Promotor pracy doktorskiej: prof. dr hab. Jacek Bardowski Promotor pomocniczy: dr Urszula Zielenkiewicz

Transkrypt

1 prof. dr hab. Dariusz Bartosik Zakład Genetyki Bakterii Instytut Mikrobiologii Uniwersytet Warszawski Miecznikowa Warszawa Warszawa, Recenzja rozprawy doktorskiej mgr Iwony Brzozowskiej pt. Charakterystyka funkcjonalna systemu toksyna-antytoksyna plazmidu psm19035 " wykonanej w Instytucie Biochemii i Biofizyki PAN Promotor pracy doktorskiej: prof. dr hab. Jacek Bardowski Promotor pomocniczy: dr Urszula Zielenkiewicz Plazmidy, powszechnie uważane za główne, naturalne wektory horyzontalnego transferu genów, są bardzo stabilnie utrzymywane w populacji bakterii. Wynika to, w dużej mierze, z obecności kilku typów systemów stabilizujących, działających na różnych etapach podziału komórki bakteryjnej. Najbardziej powszechne są systemy addykcyjne, kodujące toksynę i antytoksynę, które uzależniają komórkę od niesionego przez nią plazmidu, a w rezultacie prowadzą do posegregacyjnej eliminacji komórek bezplazmidowych. Podstawą funkcjonowania tych systemów jest różna stabilność kodowanych przez nie komponentów. Labilna antytoksyna szybciej ulegaj degradacji, czego skutkiem jest odblokowanie toksyny w komórkach bezplazmidowych, prowadzące do śmierci komórki bądź zahamowania jej procesów metabolicznych. Toksyczne produkty systemów tego typu, w przeciwieństwie do kodowanych przez niektóre plazmidy bakteriocyn czy antybiotyków, nie są wydzielane na zewnątrz komórki, działają więc jedynie na bakterię, która je wytwarza. Stawarza to możliwość opracowania nowych, celowanych terapii antybakteryjnych, wykorzystujących właściwości obecnych w komórce systemów TA. Głównym celem recenzowanej rozprawy było przeprowadzenie częściowej analizy systemu addykcyjnego omega-epsilon-zeta, pochodzącego z plazmidu psm19035 bakterii patogennej Streptococcus pyogenes. System ten jest archetypem licznej rodziny modułów addykcyjnych, występujących zarówno w genomach plazmidów opornościowych, jak i w chromosomach wielu bakterii gramdodatnich. Ten dość dobrze poznany, modelowy locus charakteryzuje (i) unikatowa struktura genetyczna, (ii) niespotykany wśród innych systemów TA sposób regulacji ekspresji genów operonu addykcyjnego oraz (iii) oryginalny cel komórkowy toksyny, bezpośrednio zaangażowany w syntezę peptydoglikanu. Badania przedstawione w rozprawie, które m.in. doprowadziły do identyfikacji proteazy zaangażowanej w degradację antytoksyny Epsilon, stanowią wartościowe dopełnienie tej charakterystyki. 1

2 Rozprawa została przedstawiona w formie spójnego tematycznie zbioru trzech artykułów opublikowanych w latach w międzynarodowych czasopismach naukowych, o sumarycznym współczynniku oddziaływania (Impact Factor; IF) 7,876. Jeden artykuł oryginalny oraz praca o charakterze przeglądowym ukazały się w czasopiśmie Plasmid (odpowiednio w 2012 i 2013 roku), natomiast drugi artykuł oryginalny został opublikowany w Journal of Biological Chemistry (2014). Zamieszczone w rozprawie kopie ww. artykułów poprzedza: (i) Streszczenie, przedstawione w języku polskim i angielskim, (ii) krótki Wstęp, zawierający podstawowe informacje o strukturze i funkcji systemów toksyna-antytoksyna, ze szczególnym uwzględnieniem obiektu badawczego systemu omega-epsilon-zeta, (iii) sprecyzowany Cel pracy, a także (iv-v) krótkie Omówienie i Podsumowanie uzyskanych wyników. Do rozprawy dołączono także oświadczenia współautorów, które jednoznacznie wskazują na dominującą rolę mgr Iwony Brzozowskiej w przeprowadzeniu części eksperymentalnej opisanych badań. Należy zaznaczyć, że Doktorantka jest pierwszym autorem wszystkich przedstawionych artykułów, a w dwóch z nich (w tym w pracy przeglądowej), jedynym współautorem jest promotor pomocniczy dr Urszula Zielenkiewicz. W świetle przedstawionych danych, włączenie tych prac do rozprawy nie budzi żadnych wątpliwości. Wszystkie prace zostały już opublikowane, podlegały więc wcześniej wnikliwej i rygorystycznej recenzji wymagających specjalistów i edytorów naukowych, zyskując ich pozytywne opinie. Nie widzę konieczności omawiania strony edytorskiej tych prac. Mam jedynie pewne uwagi językowe do wprowadzającej części polskojęzycznej, które chętnie przekażę Doktorantce. Niżej przedstawiam własna ocenę merytoryczną prac włączonych do rozprawy. W pierwszej z przedstawionych prac, o informatywnym tytule Functioning of the TA cassette of streptococcal plasmid psm19035 in various Gram-positive bacteria, zbadano aktywność systemu omega-epsilon-zeta w ośmiu szczepach bakterii gramdodatnich, reprezentujących dwa rzędy taksonomiczne z typu Firmicutes. Stosując plazmid testowy oraz odpowiednią kontrolę wykazano różną efektywność działania analizowanego systemu TA w poszczególnych szczepach. Dowiedziono ponadto, że różnice te nie są spowodowane zależną od gospodarza zmianą liczby kopii plazmidu testowego bądź brakiem ekspresji genów systemu addykcyjnego. Te ciekawe obserwacje wskazują, jak ważną rolę w poprawnym funkcjonowaniu systemu addykcyjnego odgrywają, specyficzne dla szczepu bądź gatunku, czynniki komórkowe. Informacje te są szczególnie interesujące dla naukowców badających postawy funkcjonowania plazmidów o szerokim zakresie gospodarzy. Udział mgr Iwony Brzozowskiej w tych badaniach polegał m.in. na (i) wyznaczeniu czasu generacji szczepów bakterii niosących plazmid testowy, (ii) oznaczeniu liczby kopii plazmidu w różnych gospodarzach, (iii) potwierdzeniu ekspresji genów operonu TA w reakcji odwrotnej transkrypcji oraz (iv) analizie stabilności plazmidu testowego w szczepach reprezentujących dwa gatunki z rodzaju Streptococcus, w których zaobserwowano najsilniejszy efekt zaburzenia 2

3 funkcjonowania systemu TA. Nie ulega więc wątpliwości, że wyniki uzyskane przez Doktorantkę stanowią kluczową część opublikowanej pracy. Badania zaplanowano poprawnie i przeprowadzono rzetelnie, stosując właściwe kontrole oraz odpowiednią liczbę powtórzeń eksperymentów. Jedyne moje zastrzeżenie budzi analiza liczby kopii plazmidu testowego przeprowadzona metodą Real-Time PCR, w której jako gen referencyjny wykorzystano 16S rdna, występujący u wielu bakterii w większej liczbie kopii, niekiedy także w obrębie replikonów pozachromosomowych. Jak wynika z analiz opublikowanych w 2013 roku przez Větrovskýego i Baldriana w czasopiśmie PLoS ONE (The variability of the 16S rrna gene in bacterial genomes and its consequences for bacterial community; 8: e57923), szczególnie licznie geny te występują w bakteriach z typu Firmicutes (a więc analizowanych w ocenianej rozprawie) średnio powyżej 5 kopii w genomie. Uważam, że do badań przedstawionych w opublikowanej pracy powinny być dobrane wyłącznie szczepy o w pełni zsekwencjonowanych genomach. Pozwoliłoby to, po pierwsze, dobrać nie budzący wątpliwości gen referencyjny, po drugie, uzyskać dane na temat występowania w genomach szczepów biorców homologów systemu epsilon-zeta, których obecność mogłaby zaburzać poprawne funkcjonowanie analizowanego systemu TA. Co prawda, w kilku szczepach przeprowadzono detekcję systemów tego typu metodą PCR, jednak jedynie analiza sekwencji genomów pozwoliłaby uzyskać zdecydowanie jednoznaczne wyniki. Doktorantka, uzasadniając trafność wyboru genu referencyjnego (genu 16S rrna) przeprowadziła dodatkowe eksperymenty, w których ponownie oznaczyła liczbę kopii plazmidu testowego w dwóch szczepach, Bacillus subtilis YB886 i Lacococcus lactis ssp. lactis IL 1403, stosując tym razem dwa inne jednokopiowe, chromosomowe geny referencyjne, tj. gen kinazy glicerolowej (glpk) oraz gen kodujący białko DnaA, zaangażowane w inicjację replikacji chromosomu bakteryjnego. W pracy Brzozowskiej i wsp. czytamy, że uzyskane wyniki były identyczne, jak w przypadku zastosowania genu referencyjnego 16S rrna. Dziwi więc informacja podana w pracy Větrovskýego i Baldriana (Dataset S1) na temat jednego z zastosowanych przez Doktorantkę szczepów - Lacococcus lactis ssp. lactis IL 1403, wskazująca na obecność w genomie tego szczepu nie jednej, lecz aż 6 kopii genu 16S rrna, wykazujących 99,87% identyczności sekwencji. Poproszę Doktorantkę o ustosunkowanie się do tych danych. W drugiej włączonej do rozprawy pracy oryginalnej, opublikowanej w renowowanym czasopiśmie Journal of Biological Chemistry (2014), autorzy postawili sobie za cel identyfikację proteazy odpowiadającej za degradację antytoksyny Epsilon w komórkach B. subtilis - bakterii wykorzystywanej powszechnie jako laboratoryjnego gospodarza plazmidu psm W tym miejscu należy zaznaczyć, że w momencie rozpoczęcia tych badań, powszechne było przekonanie, że antytoksyna Epsilon ulega degradacji pod wpływem proteazy Lon. Wynikało ono ze wstępnych obserwacji opublikowanych w 2006 roku przez grupę badawczą J. Alonso. 3

4 Chociaż obserwacje te nie były odpowiednio udokumentowane, powielano je przez wiele lat w kolejnych artykułach, m.in. w pracy przeglądowej Toxin-antitoxin systems biology, identification and application (2013, Mobile Genetic Elements, 3:e26219). Dopiero w pracy Brzozowskiej i Zielenkiewicz wykazano, że były to błędne sugestie. W cyklu eksperymentów, przeprowadzonych in vivo i in vitro, jednoznacznie wykluczono udział proteazy Lon w proteolitycznej degradacji antytoksyny Epsilon, wskazano również właściwą proteazę zaangażowaną w regulację systemu omega-epsilon-zeta. W wyniku wstępnych eksperymentów, przeprowadzonych z wykorzystaniem mutantów B. subtilis defektywnych w wytwarzaniu poszczególnych proteaz komórkowych, zaobserwowano, że poprawne funkcjonowanie analizowanego systemu jest uwarunkowane obecnością proteazy ClpPX. W dalszej części badań Doktorantka przeprowadziła analizy in vitro, w których, stosując oczyszczone białka, dowiodła jednoznacznie, że proteaza ta jest odpowiedzialna za degradację antytoksyny Epsilon. Wykazała również, że trawienie proteolityczne nie jest specyficzne względem sekwencji aminokwasowej białka. W badaniach opisanych w tej pracy wykorzystano białka zaopatrzone w znacznik histydynowy (His 6 ). W opisie eksperymentów dotyczących analizy tempa rozkładu proteolitycznego antytoksyny Epsilon napisano, że analogiczne wyniki uzyskano z białkiem pozbawionym znacznika. Ponieważ nie znalazłem w pracy wyjaśnienia w jaki sposób usunięto znacznik bądź oczyszczono niewyznakowane białko, poproszę Doktorantkę o podanie tej informacji w trakcie obrony rozprawy. Trzeci artykuł zawarty w ocenianej rozprawie, zatytułowany Regulation of toxin-antitoxin systems by proteolysis, to praca monograficzna opublikowana w 2013 roku, w której dokonano przeglądu literatury w zakresie proteolitycznej regulacji systemów toksyna-antytoksyna typu II. Jest to wartościowy artykuł, będący pierwszym opracowaniem podejmującym tego typu tematykę, która jest ściśle związana z jednym z wątków tematycznych rozprawy. Można jedynie żałować, że nie powstała ona jako ostatnia w cyklu przedstawionych prac, co pozwoliłoby na umieszczenie w niej wyników Doktorantki, identyfikujących proteazę zaangażowaną w degradację antytoksyny systemu omega-epsilon-zeta. W podsumowaniu stwierdzam, że przedstawione badania reprezentują wysoki poziom naukowy i wnoszą nowe i ważne treści do ogólnej wiedzy na temat podstaw funkcjonowania systemów toksyna-antytoksyna, które odgrywają istotną rolę nie tylko w stabilizacji plazmidów i innych typów ruchomych elementów genetycznych w populacjach bakterii, lecz również uczestniczą w odpowiedzi komórek bakteryjnych na warunki stresowe. Uważam, że oceniana praca spełnia wszystkie wymogi formalne stawiane rozprawom doktorskim. Zwracam się więc do Rady Naukowej Instytutu Biochemii i Biofizyki PAN o przyjęcie tej rozprawy i dopuszczenie Pani mgr Iwony Brzozowskiej do dalszych etapów 4

5 przewodu doktorskiego. Jednocześnie, biorąc pod uwagę wartość poznawczą przeprowadzonych badań oraz ich opublikowanie w uznanych periodykach, przedkładam wniosek o wyróżnienie tej rozprawy. prof. dr hab. Dariusz Bartosik 5