Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie Mapowanie i markery molekularne mgr inż. Waldemar Skowron waldemar_skowron@sggw.pl MAPOWANIE polega na opracowaniu szczegółowych map chromosomów, które odzwierciedlają położenie znanych genów, jak również sekwencji DNA o nieznanej funkcji w genomie. MAPY schematyczne odwzorowanie genomu organizmu lub elementu genetycznego (np. plazmidu) przedstawiające wzajemne położenie poszczególnych genów i innych elementów genetycznych. Mapowanie genomu opiera się na dwóch metodach: mapowaniu genetycznym i mapowaniu fizycznym. MARKER to cecha odróżniająca jednego osobnika od drugiego, cecha fenotypowa, choroba dziedziczna, występowanie lub brak jakiegoś polipeptydu, różnicy w sekwencji DNA. 1
MAPY GENETYCZNE MAPY FIZYCZNE powstają w oparciu o analizę częstości rekombinacji między badanymi markerami; pokazują rozmieszczenie markerów na chromosomie oraz odległości genetyczne między nimi; jednostka: 1cM = 1% rekombinacji (1 crossing over na 100 mejoz) powstają poprzez bezpośrednią lokalizację, technikami biologii molekularnej, badanej sekwencji DNA w genomie; jednostka: pary zasad pz (ang. bp, kbp) MAPY GENETYCZNE MAPY FIZYCZNE 2
Mapa genetyczna - mapa lokalizacji genów na chromosomie, powstała poprzez badanie częstości zachodzenia zjawiska crossing over (rekombinacji) pomiędzy odpowiednimi genami na podstawie stosunku ilości rekombinantów do ilości osobników nie zrekombinowanych otrzymanych w krzyżówce testowej. Im częściej zachodzi crossing over między genami (im większa jest wartość tego stosunku), tym bardziej są one od siebie oddalone. Odległość tą wyraża się w jednostkach mapowych (j.m.) lub w centymorganach (cm). mapa genetyczna musi pokazywac pozycje poszczególnych genów w stosunku do okreslonych wyznaczników, czyli markerów Wskazują na względne położenie specyficznych markerów wzdłuż chromosomu informacja na temat struktury, funkcji i ewolucji genomu. Spokrewnione gatunki zazwyczaj mają podobną zawartość i lokalizację genów i markerów; Potencjalnym markerem jest jakakolwiek dziedziczna cecha fizyczna czy molekularna; Populacja mapująca : -ma podstawowe znaczenie dla powodzenia eksperymentu -formy rodzicielskie to homozygotyczne linie wsobne, niski stopień pokrewieństwa, co zwiększy poziom polimorfizmu w potomstwie Populację mapującą stanowią rozszczepiające się potomstwo 3
Mapowanie genetyczne opiera się na stosowaniu technik genetycznych do konstruowania map pokazujących pozycje genów i innych charakterystycznych rodzajów sekwencji w genomie. Techniki genetyczne obejmują krzyżowanie organizmów lub, w przypadku ludzi, badanie historii rodzin (rodowodów). Rodzice o różnych genotypach z polimorficznymi markerami Krzyżowanie wsteczne (backcross) Kultury pylników Rekombinowane linie wsobne F 5 -F 6 (RILs) 4
Potencjalny marker to jakakolwiek dziedziczna cecha fizyczna czy molekularna, różna między osobnikami, łatwo wykrywalna; Markerem może być sekwencja DNA w obrębie genu lub odcinka niekodującego nałożonego w pobliżu determinanta genetycznego danej cechy jeżeli jego dziedziczenie można prześledzić; Marker musi być polimorficzny, co znaczy, że muszą istnieć alternatywne formy (allele) pomiędzy osobnikami w badanej populacji; Markery genetyczne Mniej rekombinacji Więcej rekombinacji Im bliżej markery leżą obok siebie, mniejsze jest prawdopodobieństwo rozdzielenia alleli podczas rekombinacji = będą dziedziczyć się razem; Odległość między dwoma punktami nie jest mierzona w jednostkach fizycznych ale w centymorganach; 1cM = 1% rekombinacji Im dalej od siebie są markery 1 i 2 tym częstsze rekombinacje. 5
http://content.onlinejacc.org/ Po stworzeniu populacji, rodzice i pokolenia F 2 są testowane przy użyciu różnych markerów mogą to być np. RFLP, RAPD, AFLP i inne; Jeżeli ma allel A jako marker 1 i B jako marker 2; ma allel C i D odpowiednio jako marker 1 i 2; Jeżeli marker 1 i 2 są blisko siebie na tym samym chromosomie to u potomstwa w większości allele A,B (lub C,D) będą sprzężone bo rekombinacja będzie zachodziła bardzo rzadko Im dalej od siebie są markery 1 i 2 tym częstsze rekombinacje 6
Do raz stworzonej mapy dodajemy następne markery używając do analiz dokładnie tej samej populacji, znaczenie ma jej liczebność (!); Można stworzyć dokładną, wysyconą mapę; Jest to trudne: długi czas i wiele wysiłku; Takie mapy powstały dla wielu roślin (głównie użytkowych) np. ryż, kukurydza, soja; I dla rośliny modelowej Arabidopsis thaliana Mapowanie fizyczne wykorzystuje techniki biologii molekularnej do badania cząsteczek DNA bezpośrednio w celu skonstruowania map pokazujących pozycje różnych typów sekwencji z genami włącznie. Określenie kolejności specyficznych sekwencji markerów na chromosomach i ustalenie odległości między nimi w parach zasad. Rekonstrukcja genomu przez uporządkowanie mniejszych fragmentów DNA w specjalnych wektorach. 7
Mapa fizyczna mierzona jest w parach zasad (pz) i określa odległość między dwoma punktami; Dwa markery mogą być genetycznie bardzo blisko siebie, np. mały współczynnik rekombinacji między nimi, ale daleko fizycznie tysiące pz (zależy od gatunku); Dobrze jest wiedzieć, czy między markerami genetycznymi jest odległość 1kpz (1.000pz) czy 1Mpz (1.000.000 pz); Gatunek kpz/cm rzodkiewnik 139 pomidor 510 kukurydza 2140 Najważniejsze trzy techniki: Mapowanie restrykcyjne, które ustala na cząsteczce DNA względne pozycje miejsc cięcia przez enzymy restrykcyjne. Hybrydyzacja fluorescencyjna in situ (FISH ang. fluorescent in situ hybridization), w której położenia markerów mapuje się przez hybryzyzację markera z nienaruszonym chromosomem. Mapowanie miejsc znaczonych sekwencyjnie (STS ang. sequence tagged site), w którym pozycje krótkich sekwencji mapuje się przez PCR i/lub analizę hybrydyzacyjną fragmentów genomu. 8
Najprostszym sposobem skonstruowania mapy restrykcyjnej jest porównanie wielkości fragmentów po trawieniu DNA dwoma różnymi enzymami restrykcyjnymi osobno i razem (np. EcoRI i BamHI) rozpoznającymi różne sekwencje. Po rozdzieleniu elektroforetycznym, z otrzymanych fragmentów układamy mapę odcinka. W rzeczywistości jest to zmapowanie tylko miejsc restrykcyjnych z dokładnością do kilkudziesięciu pz (bo taka jest dokładność elektroforezy). Układ takich miejsc jest zazwyczaj unikatowy, dlatego profil restrykcji jest znakiem rozpoznawczym danego odcinka genomu. Zatem mapowanie restrykcyjne jest to obraz cząsteczki DNA, na którym zaznaczone są miejsca rozpoznawane przez różne enzymy restrykcyjne z uwzględnieniem odległości między nimi wyrażonej w nukleotydach 9
Mapowanie restrykcyjne daje najlepsze wyniki dla stosunkowo krótkich odcinków DNA, poniżej 50 kb, bo wieksze odcinki się zlewają Gdy pozwolimy na pulsowanie pola elektrycznego, nawet tak długie odcinki jak 2Mb moga byc rozdzielone. Można w ten sposób rozdzielic wszystkie 16 chromosomów drosdsy (nie pocięte) lub odnaleźć YAC. Pozwala bezpośrednio uwidocznić pozycję markera na chromosomie albo na wydłużonej cząsteczce DNA. Markerem jest sekwencja DNA, którą uwidacznia się przez hybrydyzację z sondą fluorescencyjną. 10
Mapować można pod mikroskopem. Komórki z chromosomami w stadium metafazy suszymy na szkiełku mikroskopowym. Denaturujemy chemicznie, tak by struktura przestrzenna nie uległa zniszczeniu, ale żeby rozłączyć komplementarne nici chromosomu. Dodajemy sonde wyznakowana fluorescencyjnie, która odszukuje sekwencje komplementarna i podświetlamy pod mikroskopem dla zobaczenia barwnego sygnału. Na tym przykładzie widzimy chromosom metafazowy (para chromosomów homologicznych, każdy ma dwie chromatydy). Dodano tu na raz 18 różnych sond z różnymi kolorami (znakowaniem fluorescencyjnym). Widać, że na homologicznych odcinkach układ kolorów jest taki sam. Dla zwiększenia dokładności takiego mapowania stosuje się prostowanie i wyciąganie chromosomów metafazowych lub używa się chromosomów z innych stadiów podziału komórki (mniej skondensowanych). 11
Stworzenie szczegółowej mapy fizycznej dużego genomu wymaga procedur mapowania o dużej rozdzielczości i mało skomplikowanych technicznie. Żadna z dwóch rozważanych poprzednio technik nie spełnia tych wymagań. Mapowanie restrykcyjne jest szybkie, łatwe i dostarcza szczegółowych informacji, ale nie nadaje się do dużych genomów. FISH można stosować do dużych genomów, a jego zmodyfikowane wersje mogą dostarczyć danych o dużej rozdzielczości, ale FISH trudno jest przeprowadzić, a zbieranie danych jest powolne. Obecnie najwydajniejszą techniką mapowania fizycznego, odpowiedzialną za stworzenie najbardziej szczegółowych map dużych genomów, jest mapowanie STS. 12
Miejsce znaczone sekwencyjnie to po prostu krótka sekwencja DNA, przeważnie długości 100-500bp, łatwa do rozpoznania i pojawiająca się tylko raz w badanym genomie lub chromosomie. Aby zmapować zestaw STSów, potrzebna jest kolekcja zachodzących na siebie fragmentów pochodzących z pojedynczego chromosomu albo z całego genomu. Wyobraźmy sobie, że mamy komplet pociętych fragmentów dużego genomu (np. człowieka), które umieszczone są np. w kosmidach lub YAC. Jak je uporządkować? Byłoby to możliwe, gdybyśmy znali wiele sekwencji DNA (po 100-500 zasad), z których każda występuje tylko raz w genomie, ale jest ich co najmniej dwie w jednym fragmencie. Potrzebnymi unikatowymi znacznikami mogą być choćby sondy wyprowadzone z cdna genów mających tylko jedna kopie w genomie. Jeśli taka sonda hybrydyzuje z dwoma różnymi fragmentami, to znaczy, że zachodzą one na siebie. Możemy uporządkować naszą bibliotekę, czyli ułożyć mapę STS, lub inaczej, zbudować kontig klonów. 13
Mapy na podstawie kontigów ułożenie nakładających się na siebie fragmentów DNA pokrywających cały genom, i na podstawie restrykcji ułożenie i odległość między miejscami cięcia enzymów oraz różnego typu markerów innych niż RFLP. Kontigi: -cięcie na mniejsze fragmenty i klonowanie; -Ułożenie fragmentów w ciągłą sekwencję bloku DNA; -Trudności przy długich fragmentach (nie wszystkie regiony chromosomu łatwo się klonują); -Duża ilość powtórzonego DNA = trudności z ułożeniem; -Zestaw zachodzących na siebie kontigów jest następnie łączony w większe fragmenty o długości 30tyś.-50 tyś. Zasad, które porządkuje się, wykorzystując fizyczne mapy chromosomowe. Restrykcja -Rzadko tnący enzym, ułożenie długich fragmentów; -Cięcie innym enzymem, ułożenie krótszych fragmentów; -Mapa pokazuje ułożenie i odległość między miejscami cięcia; -Mniej przerw niż przy kontigach ale rozdzielczość mała, nieprzydatna przy wyszukiwaniu konkretnych genów; Markery -Techniki wykorzystujące markery molekularne; -Najczęściej stosowane z metodą PCR; -Gęstość mapy zależy od zastosowanego markera; Niska rozdzielczość Mapowanie z wykorzystaniem restrykcji kolejność i odległości pomiędzy punktami trawienia enzymami DNA. 100s kbp Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) hybrydyzacja fluorescencyjnych sond do chromosomów. 100s kbp STS sequence mapping kolejność unikalnych w genomie markerów DNA (STS). 100 kbp Sequence map - całkowicie zsekwencjonowany chromosom. 1bp Wysoka rozdzielczość 14
Mapy fizyczne i genetyczne uzupełniają się, tworząc podstawę do otrzymania pełnej sekwencjo DNA genomu. 15
W związku z kompleksową budową genomów u większości organizmów, np.12 10 6 pz u drożdży, 3000 10 6 pz u człowieka i 840 10 6 pz u ziemniaka, ustalanie tożsamości genetycznej materiału biologicznego i określenie jego filogenezy opiera się na badaniu wybranych fragmentów DNA, przy użyciu markerów genetycznych. Marker to cecho odróżniająca jednego osobnika od drugiego, cecha fenotypowa, choroba dziedziczna, występowanie lub brak jakiegoś polipeptydu, różnice w sekwencji DNA. Ogólnie, wyróżnia się 2 grupy markerów: markery morfologiczne markery molekularne: - markery białkowe (izoenzymy, allozymy) - markery DNA Markery morfologiczne to cechy zewnętrzne, będące wynikiem ekspresji genów, takie jak kształt blaszki liściowej, zawartość barwników w plastydach, omszenie, czy karłowatość, były pierwszymi, wykorzystywanymi na szeroką skalę do analizy genetycznej, obecnie nada przydatne do identyfikacji odmian hodowlanych. Wady: w większości recesywne, niski polimorfizm, mutacje (ang.deletorious fenotype), problemy z epistazą (interakcja pomiędzy genami), plejotropią, incomplete penetrence, podlegają wpływom środowiska, fenotyp przejściowy, trudne do znalezienia sprzężeń, wynikające z dominacji trudności przy odróżnianiu homozygot id heterozygoty. 16
Izoenzymy (izozymy) - homologiczne enzymy w obrębie danego organizmu, które katalizują tę samą reakcję, ale różnią się nieznacznie strukturą, wartościami Km i Vmax oraz właściwościami regulacyjnymi. Izoenzymy ulegają ekspresji w różnych tkankach lub organellach w różnych stadiach rozwojowych. Są kodowane przez geny zajmujące różne loci, które zwykle powstają w wyniku duplikacji genu i dywergencji. Izoenzymy można często odróżnić od siebie na podstawie właściwości biochemicznych, takich jak ruchliwość elektroforetyczna. Stała Michaelisa (Km) jest to takie stężenie substratu, przy którym szybkość reakcji enzymatycznej jest równa połowie szybkości maksymalnej (Vmax) tej reakcji. wykazują na ogół kodominację, dziedziczą się jak proste jednostki mendlowskie, nie są modyfikowane przez środowisko zewnętrzne, to pierwsze markery molekularne, umożliwiające badanie struktury genetycznej populacji roślin, oszacowanie stopnia heterozygotyczności i polimorfizmu, jak również badanie stopnia podobieństwa genetycznego i potwierdzenie czystości genetycznej lub mieszańcowości, co uczyniło z nich pomocne narzędzie w hodowli. przede wszystkim analiza polimorfizmu izoenzymatycznego umożliwia wyjaśnienie dziedzicznego podłoża wielu enzymów i białek spełniających istotne funkcje w roślinie. Dzięki izoezymom poznano m.in. wielogenową rodzinę kodującą α-amylazę enzym odpowiedzialny za hydrolizę skrobi zapasowej podczas kiełkowania ziarna zbóż. Wady: nie sprawdziły się jako markery molekularne w projektach zmierzających do całościowej charakterystyki genomów roślinych, w tym do konstrukcji map genetycznych, w praktyce, liczba polimorfricznych układów enzymatycznych w określonym materiale badawczym jest niewielka, dodatkowym mankamentem jest konieczność dopracowywania, osobno dla każdego enzymu, metodyki rozdziału, barwienia lub ekstrakcji. 17
Marker genetyczny polimorficzna sekwencja DNA (specyficzna) z jednego miejsca na chromosomie, używana do mapowania genetycznego, może być związana z fenotypem. Marker molekularny klasa I (markery fenotypowe) geny kodujące cechy jakościowe organizmu np. antygeny erytrocytarne (układy grupowe krwi), antygenowe determinanty białek surowicy krwi (allotypy immunoglobulin), białka polimofriczne (osocza krwi, erytrocytów), antygeny leukocytarne oraz antygeny głównego układu zgodności tkankowej (Major Histocompatibility Complex - MHC); markery tej klasy indentyfikowane są metodami serologicznymi lub metodami elektroforetycznymi; klasa II (markery DNA) są to sekwencje DNA, niekoniecznie kodujące, np. RFLP, VNTRs, STRs, RAPD, SSCP, SNP; markery takie jako markery genetyczne muszą mieć przynajmniej dwie alleliczne formy; markery tego typu identyfikowane są przy użyciu technik analizy molekularnej (np. PCR lub metoda hybrydyzacji z sondą molekularną) wysoce polimorficzny (obecność licznych form allelicznych) wysoka częstotliwość występowania i równomierne rozłożenie w genomie, neutralny selekcyjnie (brak sprzężenia z genami plejotropowymi), wykazujący niezależność ekspresji pod wpływem czynników zewnętrznych, powinien być wykrywany prostą i szybką metodą zarówno u homo- jaki i heterozygoty (kodominacja), obecność we wszystkich osobnikach potomnych (ang. Complete penetrance), wykrywalny na wczesnych etapach rozwoju, losowo występujący w genomie, Nie inwazyjna metoda (przeżyciowa) a jego analiza zautomatyzowana. 18
Technika RFLP polega na trawieniu DNA enzymami restrykcyjnymi (nukleazą), a następnie poddaniu produktów trawienia rozdziałowi na żelu agarozowym. Trawienie restrykcyjne określonej cząsteczki DNA powinno dawać ten sam zbiór fragmentów. W przypadku genomowego DNA niektóre miejsca restrykcyjne są polimorficzne i występują jako dwa allele np. A ma sekwencję rozpoznawaną przez enzym a ma zmienioną sekwencję nie rozpoznaną przez enzym Późniejsza modyfikacja metody wprowadziła dodatkowo transfer rozdzielonych fragmentów DNA na membranę, a następnie hybrydyzację DNA ze specyficzną sondą znakowaną radioaktywnie (Southern 1975) lub fluorescencyjnie (Neuhaus-Url i Neuhaus 1993). 19
Jako sondy stosuje się zwykle DNA lub cdna o wielkości 300-500 pz, zaś wizualizację polimorfizmu sygnałów hybrydyzacyjnych dokonuje się za pomocą autoradiografii. Źródłem zróżnicowania struktury DNA określanego metodą RFLP mogą być delecje, insercje, utrata miejsca restrykcyjnego w obrębie sekwencji rozpoznawanej przez sondę, bądź też pojawienie się nowego miejsca restrykcyjnego w obrębie sekwencji rozpoznawanej przez sondę lub poza sekwencją komplementarną dla sondy. ETAPY izolacja DNA trawienie DNA enzymem restrykcyjnym frakcjonowanie DNA (żel agarozowy) denaturacja DNA transfer DNA na membranę przygotowanie sondy: znakowanie denaturacja hybrydyzacja membrany z sondą i płukanie detekcja (np.autoradiografia); 20
ZALETY WADY Możliwość stwierdzenia homo- lub heterozygotyczności analizowanego osobnika na podstawie uzyskanego profilu genetycznego; Wysoka częstotliwość wykrywanego polimorfizmu; Umożliwia analizę specyficznych loci lub alleli; Uzyskane rezultaty cechuje wysoka wiarygodność; Wymaga dużej ilości DNA niezbędnego do trawienia restrykcyjnego; Wysokie koszty otrzymania sondy; Pracochłonność, czasochłonność; Zazwyczaj użycie izotopu. Metoda VNTR po raz pierwszy została zastosowana do tworzenia mapy genetycznej człowieka; Opiera się na analizie tandemowo powtarzających się motywów sekwencyjnych długości 11-60 pz zwanych minisatelitarnym DNA. Z reguły występują przy końcach chromosomów telomerach; Liczba powtórzeń motywu minisatelitarnego waha się do 2 do 1000 razy i jest często zróżnicowana wśród genotypów tego samego gatunku, co powoduje jest licznymi zdarzeniami rekombinacyjnymi. 21
Polimorfizm minisatelitarnych loci wykrywany jest poprzez trawienie DNA enzymami restrykcyjnymi, które rozpoznają sekwencje flankujące minisatelitarne regiony. Dalsze etapy analizy przebiegają jak w przypadku markerów RFLP, z zastosowaniem sond homologicznych do minisatelitarnego DNA. W wyniku analizy uzyskuje się profile molekularne składające się z wielu produktów o wielkości od 4-20 kpz, zwane fingerprintami. 22
SSR opiera się na analizie sekwencji DNA, składających się z powtarzalnego motywu długości 1-5 nukleotydów. Liczba powtórzeń waha się w przedziale 10-50 i może być zmienna w obrębie osobników tego samego gatunku. Dla genomu roślinnego najbardziej charakterystycznym powtórzeniem jest dwunukleotyd (AT)n oraz trójnukleotyd (TAT)n. Aby dokonać analizy sekwencji za pomocą systemu SSR stosuje się biblioteki genomowe, z których, przy użyciu sondy mikrosatelitarnej, selekcjonuje się klony zawierające komplementarne loci. Wyselekcjonowane klony poddaje się sekwencjonowaniu, by na ich bazie zaprojektować startery dla amplifikacji repetytywnego DNA. 23
Wyselekcjonowane klony poddaje się sekwencjonowaniu, by na ich bazie zaprojektować startery dla amplifikacji repetytywnego DNA. Przy projektowaniu starterów korzysta się również z baz danych sekwencyjnych znaczników ekspresji EST lub sekwencji spokrewnionych gatunków. Dokonuje się także wzbogacania istniejących bibliotek genomowych w sekwencje mikrosatelitarne dzięki selektywnej hybrydyzacji fragmentów DNA przy użyciu magnetycznych kulek pokrytych streptawidyną bądź też nylonowych membran. W zależności od liczby powtórzeń elementu podstawowego na żelu poliakryloamidowym uzyskuje się produkty o różnej długości. Zaletą systemu markerowego SSR jest wysoka częstotliwość identyfikacji polimorficznych sekwencji, wynikająca ze zmiennej liczby powtórzeń motywu nukleotydowego, a także możliwośc oceny homo- lub heterozygotyczności analizowanego osobnika na podstawie profilu genetycznego. SSR mikrosatelitarny polimorfizm krótkich tandemowych powtórzeń (ang. simple sequence repeats) ZALETY Łatwy do wykrycia przy użyciu PCR; Wysoki polimorfizm; Kodominujący. WADY Początkowa identyfikacja 24
RAPD to system markerowy bazujący na reakcji PCR z zastosowaniem startera o przypadkowej sekwencji i długości 9-11 pz (Williams i wsp. 1990). Każdy taki starter hybrydyzując do matrycy DNA, zapoczątkowuje amplifikacje w wielu rejonach genomu jednocześnie. Produkty amplifikacji rozdziela się na żelu agarozowym, a ich detekcja odbywa się z użyciem bromku etydyny lub srebra. Metoda ta jest szybsza, wydajniejsza i mniej pracochłonna niż RFLP. Potrzeba również znacznie mniejszych ilości DNA, ponieważ jest on powielany w kolejnych rundach amplifikacji. Stosując analizę RAPD należy być świadomym jej ograniczeń. Obecność produktów, które migrują w żelu na ten sam dystans i wydają się być identyczne dla różnych osobników, nie świadczy o ich homologii sekwencyjnej. Pojedyncze produkty składające się na wzór prążkowy, w rzeczywistości mogą składać się z kilku fragmentów wspólnie migrujących w żelu. 25
Foto: Tomasz Mróz ZALETY WADY Nie jest wymagana uprzednia znajomość sekwencji, startery o przypadkowej sekwencji; Jednoczesna analiza 3-10 miejsc w genomie (tyle samo produktów/1 starter); Łatwa w wykonaniu i stosowaniu niedroga; Możliwość automatyzacji; Szybsza, wydajniejsza i mniej pracochłonna niż RFLP. Pojedyncze produkty składające się na wzór prążkowy, w rzeczywistości mogą składać się z kilku fragmentów wspólnie migrujących w żelu; Niski polimorfizm alleliczny; Wyniki nie zawsze powtarzalne. 26
Użyteczność markerów RAPD może być zwiększona, gdy kontynuacją ich analizy jest system markerowy SCAR. Technika ta polega na sekwencjonowaniu końcowych odcinków produktu RAPD, na bazie których projektowane są startery długości 22-30 pz stosowane do amplifikacji specyficznego locus. System markerowy SCAR identyfikuje różnice sekwencyjne, które dziedziczą się dominująco, jednakże dodatkowe poddanie produktów PCR trawieniu restrykcyjnemu i rozdziałowi na denaturującym żelu poliakryloamidowym może służyć określeniu homo- lub heterozygotyczności analizowanego osobnika. AFLP to technika polegająca na trawieniu matrycowego DNA enzymami restrykcyjnymi, a następnie poddaniu uzyskanych fragmentów dwóm rundom amplifikacji: niespecyficznej i specyficznej. Kombinacja dwóch enzymów restrykcyjnych umożliwia uzyskanie tzw. lepkich końców, które są niezbędne do połączenia produktów trawienia z oligonukleotydowymi odcinkami tzw. adaptorami. Po ligacji adaptorów prowadzona jest reakcja preamplifikacji z zastosowaniem starterów komplementarnych do adaptora i miejsca restrykcyjnego, posiadających na końcu 3 selektywny nukleotyd. Po reakcji amplifikacji niespecyficznej prowadzi się amplifikację specyficzną z użyciem starterów, które na końcu 3 posiadają 2-4 specyficzne nukleotydy. 27
Rozdział produktów PCR następuje na żelu poliakryloamidowym, a detekcja poprzez barwienie srebrem bądź autoradiograficznie. Metodę tą charakteryzuje wysoka rozdzielczość generowanych wzorów prążkowych oraz możliwość szybkiej detekcji polimorfizmu. System ten wymaga znajomości badanych sekwencji, możliwe jest jego zautomatyzowanie, a także konwersja w inne typy markerów. ZALETY Jednoczesna analiza średnio 100 miejsc w genomie = prążków; Potencjalnie wyższy polimorfizm niż przy RFLP czy nawet RAPD; Jak przy RAPD, tylko niewielka ilość DNA jest potrzebna i nie trzeba sondy i hybrydyzacji; Wyniki są bardziej wiarygodne i informatywne niż przy RAPD; Nie wymaga uprzedniej znajomości sekwencji. WADY Metoda pracochłonna; Technicznie skomplikowana; Stosunkowo droga; Wymaga izotopu; Prążki nadal liczone jako obecny/brak (dominujący/recesywny). 28
SSCP polega na detekcji polimorfizmu z zastosowaniem elektroforezy zdenaturowanego jednoniciowego DNA, krórego konformacja ulega zmianie pod wpływem punktowych substytucji, delecji lub insercji. Jej zastosowanie umożliwia idenyfikacje heterozygotyczności organizmów, a także określenie różnic strukturalnych DNA obejmujących kilka par zasad, wpływających na zmianę ruchliwości produktu w żelu poliakryoamidowycm. Metoda ta głównie stosowana w detekcji chorób genetycznych człowieka, została zaadoptowana do analizy polimorfizmu i detekcji mutacji w obrębie genomów roślin hodowlanych. ZALETY Występuje z dużą częstością; Umożliwia identyfikacje heterozygot; W naturze kodominujący; WADY Często populacyjnie specyficzny; Konieczność znajomości sekwencji. 29
SNP umożliwia wykrycie polimorfizmu pojedynczego nukleotydu w obrębie badanej sekwencji. Polega na amplifikacji określonego fragmentu genomu w reakcji PCR i sekwencjonowaniu uzyskanego produktu. Następnie dokonuje się porównania obrazów elektroforetycznych produktów amplifikacji, co pozwala na stwierdzenie, czy mutacja w danym obszarze genomu miała miejsce. Zaleta tej techniki jest wysoka wydajność identyfikacji polimorfizmu w obrębie badanej sekwencji, wada jest wysoki koszt analizy. 30
ZALETY Wysoka wydajność identyfikacji polimorfizmu. WADY Wysoki koszt analizy. (JOANNA SZTUBA-SOLIŃSKA, 2005) 31
(JOANNA SZTUBA-SOLIŃSKA, 2005) 32
badania filogenetyczne: określanie pokrewieństwa między gatunkami, formami uprawnymi i dzikimi, porządkowanie systematyki i weryfikacja poglądów na ewolucję gatunków; konstruowanie map genetycznych gatunków: identyfikacja bardzo dużej liczby markerów zarówno cech jakościowych jak i ilościowych, zagęszczenie map z markerami morfologicznymi i izoenzymatycznymi; określanie czystości odmianowej nasion: np. nasiona mieszańców heterozyjnych tworzone z wykorzystaniem samoniezgodności; czy powstały w wyniku przekrzyżowania czy samozapylenia linii matecznej; określanie czystości odmianowej gatunków rozmnażanych wegetatywnie; identyfikacja odmian przy ochronie praw autorskich; identyfikacja linii hodowlanych, rodów ułatwiająca dobór komponentów odmian, ograniczenie liczby linii testowanych pod względem ich wartości kombinacyjnej, sterowanie kolekcjonowaniem materiałów w celu uniknięcia dublowania i podnoszenia kosztów utrzymywania kolekcji; przewidywanie trudności przy krzyżowaniu oddalonym na podstawie wykrytego dystansu genetycznego, identyfikacja produktów somatycznej hybrydyzacji (heterokariontów); identyfikacja ras patogenów grzybów, szczepów bakterii oraz gatunków i patotypów różnych szkodników. 33
Eliminacja maskującego różnice genetyczne wpływu środowiska. Ułatwienie pracochłonnej selekcji cech ilościowych (biometrycznych). Umożliwienie selekcji w stadium siewki cech ujawniających się w późniejszych fazach rozwoju roślin, eliminacja niepożądanych pojedynków, obniżenie kosztów programów hodowlanych. Możliwość skutecznej selekcji roślin rosnących w warunkach nietypowych np. fitotron, w szklarni w okresie zimowym. Uniezależnienie się w hodowli odpornościowej od pracochłonnych, zawodnych i kosztownych testów. Podstawowe zastosowania markerów molekularnych w badaniach genetycznych i programach hodowlanych Tworzenie i wysycanie map genetycznych różnych gatunków roślin. Praktyczne wykorzystanie markerów genetycznych wymaga znajomości ich dystrybucji w genomie, a więc ich kolejności ułożenia na chromosomach wraz ze względnymi odległościami dzielącymi poszczególne loci markerów, co zapewniają wysoce kompletne i równomiernie nasycone markerami mapy genetyczne. Markery molekularne są wykorzystywane jako bardzo dogodne narzędzie do sporządzania samoistnych map genetycznych i wysycania zintegrowanych map genetycznych (zawierających loci klasyczne morfologiczne oraz loci markerów izoenzymatycznych i loci markerów DNA). Opracowanie map genetycznych odbywa się w oparciu i zapoczątkowaną przez T. Morgana (1920) analizę sprzężeń. Sprzężenia to utrwalone kombinacje alleli w chromosomach, które odzwierciedlają gamety rodzicielskie. Sprzężenia mają zwykle charakter częściowy i z określoną, stałą dla danej pary loci częstością wytwarzane są gamety o innych jak u form rodzicielskich układzie alleli na chromosomach rekombinacja genetyczna będąca wynikiem crossing over między chromatydami chromosomów homologicznych. Częstość co między dwoma punktami chromosomów homologicznych jest proporcjonalna do odległości dzielącej te punkty 1% crossing over = 1 cm. 34
Mapy takie powstają na podstawie analizy populacji segregującej uzyskanych w wyniku przekrzyżowania form polimorficznych pod względem mapowanych cech (fragmenty DNA prążki na żelu) strategie z wykorzystaniem: (1) pokolenie F2 ewentualnie F3 uzyskane w wyniku samozapylenia F1, (2) pokolenie Bc1 powstałe z przekrzyżowania F1 z jedną z form rodzicielskich, (3) zrekombinowane linie wsobne RILs (ang. recombinant inbred lines) powstałe w wyniku kilkukrotnego samozapylenia poszczególnych osobników pokolenia F2, (4) linii podwojonych haploidów (DH) uzyskanych w wyniku kultur mikrospor pokolenia F1. Informatywność mapy genetycznej jest zależna od stopnia i równomierności jej wysycenia przez loci markerów genetycznych. Możliwość generowania ogromnej ilości markerów molekularnych zrodziła konieczność automatyzacji procesu mapowania. Obliczanie częstości rekombinacji, odległości mapowych, określanie grup sprzężeń i ułożenia loci są wykonywane przy użyciu specjalnych pakietów oprogramowania komputerowego (MapMaker, Linkage 1, GMendel). Wykorzystanie map: (1) loci genów ważnych dla hodowcy zostały otoczone łatwymi do identyfikacji markerami molekularnymi DNA, co stwarza możliwość selekcji z wykorzystaniem małego fragmentu rośliny bez jej niszczenia i w dowolnej fazie rozwojowej, (2) pominięcie często bardzo pracochłonnych biologicznych testów odpornościowych oraz możliwość prowadzenia jednoczesnej selekcji na kilka patogenów, (3) monitorowanie QTL i przenoszonych w procesie wielokrotnego krzyżowania wstecznego pożądanych cech donora w stadium siewki, (4) monitorowanie fragmentów genomu donora, które mogą zawierać geny determinujące niepożądane cechy dawcy, (5) uzależnienie się w selekcji od warunków środowiska, co wpływa na zwiększenie skuteczności hodowli. Liczne markery molekularne DNA generowane różnymi technikami zawierają zintegrowane mapy większości ważnych gospodarczo gatunków roślin. Badania homologii pomiędzy bardziej i mniej spokrewnionymi gatunkami roślin. Określanie stopnia pokrewieństwa i dystansu genetycznego badanych obiektów. Ustalanie filogenezy i taksonomii badanych obiektów. Monitorowanie rearanżacji genomowych, które zaszły w toku ewolucji porównywanych taksonów. 35
Opracowano dendrogramy pokrewieństwa dla wielu rodzajów roślin z uwzględnieniem zarówno ważnych gospodarczo gatunki uprawne, jak i gatunki dzikie, co pozwala na zoptymalizowanie wykorzystania w hodowli istniejących zasobów genowych np. przy wyborze do krzyżowania najwłaściwszych donorów pożądanych cech. Identyfikacja genetyczna odmian, linii, rodów hodowlanych. Efektywne zarządzanie zasobami genowymi w bankach genów, kolekcjach państwowych i roboczych oraz w warunkach in situ. Identyfikacja genetyczna odmian, linii, rodów czy szczególnie cennych osobników poprzez stworzenie typowych, charakterystycznych tylko dla nich wzór profili amplifikacyjny. Otwiera to duże możliwości w ochronie wartości intelektualnej w pracach hodowlanych. Ocena czystości nasion odmian, mieszańców heterozyjnych i ich komponentów. Ocena genetyczna haploidów (H) i podwojonych haploidów (DH) detekcja zmienności somaklonalnej. Dobór komponentów mieszańców heterozyjnych. Identyfikacja i charakterystyka patogenów. Markery molekularne nie są jednakowe. Żaden nie jest idealny. W zależności od celu, jedne są lepsze od innych. Jednakże, są one o wiele korzystniejsze przy mapowaniu od markerów morfologicznych i znajdują szerokie zastosowanie zarówno w hodowli jak i filogenetyce. 36
37