Drożdże
Drożdżowe systemy ekspresyjne Zalety: możliwość uzyskania dużej biomasy modyfikacje postranslacyjne eksprymowanych białek transport eksprymowanych białek do pożywki
Duża biomasa W przypadku hodowli bakterii E. coli stosując omawiane uprzednio systemy ekspresji genów (np. system pet) jesteśmy w stanie uzyskać około 5 g mokrej biomasy z litra hodowli W przypadku hodowli drożdży Saccharomyces cerevisiae stosując zaprojektowane dla nich systemy ekspresji genów istnieje możliwość uzyskania od 100 do 200 g biomasy z litra hodowli
Modyfikacje postranslacyjne białek u drożdży Fosforylacja kowalencyjne ufosforylowanie grup -OH, zazwyczaj do reszt seryny, tyrozyny, treoniny lub histydyny Acetylacja dołączenie grupy acylowej, zazwyczaj na N-końcu sekwencji aminokwasowej białka Alkilacja - dołączenie grupy alkilowej (np. metylowej lub etylowej) Izopropenylacja - dołączenie grupy izoprenoidowej (np. farnesol i geranylgeraniol) Glikozylacja - dołączenie reszty cukrowej do reszt kw. asparaginowego, hydroksylizyny, seryny lub treoniny wynikiem czego jest powstanie glikoproteiny Ubikwitynacja kowalencyjne dołączenie ubikwityny do docelowego białka
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae GRAS (Generally Regarded As Safe) Możliwość modyfikacji posttranslacyjnych Organizm dobrze poznany
Saccharomyces cerevisiae - wady Brak stabilności szczepów transformowanych Hiperglikozylacja może zablokować interakcje z przeciwciałami rozwiązanie użycie mutantów (mnn1, mnn9) lub wyeliminowanie potencjalnych miejsc glikozylacji
Plazmidowe wektory wahadłowe Zawierają dwa ori replikacji: prokariotyczne i eukariotyczne Zawierają niezależne lub uniwersalne markery selekcyjne przeznaczone do selekcji i utrzymania plazmidów w komórkach bakterii jak i/ lub drożdży
Promotor GAL1 Represja promotora w obecności glukozy Indukcja promotora w obecności galaktozy (podniesienie poziomu transkrypcji ponad 5000 razy) Możliwość wstępnej hodowli na rafinozie
YES Vector Collection YES Vector Collection - zestaw wektorów plazmidowych przeznaczonych do ekspresji białek heterogenicznych w drożdżach Saccharomyces cerevisiae, należą do nich wektory serii: pyes i pyc Wszystkie wektory plazmidowe z YES Vector Collection są wektorami wahadłowymi E. coli/ Saccharomyces cerevisiae (konstrukcja plazmidów rekombinantowych opartych o wektory plazmidowe z YES Vector Collection odbywa się w E. coli, natomiast ekspresja klonowanych genów w Saccharomyces cerevisiae)
Wektory plazmidowe serii pyes Wektor pyes2
Wektory plazmidowe serii pyes ori puc1 ori puc1 zapewnia wysokokopijność plazmidów rekombinowanych pyes2 w komórkach E. coli (~400 kopii na komórkę) Prokariotyczne ori replikacji
Wektory plazmidowe serii pyes gen bla gen bla zapewnia komórkom E. coli niosącym plazmidy pyes2 oporność na ampicylinę Prokariotyczny marker selekcyjny
Wektory plazmidowe serii pyes 2m origin 2m origin umożliwia replikację plazmidów rekombinowanych pyes2 w komórkach drożdży (od 10 do 40 kopii na komórkę) Eukariotyczne ori replikacji
Wektory plazmidowe serii pyes gen ura3 eukariotyczny marker selekcyjny gen ura3 zapewnia komórkom auksotroficznych drożdży S. cerevisiae niosącym plazmidy pyes2, nie produkującym endogennie uracylu wzrost na pożywkach bez tego nukleotydu
Wektory plazmidowe serii pyes Promotor GAL1 promotor GAL1 pozwala na wydajną ekspresję genów wklonowanych do wektora pyes2
Wektory plazmidowe serii pyes Ekspresja genów spod promotora GAL1 może być regulowana na dwa sposoby Ekspresja spod promotora GAL1 wariant 1 Represor glukoza obecna w pożywce Induktor galaktoza obecna w pożywce pod warunkiem nieobecności w niej glukozy
Wektory plazmidowe serii pyes Ekspresja spod promotora GAL1 wariant 2 Represor brak, w miejsce glukozy obecna jest w pożywce rafinoza Induktor galaktoza obecna w pożywce niezależnie od obecności w niej rafinozy
Wektory plazmidowe serii pyes Promotor GAL1 Wariant 1 konieczność usunięcia glukozy z pożywki przed dodaniem galaktozy, najczęściej odbywa się przez odwirowanie drożdży z pożywki z glukozą i przeniesienie ich na pożywkę z galaktozą Wariant 2 - (rafinoza-galaktoza) ekspresja białka spod promotora GAL1 odbywa się znacznie szybciej niż w wariancie 1 (glukozagalaktoza)
Wektory plazmidowe serii pyes Terminator CYC1 Terminator CYC1 pozwala na efektywną terminację transkrypcji zachodzącej spod promotora GAL1 Terminator CYC1 zapewnia powstawanie stabilnego transkryptu mrna w komórkach drożdży S. cerevisiae
Wektory plazmidowe serii pyes Promotor T7 Obecny w wektorach plazmiadowych serii pyes i pyc promotor T7 nie jest wykorzystywany do ekspresjii genów wklonowanych w MCS, promotor ten pozwala na transkrypcję in vitro w obrębie MCS
Wektory plazmidowe serii pyes f1 origin f1 origin pozwala na uzyskanie jednoniciowego DNA plazmidu pyes2
Wektory serii pyes Wektory tej serii analogicznie jak wektory serii pet mogą sekwencje kodujące domeny fuzyjne np. His-tag, mające na celu np. ułatwienie oczyszczania powstałych białek fuzyjnych i/lub możliwość detekcji ich produkcji z wykorzystaniem przeciwciał
Wektory serii pyes
Szczep gospodarza dla wektorów serii pyes (pyc) Szczepem wykorzystywanym do ekspresji białek spod promotora GAL1 jest auksotroficzny szczep drożdży Saccharomyces cerevisiae INVSc1 Genotyp: his3 1/his3 1 leu2/leu2 trp1-289/trp1-289 ura3-52/ura3-52 Fenotyp: His-, Leu-, Trp-, Ura- Wektor plazmidowy pyes3/ct zawiera sekwencję kodującą marker selekcyjny gen TRP1
Inne drożdżowe szczepy gospodarzy dla wektorów serii pyes (pyc) Zastosowanie wektorów plazmidowych takich jak: pyes6/ct i pyc6/ct niosących uniwersalny marker selekcyjny: gen oporności na antybiotyk blastycydynę daje możliwość użycia nieauksotroficznych szczepów drożdży S. cerevisiae - Blastycydyna jest toksyczna zarówno dla komórek drożdży S. cerevisiae jak i bakterii E. coli
Wektory serii pyc Wektory plazmidowe serii pyc różnią się od wektorów plazmidowych serii pyes odmiennym eukariotycznym drożdżowym ori replikacji W miejsce ori 2m (pyes) występuje hybrydowe ori replikacji CEN6/ARSH4
Wektory serii pyc ori replikacji CEN6/ARSH4 ori replikacji CEN6/ARSH4 zapewnia plazmidom pyc niskokopijność (1-2 kopii plazmidu na komórkę drożdży) Plazmidy te wykorzystywne są do ekspresji genówkodujących białka toksyczne dla komórek drożdży S. cerevisiae
Podsumowanie Ekspresja genów heterogenicznych w drożdżach Saccharomyces cerevisiae opiera się o wahadłowe wektory plazmidowe Szczepy Saccharomyces cerevisiae wykorzystywane w znanych drożdżowych systemach drożdżowych są mutantami auksotrofowymi Najczęściej wykorzystywanym promotorem drożdżowym jest promotor GAL1 podlegający ścisłej regulacji ekspresji: induktor/represor
Kluyvyromyces lactis
Kluyvyromyces lactis - Novagen Wysoki poziom ekspresji Możliwość zakupu gotowych kompetentnych komórek K. lactis Proste protokoły (dla osób bez doświadczenia w pracy z drożdżami) Możliwość wykorzystania systemów dla celów komercyjnych (system sublicencjonowania) Możliwość produkcji białek na zewnątrz lub wewnątrz komórek
Kluvyromyces lactis - Novagen Ekspresja w drożdżach zachodzi spod silnego promotora LAC4, który NIE umożliwia ekspresji w E. coli (geny kodujące białka toksyczne dla E. coli mogą być klonowane do plazmidu pklac1 w bakteriach przed ich ekspresją w systemach drożdżowych) Białka produkowane w K. lactis ulegają modyfikacjom (glikozylacja) Selekcja odbywa się bez użycia antybiotyków acetamidaza (amds) z pklac1 pozwala transformowanym komórkom na użycie acetamidu, jako źródła azotu
Kluyvyromyces lactis wektor pklac1 5 i 3 koniec promotora LAC4 (PLAC4-PBI) rozdzielony DNA kodującym β-lakatmazę (ApR) pmb1 origin (ori) zapewniające replikację w E. coli K. lactis α-mf (kodujący peptyd sygnalny) Multiple cloning site (MCS) miejsce wielokrotnego klonowania LAC4 terminator transkrypcji (TT) położony bezpośrednio za 3 PLAC4-PBI Drożdżowy promotor ADH2 (PADH2) zapewniający ekspresję genu acetamidazy (amds) 5 i 3 koniec promotora LAC4 (PLAC4-PBI) rozdzielony DNA kodującym β-lakatmazę (ApR) Linearyzacja wektora enzymem SacII lub BstXI umożliwia insercję klonowanego DNA pod natywny promotor LAC4 w genomie K. lactis
Kluyvyromyces lactis New England Biolabs Ekspresja z wektora zawierającego gen kodujący białko fuzyjne (białko klonowane kolor czarny i α-mf domenę niebieski). Peptyd sygnalny α-mf kieruje białko do retikulum endoplazmatycznego, a następnie jest usuwany przez peptydazę sygnalną (SP). Białko jest transportowane do aparatu Golgi gdzie proteaza Kex usuwa domenę α-mf. Białko ulega sekrecji.
Kluyvyromyces lactis - Novagen SDS-polyacrylamide gel electrophoresis separation of secreted recombinant maltose binding protein (MBP) and detection by Coomassie staining. Lane 1: Protein Molecular Weight Markers. Lane 2: spent culture medium (15 µl) from wild-type K. lactis cells. Lane 3: spent culture medium (15 µl) from K. lactis cells harboring an integrated expression cassette containing the E. coli male gene.