Drożdżowe systemy ekspresyjne



Podobne dokumenty
Ekspresja genów heterogenicznych w drożdżach Pichia pastoris

Ekspresja białek w komórkach ssaczych

Escherichia coli. System pbad

Wybór systemu ekspresyjnego

Regulacja ekspresji operonu ksylozowego

Wektory DNA - klonowanie molekularne

PL B1. POLITECHNIKA GDAŃSKA, Gdańsk, PL BUP 22/06. JÓZEF KUR, Wejherowo, PL MARTA WANARSKA, Lębork, PL

Nowoczesne systemy ekspresji genów

Klonowanie molekularne Kurs doskonalący. Zakład Geriatrii i Gerontologii CMKP

Ćwiczenia 1 Wirtualne Klonowanie Prowadzący: mgr inż. Joanna Tymeck-Mulik i mgr Lidia Gaffke. Część teoretyczna:

Wektory DNA - klonowanie molekularne

Wektory DNA - klonowanie molekularne

Dr. habil. Anna Salek International Bio-Consulting 1 Germany

Wektory DNA - klonowanie molekularne

Wektory DNA - klonowanie molekularne

Wektory DNA - klonowanie molekularne

KLONOWANIE DNA REKOMBINACJA DNA WEKTORY

Biologia molekularna z genetyką

Saccharomyces Transformer Kit zestaw do przygotowywania i transformacji komórek kompetentnych Saccharomyces cerevisiae. Metoda chemiczna.

Konstrukcja wektora plazmidowego DNA do klonowania genów i/lub wektora plazmidowego do sekrecji w bakteriach mlekowych

E.coli Transformer Kit

Dr hab. Anna Bębenek Warszawa,

Nowoczesne systemy ekspresji genów. Ekspresja białek w komórkach owadzich

Wykład 14 Biosynteza białek

E.coli Transformer Zestaw do przygotowywania i transformacji komórek kompetentnych Escherichia coli

Olimpiada Biologiczna

Dr. habil. Anna Salek International Bio-Consulting 1 Germany

Definicje. Białka rekombinowane (ang. recombinant proteins, r-proteins) Ukierunkowana mutageneza (ang. site-directed/site-specific mutagenesis)

Inżynieria genetyczna

Screening, klonowanie, ekspresja i oczyszczanie białek

wykład dla studentów II roku biotechnologii Andrzej Wierzbicki

Ćwiczenia 1 Wirtualne Klonowanie. Prowadzący: mgr Anna Pawlik i mgr Maciej Dylewski. Część teoretyczna:

The Role of Maf1 Protein in trna Processing and Stabilization / Rola białka Maf1 w dojrzewaniu i kontroli stabilności trna

Izolacja i oczyszczanie białek

KLONOWANIE DNA REKOMBINACJA DNA WEKTORY

Organizmy modelowe - drożdże. Saccharomyces cerevisiae i nie tylko

Zasady oceniania rozwiązań zadań 48 Olimpiada Biologiczna Etap centralny

Możliwości współczesnej inżynierii genetycznej w obszarze biotechnologii

Inżynieria Genetyczna ćw. 2

Wybrane techniki badania białek -proteomika funkcjonalna

Biologia Molekularna z Biotechnologią ===============================================================================================

Proteomika: umożliwia badanie zestawu wszystkich lub prawie wszystkich białek komórkowych

Making the impossible possible: the metamorphosis of Polish Biology Olympiad

WYNALAZKI BIOTECHNOLOGICZNE W POLSCE. Ewa Waszkowska ekspert UPRP

Adam Dawidowski Klasa III b. mgr Beata Ulczyńska

TECHNIKI ANALIZY RNA TECHNIKI ANALIZY RNA TECHNIKI ANALIZY RNA

Inżynieria Genetyczna ćw. 3

wykład dla studentów II roku biotechnologii Andrzej Wierzbicki

Prokariotyczne systemy ekspresyjne Prokaryotic expression systems

WPROWADZENIE DO GENETYKI MOLEKULARNEJ

TATA box. Enhancery. CGCG ekson intron ekson intron ekson CZĘŚĆ KODUJĄCA GENU TERMINATOR. Elementy regulatorowe

WPROWADZENIE DO GENETYKI MOLEKULARNEJ

Wybrane techniki badania białek -proteomika funkcjonalna

prof. dr hab. Dariusz Bartosik Zakład Genetyki Bakterii Instytut Mikrobiologii Uniwersytet Warszawski ul. Miecznikowa Warszawa

WYKŁAD: Klasyczny przepływ informacji ( Dogmat) Klasyczny przepływ informacji. Ekspresja genów realizacja informacji zawartej w genach

TRANSKRYPCJA - I etap ekspresji genów

wykład dla studentów II roku biotechnologii Andrzej Wierzbicki

Inżynieria Genetyczna ćw. 1

SPIS TREŚCI WYKAZ SKRÓTÓW WSTĘP... 15

wykład dla studentów II roku biotechnologii Andrzej Wierzbicki

Pytania Egzamin magisterski

Organizmy modelowe - drożdże. Saccharomyces cerevisiae i nie tylko

białka wiążące specyficzne sekwencje DNA czynniki transkrypcyjne

Translacja i proteom komórki

Mapowanie fizyczne genomów -konstrukcja map wyskalowanych w jednostkach fizycznych -najdokładniejszą mapą fizyczną genomu, o największej

SCENARIUSZ LEKCJI BIOLOGII Z WYKORZYSTANIEM FILMU

DNA superhelikalny eukariota DNA kolisty bakterie plazmidy mitochondria DNA liniowy wirusy otrzymywany in vitro

Nośnikiem informacji genetycznej są bardzo długie cząsteczki DNA, w których jest ona zakodowana w liniowej sekwencji nukleotydów A, T, G i C

Bożena Nejman-Faleńczyk

Regulacja Ekspresji Genów

Promotor pracy doktorskiej: prof. dr hab. Jacek Bardowski Promotor pomocniczy: dr Urszula Zielenkiewicz

Organizmy modelowe - drożdże. Saccharomyces cerevisiae i nie tylko

Informacje dotyczące pracy kontrolnej

WARUNKI ZALICZENIA PRZEDMIOTU- 5 ECTS

(86)Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: ,PCT/US94/13268

Organizmy modelowe - drożdże. Saccharomyces cerevisiae i nie tylko

Inżynieria genetyczna- 6 ECTS. Inżynieria genetyczna. Podstawowe pojęcia Część II Klonowanie ekspresyjne Od genu do białka

THE UNFOLDED PROTEIN RESPONSE

Spis treści. Wstęp. Obiekt. Pracownia Biologii Molekularnej. Część II. Ekspresja i oczyszczanie białek

Prokaryotyczne i eukaryotyczne systemy nadekspresji bia lek.

2. Enzymy pozwalające na manipulację DNA a. Polimerazy DNA b. Nukleazy c. Ligazy

MATERIAŁY DO BLOKU INŻYNIERIA GENETYCZNA

wykład dla studentów II roku biotechnologii Andrzej Wierzbicki

Analiza stabilności białka DnaA Escherichia coli w regulacji inicjacji replikacji DNA

Przegląd budowy i funkcji białek

WNIOSEK O WYDANIE ZGODY NA ZAMKNIĘTE UŻYCIE GMO

Możliwości współczesnej inżynierii genetycznej w obszarze biotechnologii

PODSTAWY BIOTECHNOLOGII Piotr Solarczyk

Warszawa, dnia 3 sierpnia 2016 r. Poz. 1173

Agenda: Wynalazek jako własnośd intelektualna. Co może byd wynalazkiem. Wynalazek biotechnologiczny. Ochrona patentowa

Ukończono projekt poznania ludzkiego genomu (2003) oraz projekty poznania genomów wielu zwierząt modelowych Co wynika z tej informacji?

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

MIKROORGANIZMY W PRODUKCJI KOSMETYKÓW I WYBRANYCH FARMACEUTYKÓW. wykłady

Drożdże piekarskie jako organizm modelowy w genetyce

6. Z pięciowęglowego cukru prostego, zasady azotowej i reszty kwasu fosforowego, jest zbudowany A. nukleotyd. B. aminokwas. C. enzym. D. wielocukier.

================================================================= Ćwiczenie 6 Oznaczanie aktywności bakteryjnej β-galaktozydazy Materiały:

Badanie funkcji genu

Podstawy biologii. Informacja, struktura i metabolizm.

Inwestycja w przyszłość czyli znaczenie ochrony własności przemysłowej dla współczesnej biotechnologii

Mechanizmy kontroli ekspresji genów w regulacji rozwoju bakteriofagów lambdoidalnych

Transkrypt:

Drożdże

Drożdżowe systemy ekspresyjne Zalety: możliwość uzyskania dużej biomasy modyfikacje postranslacyjne eksprymowanych białek transport eksprymowanych białek do pożywki

Duża biomasa W przypadku hodowli bakterii E. coli stosując omawiane uprzednio systemy ekspresji genów (np. system pet) jesteśmy w stanie uzyskać około 5 g mokrej biomasy z litra hodowli W przypadku hodowli drożdży Saccharomyces cerevisiae stosując zaprojektowane dla nich systemy ekspresji genów istnieje możliwość uzyskania od 100 do 200 g biomasy z litra hodowli

Modyfikacje postranslacyjne białek u drożdży Fosforylacja kowalencyjne ufosforylowanie grup -OH, zazwyczaj do reszt seryny, tyrozyny, treoniny lub histydyny Acetylacja dołączenie grupy acylowej, zazwyczaj na N-końcu sekwencji aminokwasowej białka Alkilacja - dołączenie grupy alkilowej (np. metylowej lub etylowej) Izopropenylacja - dołączenie grupy izoprenoidowej (np. farnesol i geranylgeraniol) Glikozylacja - dołączenie reszty cukrowej do reszt kw. asparaginowego, hydroksylizyny, seryny lub treoniny wynikiem czego jest powstanie glikoproteiny Ubikwitynacja kowalencyjne dołączenie ubikwityny do docelowego białka

Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae GRAS (Generally Regarded As Safe) Możliwość modyfikacji posttranslacyjnych Organizm dobrze poznany

Saccharomyces cerevisiae - wady Brak stabilności szczepów transformowanych Hiperglikozylacja może zablokować interakcje z przeciwciałami rozwiązanie użycie mutantów (mnn1, mnn9) lub wyeliminowanie potencjalnych miejsc glikozylacji

Plazmidowe wektory wahadłowe Zawierają dwa ori replikacji: prokariotyczne i eukariotyczne Zawierają niezależne lub uniwersalne markery selekcyjne przeznaczone do selekcji i utrzymania plazmidów w komórkach bakterii jak i/ lub drożdży

Promotor GAL1 Represja promotora w obecności glukozy Indukcja promotora w obecności galaktozy (podniesienie poziomu transkrypcji ponad 5000 razy) Możliwość wstępnej hodowli na rafinozie

YES Vector Collection YES Vector Collection - zestaw wektorów plazmidowych przeznaczonych do ekspresji białek heterogenicznych w drożdżach Saccharomyces cerevisiae, należą do nich wektory serii: pyes i pyc Wszystkie wektory plazmidowe z YES Vector Collection są wektorami wahadłowymi E. coli/ Saccharomyces cerevisiae (konstrukcja plazmidów rekombinantowych opartych o wektory plazmidowe z YES Vector Collection odbywa się w E. coli, natomiast ekspresja klonowanych genów w Saccharomyces cerevisiae)

Wektory plazmidowe serii pyes Wektor pyes2

Wektory plazmidowe serii pyes ori puc1 ori puc1 zapewnia wysokokopijność plazmidów rekombinowanych pyes2 w komórkach E. coli (~400 kopii na komórkę) Prokariotyczne ori replikacji

Wektory plazmidowe serii pyes gen bla gen bla zapewnia komórkom E. coli niosącym plazmidy pyes2 oporność na ampicylinę Prokariotyczny marker selekcyjny

Wektory plazmidowe serii pyes 2m origin 2m origin umożliwia replikację plazmidów rekombinowanych pyes2 w komórkach drożdży (od 10 do 40 kopii na komórkę) Eukariotyczne ori replikacji

Wektory plazmidowe serii pyes gen ura3 eukariotyczny marker selekcyjny gen ura3 zapewnia komórkom auksotroficznych drożdży S. cerevisiae niosącym plazmidy pyes2, nie produkującym endogennie uracylu wzrost na pożywkach bez tego nukleotydu

Wektory plazmidowe serii pyes Promotor GAL1 promotor GAL1 pozwala na wydajną ekspresję genów wklonowanych do wektora pyes2

Wektory plazmidowe serii pyes Ekspresja genów spod promotora GAL1 może być regulowana na dwa sposoby Ekspresja spod promotora GAL1 wariant 1 Represor glukoza obecna w pożywce Induktor galaktoza obecna w pożywce pod warunkiem nieobecności w niej glukozy

Wektory plazmidowe serii pyes Ekspresja spod promotora GAL1 wariant 2 Represor brak, w miejsce glukozy obecna jest w pożywce rafinoza Induktor galaktoza obecna w pożywce niezależnie od obecności w niej rafinozy

Wektory plazmidowe serii pyes Promotor GAL1 Wariant 1 konieczność usunięcia glukozy z pożywki przed dodaniem galaktozy, najczęściej odbywa się przez odwirowanie drożdży z pożywki z glukozą i przeniesienie ich na pożywkę z galaktozą Wariant 2 - (rafinoza-galaktoza) ekspresja białka spod promotora GAL1 odbywa się znacznie szybciej niż w wariancie 1 (glukozagalaktoza)

Wektory plazmidowe serii pyes Terminator CYC1 Terminator CYC1 pozwala na efektywną terminację transkrypcji zachodzącej spod promotora GAL1 Terminator CYC1 zapewnia powstawanie stabilnego transkryptu mrna w komórkach drożdży S. cerevisiae

Wektory plazmidowe serii pyes Promotor T7 Obecny w wektorach plazmiadowych serii pyes i pyc promotor T7 nie jest wykorzystywany do ekspresjii genów wklonowanych w MCS, promotor ten pozwala na transkrypcję in vitro w obrębie MCS

Wektory plazmidowe serii pyes f1 origin f1 origin pozwala na uzyskanie jednoniciowego DNA plazmidu pyes2

Wektory serii pyes Wektory tej serii analogicznie jak wektory serii pet mogą sekwencje kodujące domeny fuzyjne np. His-tag, mające na celu np. ułatwienie oczyszczania powstałych białek fuzyjnych i/lub możliwość detekcji ich produkcji z wykorzystaniem przeciwciał

Wektory serii pyes

Szczep gospodarza dla wektorów serii pyes (pyc) Szczepem wykorzystywanym do ekspresji białek spod promotora GAL1 jest auksotroficzny szczep drożdży Saccharomyces cerevisiae INVSc1 Genotyp: his3 1/his3 1 leu2/leu2 trp1-289/trp1-289 ura3-52/ura3-52 Fenotyp: His-, Leu-, Trp-, Ura- Wektor plazmidowy pyes3/ct zawiera sekwencję kodującą marker selekcyjny gen TRP1

Inne drożdżowe szczepy gospodarzy dla wektorów serii pyes (pyc) Zastosowanie wektorów plazmidowych takich jak: pyes6/ct i pyc6/ct niosących uniwersalny marker selekcyjny: gen oporności na antybiotyk blastycydynę daje możliwość użycia nieauksotroficznych szczepów drożdży S. cerevisiae - Blastycydyna jest toksyczna zarówno dla komórek drożdży S. cerevisiae jak i bakterii E. coli

Wektory serii pyc Wektory plazmidowe serii pyc różnią się od wektorów plazmidowych serii pyes odmiennym eukariotycznym drożdżowym ori replikacji W miejsce ori 2m (pyes) występuje hybrydowe ori replikacji CEN6/ARSH4

Wektory serii pyc ori replikacji CEN6/ARSH4 ori replikacji CEN6/ARSH4 zapewnia plazmidom pyc niskokopijność (1-2 kopii plazmidu na komórkę drożdży) Plazmidy te wykorzystywne są do ekspresji genówkodujących białka toksyczne dla komórek drożdży S. cerevisiae

Podsumowanie Ekspresja genów heterogenicznych w drożdżach Saccharomyces cerevisiae opiera się o wahadłowe wektory plazmidowe Szczepy Saccharomyces cerevisiae wykorzystywane w znanych drożdżowych systemach drożdżowych są mutantami auksotrofowymi Najczęściej wykorzystywanym promotorem drożdżowym jest promotor GAL1 podlegający ścisłej regulacji ekspresji: induktor/represor

Kluyvyromyces lactis

Kluyvyromyces lactis - Novagen Wysoki poziom ekspresji Możliwość zakupu gotowych kompetentnych komórek K. lactis Proste protokoły (dla osób bez doświadczenia w pracy z drożdżami) Możliwość wykorzystania systemów dla celów komercyjnych (system sublicencjonowania) Możliwość produkcji białek na zewnątrz lub wewnątrz komórek

Kluvyromyces lactis - Novagen Ekspresja w drożdżach zachodzi spod silnego promotora LAC4, który NIE umożliwia ekspresji w E. coli (geny kodujące białka toksyczne dla E. coli mogą być klonowane do plazmidu pklac1 w bakteriach przed ich ekspresją w systemach drożdżowych) Białka produkowane w K. lactis ulegają modyfikacjom (glikozylacja) Selekcja odbywa się bez użycia antybiotyków acetamidaza (amds) z pklac1 pozwala transformowanym komórkom na użycie acetamidu, jako źródła azotu

Kluyvyromyces lactis wektor pklac1 5 i 3 koniec promotora LAC4 (PLAC4-PBI) rozdzielony DNA kodującym β-lakatmazę (ApR) pmb1 origin (ori) zapewniające replikację w E. coli K. lactis α-mf (kodujący peptyd sygnalny) Multiple cloning site (MCS) miejsce wielokrotnego klonowania LAC4 terminator transkrypcji (TT) położony bezpośrednio za 3 PLAC4-PBI Drożdżowy promotor ADH2 (PADH2) zapewniający ekspresję genu acetamidazy (amds) 5 i 3 koniec promotora LAC4 (PLAC4-PBI) rozdzielony DNA kodującym β-lakatmazę (ApR) Linearyzacja wektora enzymem SacII lub BstXI umożliwia insercję klonowanego DNA pod natywny promotor LAC4 w genomie K. lactis

Kluyvyromyces lactis New England Biolabs Ekspresja z wektora zawierającego gen kodujący białko fuzyjne (białko klonowane kolor czarny i α-mf domenę niebieski). Peptyd sygnalny α-mf kieruje białko do retikulum endoplazmatycznego, a następnie jest usuwany przez peptydazę sygnalną (SP). Białko jest transportowane do aparatu Golgi gdzie proteaza Kex usuwa domenę α-mf. Białko ulega sekrecji.

Kluyvyromyces lactis - Novagen SDS-polyacrylamide gel electrophoresis separation of secreted recombinant maltose binding protein (MBP) and detection by Coomassie staining. Lane 1: Protein Molecular Weight Markers. Lane 2: spent culture medium (15 µl) from wild-type K. lactis cells. Lane 3: spent culture medium (15 µl) from K. lactis cells harboring an integrated expression cassette containing the E. coli male gene.