Adam Dawidowski Klasa III b. mgr Beata Ulczyńska

Podobne dokumenty
E.coli Transformer Zestaw do przygotowywania i transformacji komórek kompetentnych Escherichia coli

Ćwiczenie 5 Klonowanie DNA w wektorach plazmidowych

października 2013: Elementarz biologii molekularnej. Wykład nr 2 BIOINFORMATYKA rok II

Klonowanie molekularne Kurs doskonalący. Zakład Geriatrii i Gerontologii CMKP

ĆWICZENIA Z MECHANIZMÓW DZIAŁANIA WYBRANYCH GRUP LEKÓW

Techniki molekularne w mikrobiologii SYLABUS A. Informacje ogólne

E.coli Transformer Kit

Nowoczesne systemy ekspresji genów

Polimeraza Taq (1U/ l) 1-2 U 1 polimeraza Taq jako ostatni składniki mieszaniny końcowa objętość

Instrukcje do ćwiczeń oraz zakres materiału realizowanego na wykładach z przedmiotu Inżynieria bioprocesowa na kierunku biotechnologia

Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA

Ćwiczenie 7 Klonowanie DNA w wektorach plazmidowych

Proteomika: umożliwia badanie zestawu wszystkich lub prawie wszystkich białek komórkowych

Ćwiczenie 3. Amplifikacja genu ccr5 Homo sapiens wykrywanie delecji Δ32pz warunkującej oporność na wirusa HIV

Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA

wykład dla studentów II roku biotechnologii Andrzej Wierzbicki

Rok akademicki: 2014/2015 Kod: EIB BN-s Punkty ECTS: 3. Kierunek: Inżynieria Biomedyczna Specjalność: Bionanotechnologie

Regulacja Ekspresji Genów

Inżynieria Genetyczna ćw. 3

Zasady oceniania rozwiązań zadań 48 Olimpiada Biologiczna Etap centralny

KLONOWANIE DNA REKOMBINACJA DNA WEKTORY

Geny i działania na nich

Escherichia coli. System pbad

Informacje dotyczące pracy kontrolnej

Wybrane techniki badania białek -proteomika funkcjonalna

Wykład 14 Biosynteza białek

SYLABUS. Wydział Biologiczno-Rolniczy. Katedra Biochemii i Biologii Komórki

Dr. habil. Anna Salek International Bio-Consulting 1 Germany

WYKRYWANIE OBECNOŚCI BAKTERII Z RODZAJU LISTERIA W ŻYWNOŚCI

Wybrane techniki badania białek -proteomika funkcjonalna

Laboratorium 7. Testy na genotoksyczność

Metody badania ekspresji genów

Saccharomyces Transformer Kit zestaw do przygotowywania i transformacji komórek kompetentnych Saccharomyces cerevisiae. Metoda chemiczna.

Drożdżowe systemy ekspresyjne

Zakład Biologii Molekularnej Wydział Farmaceutyczny, WUM ul. Banacha 1, Warszawa. Zakład Biologii Molekularnej

ĆWICZENIE 1 i 2 Modyfikacja geu wołowej beta-laktoglobuliny przy użyciu metody Overlap Extension PCR (wydłużania nakładających się odcinków)

Spis treści. Wstęp. Obiekt. Pracownia Biologii Molekularnej. Część II. Ekspresja i oczyszczanie białek

Bezpośrednia embriogeneza somatyczna

SCENARIUSZ LEKCJI BIOLOGII Z WYKORZYSTANIEM FILMU

SCENARIUSZ LEKCJI BIOLOGII Z WYKORZYSTANIEM FILMU Transkrypcja RNA

WPROWADZENIE DO GENETYKI MOLEKULARNEJ

Analizy DNA in silico - czyli czego można szukać i co można znaleźć w sekwencjach nukleotydowych???

WPROWADZENIE DO GENETYKI MOLEKULARNEJ

SYLABUS. Wydział Biologiczno-Rolniczy. Katedra Biochemii i Biologii Komórki

Przynieść kalkulator, jeden na osobę (nie w telefonie!)

TATA box. Enhancery. CGCG ekson intron ekson intron ekson CZĘŚĆ KODUJĄCA GENU TERMINATOR. Elementy regulatorowe

Ćwiczenie 2. Identyfikacja płci z wykorzystaniem genu amelogeniny (AMGXY)

AmpliTest Babesia spp. (PCR)

ĆWICZENIE 5 MECHANIZMY PROMUJĄCE WZROST ROŚLIN

Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA

wykład dla studentów II roku biotechnologii Andrzej Wierzbicki

Zakład Biologii Molekularnej, Wydział Farmaceutyczny, WUM.

woda do 1000 ml ph=6,9-7,1. Po sterylizacji dodać nystatynę (końcowe stężenie ok. 50 μg/ml). Agar z wyciągiem glebowym i ekstraktem drożdżowym (YS)

Zakład Biologii Molekularnej, Wydział Farmaceutyczny, WUM.

Zestaw do wykrywania Anaplasma phagocytophilum w kleszczach, krwi i hodowlach komórkowych

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

TECHNIKI ANALIZY RNA TECHNIKI ANALIZY RNA TECHNIKI ANALIZY RNA

(12) O PIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1

Na tej pracowni wyjątkowo odpowiedzi na zadania należy udzielić na osobnym arkuszu odpowiedzi.

Biologia Molekularna Podstawy

bi ~ Zestaw dydal<tyczny umożliwiający przeprowadzenie izolacji genomowego DNA z bakterii EasyLation Genomie DNA INSTRUI<CJA DLA STUDENTÓW

2. Enzymy pozwalające na manipulację DNA a. Polimerazy DNA b. Nukleazy c. Ligazy

Metody analizy genomu

Co to jest transkryptom? A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 2

Plan ćwiczeń wykonywanych w ramach Pracowni Biologii Molekularnej, część II Ekspresja i oczyszczanie białek.

PROJEKT WSPÓŁFINANSOWANY PRZEZ UNIĘ EUROPEJSKĄ Z EUROPEJSKIEGO FUNDUSZU ROZWOJU REGIONALNEGO 1 z 7

Translacja i proteom komórki

1. Na podanej sekwencji przeprowadź proces replikacji, oraz do obu nici proces transkrypcji i translacji, podaj zapis antykodonów.

Inżynieria genetyczna- 6 ECTS. Inżynieria genetyczna. Podstawowe pojęcia Część II Klonowanie ekspresyjne Od genu do białka

Making the impossible possible: the metamorphosis of Polish Biology Olympiad

Zestaw do wykrywania Chlamydia trachomatis w moczu lub w kulturach komórkowych

Analizy DNA in silico - czyli czego można szukać i co można znaleźć w sekwencjach nukleotydowych???

AUTOREFERAT. 1. Imię, nazwisko. Beata Furmanek-Blaszk

Zestaw do wykrywania Babesia spp. i Theileria spp. w kleszczach, krwi i hodowlach komórkowych

6. Z pięciowęglowego cukru prostego, zasady azotowej i reszty kwasu fosforowego, jest zbudowany A. nukleotyd. B. aminokwas. C. enzym. D. wielocukier.

Biologia Molekularna z Biotechnologią ===============================================================================================

wykład dla studentów II roku biotechnologii Andrzej Wierzbicki

Ryc 1. Budowa operonu laktozowego.

Wprowadzenie. DNA i białka. W uproszczeniu: program działania żywego organizmu zapisany jest w nici DNA i wykonuje się na maszynie białkowej.

Program ćwiczeń z inżynierii genetycznej KP-III rok Biologii

Definicje. Białka rekombinowane (ang. recombinant proteins, r-proteins) Ukierunkowana mutageneza (ang. site-directed/site-specific mutagenesis)

TRANSLACJA II etap ekspresji genów

Recenzja rozprawy doktorskiej mgr Olgi Żołnierkiewicz pt. Chemiczna synteza zoptymalizowanego genu taqiirm:

ĆWICZENIA Z BIOCHEMII

ENZYMY RESTRYKCYJNE ENZYMY RESTRYKCYJNE CZYM RÓŻNIĄ SIĘ POSZCZEGÓLNE ENZYMY? nazewnictwo: EcoRV

Prowadzący: dr Lidia Boss znacznik fluorescencyjny (np. SYBR Green II)

WYNALAZKI BIOTECHNOLOGICZNE W POLSCE. Ewa Waszkowska ekspert UPRP

47 Olimpiada Biologiczna

Zestaw do izolacji plazmidowego DNA

DEZINTEGRACJA ULTRADŹWIĘKOWA

The Role of Maf1 Protein in trna Processing and Stabilization / Rola białka Maf1 w dojrzewaniu i kontroli stabilności trna

Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA

Ocena ekspresji genów proangiogennych w komórkach nowotworowych OVP-10 oraz transfektantach OVP-10/SHH i OVP-10/VEGF

DNA musi współdziałać z białkami!

Elektroforeza kwasów nukleinowych

Sylabus Biologia molekularna

Ekspresja genów heterogenicznych w drożdżach Pichia pastoris

Zestaw do izolacji plazmidowego DNA. Nr kat. EM01 Wersja zestawu:

Transformacja pośrednia składa się z trzech etapów:

Transkrypt:

Adam Dawidowski Klasa III b (autor) mgr Beata Ulczyńska (opiekun)

BADANIE WPŁYWU GENU orf654 Z OPERONU mboii NA ZJAWISKO PRZESUNIĘCIA RAMKI ODCZYTU TRANSLACJI -1 W ZMUTOWANYM GENIE mboiim2δ

I Akademickie Liceum Ogólnokształcące im. Zasłużonych Ludzi Morza ul Narcyzowa 6 81-653 Gdynia (szkoła)

STRESZCZENIE W celu zbadania wpływu genu orf654 na powstawanie zjawiska przesunięcia ramki odczytu rybosomów (PROT) podczas translacji mrna genu mboiim2δ dzięki uprzejmości prof. dr hab. Mariana Sęktasa z Katedry Mikrobiologii Uniwersytetu Gdańskiego podjąłem projekt badawczy pod jego kierunkiem. Projekt polegał na założeniu hodowli komórek trzech szczepów pałeczki okrężnicy (Escherichia coli Tuner (DE3) ). Pierwszy szczep był nosicielem plazmidu zawierającego gen metylotransferazy DNA MboII (mboiim2) dzikiego typu, drugi szczep zawierał komórki z plazmidem kodującym gen mboiim2δ z mutacją wywołującą zaburzenia procesu translacji (PROT) wraz z genem orf654 o nieznanej funkcji, a w trzecim szczepie znajdował się plazmid zawierający gen mboiim2δ. Otrzymane hodowle komórek poddano lizie a następnie wszystkie wyprodukowane białka rozdzielono za pomocą metody elektroforetycznej w żelu poliakryloamidowym. Analiza żelu wykazała, że białko metylotransferazy o normalnej masie (32 kda) jest produkowane przez wszystkie trzy szczepy. Następnie sprawdzono czy produkowane białko jest aktywne biologicznie wykorzystując metodę analizy protekcji wyizolowanego z komórek poszczególnych szczepów plazmidowego DNA przed trawieniem endonukleazą R.MboII, przed i po indukcji ekspresji genów mboiim2. Doświadczenie wykazało, że syntezowana metylotransfreaza jest aktywna i chroni plazmid przed cięciem endonukleazy restrykcyjnej we wszystkich przypadkach, co pokazuje, że obecność genu orf654 jest zbędna do zaistnienia zjawiska PROT. WSTĘP Translacja jest podstawowym procesem biochemicznym zachodzącym w komórkach żywych. Umożliwia produkcje białek strukturalnych i enzymatycznych istotnych w funkcjonowaniu komórki. W komórkach prokariotycznych funkcjonalnie pokrewne geny są zebrane w operony. W przeważającej liczbie przypadków, proces translacji to odczytywanie kolejnych tripletów nukleotydowych, kodujących kolejne aminokwasy budujące strukturę kodowanego białka, od kodonu startowego AUG do kodonu stopu (3 różne). Odbywa sie w sposób ciągły, bez ominięć bądź przeskoków. Zjawisko przesunięcia ramki odczytu translacji jest unikatowe, rzadkie i wiąże się z nieciągłym sposobem odczytywania informacji genetycznej przez rybosomy. Opisywane zjawisko ma miejsce w przypadku genu kodującego metylotransferazę DNA M2.MboII. Ekspresja genu mboiim2δ zawierającego delecję pojedynczego nukleotydu z plazmidu zawierającego dodatkowo gen orf654, powinna dać produkcję zmniejszonego wariantu białka M2.MboII o masie 14,5 kda oraz białka Orf654 o masie 25 kda. Nieoczekiwanie jest produkowane również białko dzikiego typu o masie 32 kda. Być może zjawisko to jest odpowiedzią komórki na zachodzącą mutację - w ten sposób może ona nadal produkować potrzebne białko. Celem tej pracy jest zbadanie czy obecność genu (białka) orf654 jest niezbędna w procesie przesunięcia ramki odczytu translacji. Projekt ma na celu ustalenie wpływu genu wraz z zawartą w nim sekwencją krzyżową znajdującą się za miejscem delecji. Wydaje się, że sekwencja krzyżowa przez swoją specyficzną budowę mogłaby oddziaływać na proces translacji. Ryc. 1. Struktura genetyczna operonu mboiirm z Moraxella bovis

Materiał badawczy: Escherichia coli Tuner (DE3) królestwo typ klasa rząd rodzina rodzaj gatunek Materiały: MATERIAŁY I METODY wytrząsarka wodna, aparat do rozdziału w żelu akryloamidowym i żelu agarozowym, zasilacz prądu, łaźnia wodna, inkubator, system fotodokumentacji Metody: Komórka kompetentna bacteria proteobakterie gammaproteobakterie Enterobacteriales Enterobacteriaceae Escherichia Escherichia coli królestwo typ klasa rząd rodzina rodzaj gatunek transformacja komórek kompetentnych plazmidowym DNA, hodowla komórek trans formantów w pożywce LB i LA(pożywki wzrostowe LA: ekstraktu drożdżowego, peptonu bakteriologicznego, NaCl. LB zawiera dodatkowo agar), elektroforetyczny rozdział lizatów komórkowych w żelu poliakryloamidowym, barwienie żelu poliakrylamidowego roztworem barwnika Coomassie Brilliant Blue, oczyszczanie plazmidowego DNA metodą lizy alkalicznej, trawienie plazmidowego DNA enzymami restrykcyjnymi, rozdział elektroforetyczny próbek DNA na żelu agarozowym.(1) DOŚWIADCZENIE I Fragment operonu bacteria proteobakterie Gammaproteobakterie Pseudomonadales moraxellaceae moraxella Moraxella bovis Do przygotowanych wcześniej komórek kompetentnych E. coli Tuner(D3) wprowadzono trzy rodzaje plazmidowego DNA (B1 - plazmid z genem kodującym metylotransferazę DNA M2.MboII, ΔBP - plazmid ze zmutowanym genem M2.MboIIΔ i genem orf654 oraz plazmid ΔB4 ze zmutowanym genem M2.MboII). Każdą z prób inkubowano w łaźni lodowej przez 30 minut, następne przeprowadzono szok cieplny w 42 C trwający 3 minuty. Dodano pożywkę LB i wytrząsano w 37 C przez 45 minut. Następnie wysiano mieszaniny bakteryjne na płytki z podłożem LA i antybiotykiem kanamycyną, używając do tego celu jałowej głaszczki szklanej. Płytki inkubowano w cieplarce w 37 C do momentu pojawienia się wyraźnych kolonii bakteryjnych (około 15 godzin). Pobrano pojedyncze kolonie i umieszczono je w kolbach z płynną pożywką i kanamycyną. Po jednej godzinie każdą z 3 hodowli podzielono na próbę kontrolną i próbę badawczą z dodatkiem IPTG (syntetyczny analog galaktozy indukujący ekspresję operonu lac w E. coli) tak uzyskane 6 roztworów pozostawiono na 2h. Następnie każdy roztwór umieszczono w dwóch probówkach i poddano wirowaniu w celu oddzielenia pożywki od komórek bakterii. Po usunięciu pożywki z nad osadu komórek, próbki zamrożono do elektroforezy. Następnego dnia do próbek dodano składnika redukującego i gotowano w celu denaturacji białek. Następnie każdą z próbek umieszczono w kolumnach żelu poliakrylamidowego. Rozdział elektroforetyczny przeprowadzono przy natężeniu prądu 30-40 ma przez 2,5h. Następnie żel poddano barwieniu roztworem barwnika Coomassie Brilliant Blue przez 30 min. żel sfotografowano w świetle UV z odpowiednim filtrem.

DOŚWIADCZENIE II Następnie z hodowli indukowanych i nieindukowanych ΔB4 wyizolowano DNA plazmidowy w celu oceny stopnia jego modyfikacji specyficznej metylotransferazą M2.MboII. Do obu prób dodano enzymu endonukleazy restrykcyjnej MboII. Po trawieniu próbki DNA wprowadzono do odpowiednich studzienek w żelu agarozwym. Elektroforezę przeprowadzono przy natężeniu prądu 40mA przez 1,5h. Po zakończeniu rozdziału w żelu prążki DNA z barwnikiem bromkiem etydyny sfotografowano w świetle UV (412 nm) przy użyciu systemu do fotodokumentacji. WYNIKI Elektroforeza umożliwia poznanie składu białkowego komórki, której białka rozdzielane są pod względem masy. Na żelu otrzymanym w doświadczeniu I frakcje białek przyrównujemy do wzorca białkowego znajdującego się po jego prawej stronie. W celu sprawdzenia czy białko o danej masie jest produkowane. Wnioski: białko M2.MboII produkowane jest w każdej z prób białko z genu orf654 produkowane jest tylko w próbie ΔBP

WYNIKI c.d. Otrzymane preparaty plazmidowego DNA z doświadczenia II na żelu agarozowym ukazują stan modyfikacji DNA podczas represji i indukcji operonu laktozowego kodującego metylazę. Każdą z prób podzielono na próbę kontrolną i próbę zawierającą endonukleazę. Według założeń próba indukowana powinna zawierać zmetylowane plazmidy odporne na trawienie enzymem, natomiast przy represji niezmetylowane plazmidy powinny zostać strawione. Strawione DNA widzimy w próbie + represji. Wnioski: podczas represji białko metylotransferazy nie jest syntezowane, stąd miejsca GAAGA nie są modyfikowane i ulegają degradacji plazmidowego DNA, po indukcji genu w próbie ΔB4 jest produkowane białko dzikiego typu M2.MboII i metyluje plazmid chroniąc go przed degradacją endonukleazą restrykcyjną. Ryc. 3. Schemat doświadczenia oraz obraz żelu agarozowego

DYSKUSJA Zjawisko przesunięcia ramki odczytu translacji jest stosunkowo nowym odkryciem. Opisał to Philip J. Farabaugh w 1996r (3).W omawianym przykładzie w genie mboiim2 z bakterii Moraxella bovis zaszła mutacja - delecji adeniny z nici DNA. W wyniku czego następuje całkowita zmiana kolejności i rodzaju tripletów nukleotydowych oraz powstanie kodonu STOP kończącego proces translacji. Efektem tego jest zmiana sekwencji i ilości aminokwasów w białku - produkcja krótszego i nieaktywnego białka. Badania wykazują jednak, że produkowane jest krótsze jak i dłuższe białko. Pewien procent zachodzących translacji produkuje białko o takiej sekwencji aminokwasów jak w genie bez mutacji - dzikiego typu (WT). Tłumaczy to zjawisko przesunięcia ramki odczytu, które występuje najprawdopodobniej w miejscu delecji dzięki czemu produkowane jest pełne białko z niezmienioną sekwencją aminokwasów. Jest to sytuacja analogiczna jak w wirusach infekujących organizmy eukariotyczne opisanych w źródle (4) w roku 1985 - była to pierwsza publikacja dotycząca przesunięcia ramki odczytu translacji. Ryc. 4. Zmiana sekwencji aminokwasów po zajściu delecji nukleotydu (Δ).

DYSKUSJA c.d. Rycina 4. przedstawia sekwencję zasad azotowych w nici DNA przed jaki i po delecji adeniny. Pogrubiona sekwencja zasad AAAAACA jest układem podatnym na zjawisko przesunięcia ramki odczytu translacji (5). Opisywany operon koduje białka metylaz, które chronią plazmid przed trawieniem przez metylację specyficznych odcinków DNA o sekwencji GAAGA (2). Przeprowadzone doświadczenia wykazały, że białko MboII produkowane jest w zarówno w nici DNA z genem orf654 jak i w nici DNA bez tego genu. Co oznacza, że gen orf654 z operonu kodującego determinantę R-M MboII z Moraxella bovis nie wpływa na zjawisko przesunięcia ramki odczytu translacji -1 w zmutowanym genie mboiim2 w komórkach Escherichia coli. Proces translacji przebiegał następująco: Ryc. 5. Sekwencja aminokwasów w zmutowanym genie mboiim2 PIŚMIENNICTWO 1. MOLECULAR CLONING a laboratory manual second edition J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Moniatis Cold Spring Harboor Laboratory Prees (1989). 2. Furmanek-Blaszk B., Boratyński R., Żółcińska N i Sęktas M. (2009). M1.MboII and M2.MboII type IIS methyltransferases: different specificities, the same target Microbiology, 155, 1111 1121 3. Farabaugh P. J. (1996). Programmed Translational Frameshifting Microbiological reviews, p. 103 134 4. Jacks T, Varmus HE (1985). Expression of the Rous sarcoma virus pol gene by ribosomal frameshifting, Science 230(4731):1237-42. 5. Edwin B. Ten Dam, Cornelius W.A. Pleij, And Leendert Bosch (1990) RNA Pseudoknots: Translational Frameshifting and Readthrough on Viral RNAs, Virus Genes 4:2, 121-136,