastosowania podczas transportu do laboratorium medycznego wspomagania rozrodu. Według drugiego aspektu wynalazek dotyczy układu hodowli autologicznego endometrium do zastosowania do współhodowli endometrium-zarodek w czasie IVF, przy czym układ ten obejmuje hodowlę komórek nabłonkowych i zrębowych z oczyszczonej trzeciej frakcji endometrium. Według trzeciego aspektu wynalazek dotyczy zastosowania opisanego układu hodowli autologicznego endometrium do wytwarzania współhodowli endometrium-zarodek w czasie IVF. Według czwartego aspektu wynalazek dotyczy gotowego do użycia układu hodowli autologicznego endo-

9 1 2 metrium, przeznaczonego do zastosowania do współhodowli endometrium-zarodek w czasie IVF, obejmującego: - hodowlę komórek nabłonkowych i zrębowych oczyszczonej trzeciej frakcji endometrium; - półstałą pożywkę hodowlaną IVF do tej hodowli; - jałowe opakowanie do układu hodowli, zawierające tę hodowlę i tę pożywkę hodowlaną. Poniżej wynalazek zostanie szczegółowo opisany. Przedmiotem niniejszego wynalazku, według pierwszego aspektu, jest sposób wytwarzania z bioptatu endometrium oczyszczonej, mieszanej frakcji endometrium, zawierającej komórki zrębowe i gruczoły. Bioptat pobiera się od pacjentki w fazie lutealnej cyklu miesiączkowego. Bioptat natychmiast umieszcza się w pożywce hodowlanej, przeznaczonej specjalnie do transportu, i u- trzymuje w temperaturze od 4 do 8 C przez cały czas trwania transportu. Transportu od miejsca pobrania do laboratorium prowadzącego hodowlę komórek należy dokonać jak najszybciej; na ogół bioptat dostarcza się do laboratorium następnego dnia po pobraniu. Endometrium składa się z tkanki zrębowej, zawierającej komórki mezenchymatyczne, zwane komórkami zrębowymi, i z gruczołów wydzielniczych, złożonych z komórek nabłonkowych, ze światłem w środku, skąd uwalniają się produkty wydzielania. Obróbka bioptatu według wynalazku obejmuje dwa etapy lizy bioptatu, po których następuje sekwencja e- tapów rozdzielania i oczyszczania dwóch typów komórek. Przez określenie liza bioptatu endometrium rozumie się rozpuszczenie struktury tkankowej endometrium, prowadzące do uzyskania komórek (takich jak komórki zrę-

10 bowe) lub izolowanych mas komórek (takich jak gruczoły wydzielnicze). Lizę bioptatu można wykonać przez trawienie enzymatyczne, na przykład z użyciem kolagenazy. W innym sposobie wykonania bioptat można poddawać lizie środkami mechanicznymi. Zasada oczyszczania gruczołów i komórek zrębowych opiera się na różnicy wielkości i masy między komórkami zrębowymi, małymi i lekkimi w stosunku do gruczołów, które są większe i cięższe. Po otrzymaniu bioptat płucze się i przeprowadza się kontrolę mikrobiologiczną pożywki transportowej. Następnie tnie się go na małe fragmenty i usuwa się elementy zanieczyszczające endometrium (śluz, krew itd.). Następnie poddaje się go kriokonserwacji lub natychmiastowej obróbce celem izolowania poszczególnych frakcji komórek. Fragmenty bioptatu poddaje się pierwszej lizie. W jednej z odmian wykonania bioptat trawi się enzymem, takim jak kolagenaza. Lizat homogenizuje się i następnie filtruje, co prowadzi do uzyskania filtratu F1 i osadu D1 (fr. Depot), bogatego w gruczoły (odpowiadającego pierwszej frakcji endometrium). Ten filtrat F1 odwirowuje się przez około min przy około 400g, co pozwala na uzyskanie osadu C1 (fr. Culot). Etap lizy powtarza się co najmniej jeden raz w następujący sposób: osad D1 bogaty w gruczoły wprowadza się do odpowiedniej pożywki, celem uzyskania zawiesiny

11 S1, zawierającej, oprócz gruczołów, niestrawione jeszcze fragmenty endometrium. Przez odpowiednią pożywkę rozumie się każdy roztwór, zapewniający żywotność i optymalne funkcjonowanie danej populacji komórek. Zawiesinę S1 poddaje się drugiej lizie, co prowadzi do uzyskania drugiego lizatu, który homogenizuje się i następnie filtruje, prowadząc do uzyskania filtratu F2 i osadu D2 bogatego w gruczoły. Jeżeli bioptat endometrium jest bardzo zbity, konieczna może okazać się trzecia liza osadu D2. Filtrat F2 odwirowuje się przez około min przy około 400g, co pozwala na uzyskanie osadu C2. Osad C1 wprowadza się do odpowiedniej pożywki, co prowadzi do uzyskania zawiesiny S2, która posłuży również do wprowadzenia osadu C2; w ten sposób uzyskuje się zawiesinę S3 bogatą w komórki zrębowe, z grubsza izolowane; zawiesina ta odpowiada drugiej frakcji endometrium. Tę zawiesinę S3 pozostawia się do sedymentacji przez około -60 min, co prowadzi do uzyskania nadsączu SN1 bogatego w komórki zrębowe i osadu C3 zawierającego trzecią frakcję endometrium, zwaną mieszaną, w skład której wchodzi mieszanina komórek zrębowych i gruczołów. Sposobem charakterystycznym dla wynalazku jest możliwość oddzielenia gruczołów i komórek zrębowych z tej trzeciej frakcji endometrium, w celi ich odnotowania celem lepszego poznania i opanowania hodowli.

12 13 a) Uzyskiwanie komórek zrębowych trzeciej frakcji endometrium 1 Osad C3 wprowadza się do odpowiedniej pożywki hodowlanej celem uzyskania zawiesiny S4 (etap a1), którą następnie filtruje się, co prowadzi do uzyskania filtratu i frakcji osadzonej na filtrze FR1 (etap a2). Filtrat odwirowuje się około min przy 400g, u co prowadzi do uzyskania osadu C4, zawierającego komórki zrębowe z trzeciej frakcji endometrium (etap a3). Osad C4 wprowadza się do pożywki IVF, co prowadzi do uzyskania zawiesiny S komórek zrębowych z trzeciej frakcji endometrium (etap a4). Na tej zawiesinie S przeprowadza się wtedy badania żywotności i zliczanie komórek. Poprzez określenie pożywka IVF rozumie się każdą pożywkę hodowlaną, stosowaną przez laboratoria medycznego wspomagania rozrodu w trakcie manipulacji na gametach i zarodkach. b) Uzyskiwanie gruczołów trzeciej frakcji endometrium 2 Ponadto zatrzymaną frakcję FR1 poddaje się filtracji, co pozwala odzyskać gruczoły. Z tak uzyskanej zatrzymanej frakcji FR2 uzyskuje się następnie zawiesinę S6, zawierającą gruczoły z trzeciej frakcji endometrium w pożywce IVF. Na zawiesinie S6 prowadzi się zliczanie oczyszczonych gruczołów.

13 14 c) Zmieszanie gruczołów i komórek zrębowych oczyszczonej trzeciej frakcji endometrium 1 2 Zawiesiny S i S6 następnie miesza się celem uzyskania oczyszczonej trzeciej frakcja endometrium (etap c). Mieszaninę gruczołów i komórek zrębowych z oczyszczonej trzeciej frakcji endometrium, uzyskaną w etapie c), hoduje się następnie w pożywce IVF. Komórki nabłonkowe (pochodzące z gruczołów) i komórki zrębowe pozostawia się w hodowli przez kilka dni. W korzystnej odmianie wykonania bioptat endometrium poddaje się kriokonserwacji tuż po pobraniu, po czym, mniej więcej w dniu rozpoczęcia jajeczkowania u pacjentki, bioptat rozmraża się i poddaje obróbce według opisanego sposobu i następnie zakłada się hodowlę gruczołów i komórek zrębowych oczyszczonej trzeciej frakcji endometrium, którą prowadzi się przez kilka dni. W innej odmianie wykonania, bioptat endometrium poddaje się obróbce sposobem według wynalazku natychmiast po jego otrzymaniu przez laboratorium. Tak uzyskaną mieszaninę gruczołów i komórek zrębowych z oczyszczonej trzeciej frakcji endometrium hoduje się przez kilka dni; tę hodowlę komórek poddaje się kriokonserwacji i rozmraża się mniej więcej w dniu punkcji oocytarnej u pacjentki. We wszystkich przypadkach sposób wytwarzania układu hodowli autologicznego endometrium, do zastosowania do współhodowli endometrium-zarodek w czasie IVF, może obejmować dodatkowy etap pakowania tego układu hodowli autologicznego endometrium z użyciem półstałej pożywki

14 1 1 2 IVF lub ciekłej pożywki IVF, do zastosowania podczas transportu do laboratorium medycznego wspomagania rozrodu. Pakowanie układu hodowli autologicznego endometrium obejmuje jako wstępny etap wytworzenie półstałej pożywki IVF z zastosowaniem stężonego roztworu agarozy. Roztwór agarozy i pożywkę IVF miesza się. Mieszaninę tę następnie równomiernie rozprowadza się do jałowych pojemników i przechowuje w temperaturze 4 C. W dniu zapłodnienia in vitro hodowla komórek autologicznego endometrium powinna być gotowa do wysyłki do laboratorium medycznego wspomagania rozrodu, w celu u- mieszczenia w niej zarodka. Niezbędnym warunkiem jest uzyskanie warstwy komórek o zlewności co najmniej 60%. W jednej z odmian wykonania półstałą pożywkę IVF, uprzednio zrównoważoną w temperaturze 37 C i w atmosferze zawierającej % CO 2 przez co najmniej 2h, umieszcza się na warstwie komórek. Następnie płytkę umieszcza się na jałowym blistrze i całość zamyka się szczelnie jałową pokrywą. Powietrze wewnątrz blistra zawiera % CO 2. Blister pakuje się do drugiego, większego blistra. Tak uzyskane opakowanie stanowi podwójny blister. W innej odmianie wykonania, studzienki zawierające warstwę komórek wypełnia się ciekłą pożywką hodowlaną (uprzednio zrównoważoną w temperaturze 37 C i w atmosferze zawierającej % CO 2 przez co najmniej 2h) w ilości 00 µl/studzienkę, po czym zamyka się je silikonowymi zatyczkami. Płytkę następnie umieszcza się w jałowym blistrze i całość zamyka się szczelnie jałową pokrywą. Blister pakuje się do drugiego, większego

15 blistra. Tak uzyskane opakowanie stanowi podwójny blister. Transport do laboratorium medycznego wspomagania rozrodu odbywa się w temperaturze około 27 C, w czasie poniżej 36h, przy jak najmniejszej liczbie wstrząsów. W kartonie dostosowanym do transportu bardzo kruchych towarów umieszcza się opakowanie izotermiczne. Wewnątrz niego znajduje się jedna lub dwie paczki eutektycznego żelu, umożliwiającego utrzymanie temperatury na poziomie około 27 C. Blister zawierający hodowlę komórek autologicznego endometrium umieszcza się następnie na paczce lub paczkach żelu albo między nimi. Według drugiego aspektu wynalazek dotyczy układu hodowli autologicznego endometrium, przeznaczonego do zastosowania do współhodowli endometrium-zarodek w czasie IVF, przy czym układ ten zawiera hodowlę komórek nabłonkowych i zrębowych z oczyszczonej trzeciej frakcji endometrium. W znanych sposobach obróbki bioptatów endometrium za najkorzystniejsze uważa się komórki nabłonkowe, o- trzymane poprzez hodowlę gruczołów uzyskanych w procesie oczyszczania z osadu D2 (pierwsza frakcja endometrium) i to właśnie dlatego te komórki są wykorzystywane do współhodowli endometrium-zarodek, jak opisano w dokumencie Nieto F.S i wsp. J. Assist. Reprod. Gen 1996, 13(), W innych dokumentach, na przykład Spandorfer S.D i wsp. J. Reprod. Med 04, 49(6), , opisano możliwość wykorzystania w czasie współhodowli endometrium-zarodek komórek nabłonkowych zmieszanych z komórkami zrębowymi oczyszczonymi z nadsączu SN3 (druga frakcja

16 endometrium). We wszystkich znanych sposobach trzecia frakcja endometrium, zwana mieszaną, zawarta w osadzie C3, jest eliminowana. I tak, Zgłaszający stwierdził, że hodowla komórek nabłonkowych i zrębowych z oczyszczonej, mieszanej frakcji endometrium jest wyższej jakości, niż hodowla z oczyszczonych komórek nabłonkowych z osadu D2. Ponadto hodowlę komórek nabłonkowych i zrębowych z oczyszczonej, mieszanej frakcji endometrium można łatwo przeprowadzić, w przeciwieństwie do hodowli komórek nabłonkowych pochodzących z pierwszej frakcji endometrium. Według trzeciego aspektu wynalazek dotyczy zastosowania jednego z opisywanych układów hodowli autologicznego endometrium do wytwarzania współhodowli endometrium-zarodek w czasie IVF. Według czwartego aspektu wynalazek dotyczy gotowego do użytku układu hodowli autologicznego endometrium, przeznaczonego do zastosowania do współhodowli endometrium-zarodek w czasie IVF, zawierajacego: - hodowlę komórek nabłonkowych i zrębowych oczyszczonej trzeciej frakcji endometrium; - półstałą pożywkę hodowlaną IVF do tej hodowli; - jałowe opakowanie do układu hodowli, zawierające tę hodowlę i tę pożywkę hodowlaną.

17 18 Zastrzeżenia patentowe Sposób wytwarzania, z bioptatu endometrium, układu hodowli autologicznego endometrium, przeznaczonego do zastosowania do współhodowli endometrium-zarodek w czasie IVF, przy czym ten układ hodowli zawiera komórki nabłonkowe i komórki zrębowe, a sposób ten obejmuje etapy prowadzące do uzyskania: - pierwszej frakcji endometrium, zwanej nabłonkową, zawierającej gruczoły nabłonkowe pochodzące z osadu zatrzymanego na filtrze po jednym lub kilku etapach lizy tkanki endometrium; - drugiej frakcji endometrium, zwanej zrębową, odpowiadającej skumulowanemu filtratowi wytworzonemu w etapach filtracji przeprowadzonych po jednym lub kilku etapach lizy i zawierającej jako większościowy składnik komórki zrębowe, oraz - trzeciej frakcji endometrium, zwanej mieszaną, zawierającej mieszaninę gruczołów i komórek zrębowych, odpowiadającej osadowi z sedymentacji drugiej frakcji, znamienny tym, że sposób ten obejmuje ponadto etap oczyszczania tej trzeciej frakcji, prowadzący do oddzielenia od tej trzeciej frakcji składników nabłonkowych i zrębowych i do hodowli mieszaniny tych oczyszczonych składników w celu uzyskania współhodowli mieszanej. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etap oczyszczania tej trzeciej frakcji endometrium obejmuje: a) uzyskanie komórek zrębowych z trzeciej frakcji b) uzyskanie gruczołów z trzeciej frakcji i c) zmieszanie tak uzyskanych komórek zrębowych i gruczołów.

18 Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że etap a) obejmuje następujące operacje: a1. wytworzenie zawiesiny z trzeciej frakcji endometrium w odpowiedniej pożywce hodowlanej, prowadzące do uzyskania zawiesiny S4; a2. filtracja zawiesiny S4, prowadząca do uzyskania filtratu i frakcji zatrzymanej na filtrze FR1; a3. odwirowanie tego filtratu, prowadzące do uzyskania osadu C4 zawierającego komórki zrębowe z trzeciej frakcji endometrium; a4. wprowadzenie osadu C4 do pożywki IVF, prowadzące do uzyskania zawiesiny S komórek zrębowych trzeciej frakcji endometrium. 4. Sposób według jednego z zastrz. 2 albo 3, znamienny tym, że etap b) obejmuje następujące operacje: b1. hodowla w obecności czynników sprzyjających przywieraniu komórek frakcji zatrzymanej FR1 przez okres czasu wystarczający dla adhezji komórek zrębowych, prowadząca do uzyskania nadsączu SN4; b2. filtracja nadsączu SN4 i wytworzenie zawiesiny z tak otrzymanej frakcji zatrzymanej FR2, prowadzące do uzyskania zawiesiny S6 zawierającej gruczoły z trzeciej frakcji endometrium, w pożywce IVF.. Sposób według zastrz. 3 albo 4, znamienny tym, że etap c) składa się ze zmieszania zawiesin S i S6 celem uzyskania oczyszczonej trzeciej frakcji endometrium. 6. Sposób według zastrz., znamienny tym, że obejmuje ponadto etap prowadzenia hodowli gruczołów i

19 1 2 komórek zrębowych z oczyszczonej trzeciej frakcji endometrium. 7. Sposób według dowolnego z zastrz. 1-6, znamienny tym, że obejmuje dodatkowy etap pakowania tego układu hodowli autologicznego endometrium z użyciem półstałej pożywki IVF, do zastosowania podczas transportu do laboratorium medycznego wspomagania rozrodu. 8. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że gdy bioptat poddaje się obróbce natychmiast po jego otrzymaniu przez laboratorium, to tak uzyskaną hodowlę komórek poddaje się kriokonserwacji i następnie rozmraża mniej więcej w dniu punkcji oocytarnej u pacjentki. 9. Sposób według dowolnego z zastrz. 1-6, znamienny tym, że gdy bioptat endometrium poddaje się kriokonserwacji tuż po otrzymaniu, to hodowlę gruczołów i komórek zrębowych oczyszczonej trzeciej frakcji endometrium rozpoczyna się mniej więcej w dniu punkcji oocytarnej u pacjentki, po rozmrożeniu i obróbce tego bioptatu.. Sposób według dowolnego z zastrz. 1-9, znamienny tym, że obejmuje co najmniej jeden etap lizy bioptatu endometrium. 11. Sposób według zastrz., znamienny tym, że lizę przeprowadza się z zastosowaniem kolagenazy. 12. Sposób według zastrz., znamienny tym, że lizę przeprowadza się metodami mechanicznymi. 13. Układ hodowli autologicznego endometrium przeznaczony do zastosowania do współhodowli endometrium-zarodek w czasie IVF, znamienny tym, że obejmuje

20 21 1 komórki nabłonkowe i komórki zrębowe z trzeciej frakcji endometrium oczyszczonej sposobem jak określono w jednym z zastrz Zastosowanie układu hodowli autologicznego endometrium, uzyskanego sposobem jak określono w zastrz. 1-12, do wytwarzania współhodowli endometriumzarodek w czasie IVF. 1. Gotowy do użycia układ hodowli autologicznego endometrium, przeznaczony do zastosowania do współhodowli endometrium-zarodek w czasie IVF, znamienny tym, że obejmuje: - hodowlę komórek nabłonkowych i zrębowych trzeciej frakcji endometrium oczyszczonej sposobem jak określno w jednym z zastrz. 1-12; - półstałą pożywkę hodowlaną IVF do tej hodowli; - jałowe opakowanie na układ hodowli, zawierające tę hodowlę i tę pożywkę. Laboratoires Genevrier Pełnomocnik: