(12) OPIS PATENTOWY (19) PL

RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (21) Numer zgłoszenia: 320091 (22) Data zgłoszenia: 13.11.1995 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: 13.11.1995, PCT/US95/14899 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: 23.05.1996, WO96/15241, PCT Gazette nr 23/96 (11) 184839 (13) B1 (51) IntCl7 A61K 39/04 C12N 15/11 C12N 15/31 C12R 1:32 (54) Szczepionka DNA i zastosowanie polinukleotydu do jej wytwarzania (30) Pierwszeństwo: 14.11.1994,US,08/338,992 (73) U p r a w n i o n y z patentu: MERCK & CO., INC., Rahway, US N.V.INNOGENETICS S.A., Ghent, BE (43) Zgłoszenie ogłoszono: 15.09.1997 BUP 19/97 (72) T w ó r c y wynalazku: Margaret A. Liu, Rahway, US Donna Montgomery, Rahway, US Jeffrey Ulmer, Rahway, US Jean Content, Ghent, BE Kris Huygen, Ghent, BE (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 31.12.2002 WUP 12/02 (74) Pełnomocnik: Kruszewski Adam A., PATPOL Spółka z o.o. PL 184839 B1 (57) 1. Szczepionka DNA, zaw ierająca polinukleotyd do im m unizacji i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik, która wywołuje po wprowadzeniu do tkanki kręgowca jedną lub wiele odpowiedzi odpornościow ych przeciw ko M ykobakteriom, w ybranych z grupy obejmującej przeciwciała, CTL, odpow iedź limfocytów T pom ocniczych i ochronnych odpowiedzi odpornościowych, znam ienna tym, że polinukleotyd obejmuje jeden lub wiele genów kodujących jeden lub w iele białek M ykobakterii albo ich funkcjonalnych rów noważników, z grupy obejmującej antygen 85A, 85B i/lub 85C oraz ich funkcjonalne równoważniki, połączonych funkcjonalnie z prom otoram i transkrypcyjnym i. 4. Zastosowanie polinukleotydu obejmującego jeden lub wiele genów kodujących jeden lub wiele białek Mykobakterii albo ich funkcjonalnych równoważników, z grupy antygenu 85A, 85B i/lub 85C oraz ich funkcjonalne rów now ażniki, połączonych funkcjonalnie z promotorami transkrypcyjnym i, do wytw arzania szczepionki do w ywołania odpowiedzi odpornościowej u kręgow ca przeciwko epitopom M ykobakterii.

Szczepionka DNA i zastosowanie polinukleotydu do jej wytwarzania Zastrzeżenia patentowe 1. Szczepionka DNA, zawierająca polinukleotyd do immunizacji i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik, która wywołuje po wprowadzeniu do tkanki kręgowca jedną lub wiele odpowiedzi odpornościowych przeciwko Mykobakteriom, wybranych z grupy obejmującej przeciwciała, CTL, odpow iedź limfocytów T pom ocniczych i ochronnych odpowiedzi odpornościowych, znam ienna tym, że polinukleotyd obejmuje jeden lub wiele genów kodujących jeden lub wiele białek M ykobakterii albo ich funkcjonalnych równoważników, z grupy obejmującej antygen 85A, 85B i/lub 85C oraz ich funkcjonalne rów noważniki, połączonych funkcjonalnie z prom otoram i transkrypcyjnymi. 2. Szczepionka DNA według zastrz. 1, znam ienna tym, że gen koduje białko M ycobacterium tuberculosis i jego funkcjonalne równoważniki, z grupy antygenu 85A, 85B i/lub 85C oraz ich funkcjonalne równoważniki. 3. Szczepionka DNA według zastrz. 2, znam ienna tym, że gen koduje białko wybrane z grupy obejmującej antygen 85A, 85B i/lub 85C oraz ich funkcjonalne równoważniki. 4. Zastosowanie polinukleotydu obejmującego jeden lub wiele genów kodujących je - den lub wiele białek M ykobakterii albo ich funkcjonalnych równoważników, z grupy antygenu 85A, 85B i/lub 85C oraz ich funkcjonalne równoważniki, połączonych funkcjonalnie z promotorami transkrypcyjnymi, do wytwarzania szczepionki do wywołania odpowiedzi odpornościowej u kręgow ca przeciw ko epitopom M ykobakterii. 5. Zastosowanie według zastrz. 4, znam ienne tym, że gen koduje białko Mycobacterium tuberculosis i jego funkcjonalne równoważniki. 6. Zastosowanie według zastrz. 5, znam ienne tym, że gen koduje białko wybrane z grupy obejmującej antygen 85A, B i/lub C oraz ich funkcjonalne równoważniki. 7. Szczepionka D NA, zaw ierająca polinukleotyd i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik, zn am ienna tym, że jako substancję czynną obejmuje polinukleotyd obejmujący: a) eukariotyczny prom otor transkrypcyjny; b) otwartą ramkę odczytu połączoną funkcjonalnie z promotorem, kodującą jeden lub wiele epitopów m ykobakterii i sygnał przerwania translacji; i c) ewentualnie jeden lub w iele 1RES połączonych funkcjonalnie, jed n ą lub wiele ramek odczytu kodujących jeden lub wiele dodatkowych genów, oraz jeden lub wiele sygnałów przerywających transkrypcję. 8. Szczepionka DNA według zastrz. 7, znam ienna tym, że polinukleotyd zawiera dodatkowe geny z punktu c) które są genami immunomodulującymi albo immunostymulującymi wybranymi z grupy obejmującej GM-CSF, IL-12, interferon i członków rodziny B7 białek kostymulujących limfocyty T. 9. Szczepionka DNA według zastrz. 7, znam ienna tym, że polinukleotyd zawiera gen mykobakteryjny z punktu a) który koduje białko M ycobacterium tuberculosis i jego funkcjonalne równoważniki. 10. Szczepionka DNA według zastrz. 7, znam ienna tym, że polinukleotyd zawiera gen mykobakteryjny z punktu a) który koduje białko Mycobacterium tuberculosis wybrane z grupy obejmującej antygen 85A, B i/lub C oraz ich funkcjonalne równoważniki. 11. Szczepionka DNA według zastrz. 7, znam ienna tym, że polinukleotyd zawiera dodatkowe geny z punktu c) które są genami Mycobacterium tuberculosis wybranymi z grupy obejmującej antygen 85A, B i/lub C oraz ich funkcjonalne równoważniki. * * *

184 839 3 Przedmiotem wynalazku jest szczepionka DNA do wywoływania reakcji odpornościowej przeciwko Mykobakteriom w organizmie kręgowca, zawierająca polinukleotyd kodujący białka M ykobakterii oraz nośnik dopuszczalny farmaceutycznie. Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie polinukleotydu do wytwarzania szczepionki DNA. Główną przeszkodą w opracowaniu szczepionek przeciwko wirusom albo bakteriom, szczególnie tym o licznych serotypach albo w ysokim tem pie mutacji, przeciw ko którym pożądane jest wywołanie przeciwciał neutralizujących i/lub ochronnej odpowiedzi komórkowej, jest zmienność białek zewnętrznych pomiędzy różnymi izolatami albo szczepami. Ponieważ limfocyty T cytotoksyczne (CTL) u myszy i ludzi są zdolne do rozpoznaw ania epitopów uzyskanych z zakonserwowanych wewnętrznych białek wirusowych (J.W. Yewdell i in. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82, 1785 (1985); A.R.M. Townsend i in. Cell 44, 959 (1986); A. J. McMichael i in., J. Gen. Virol. 67, 719 (1986); J. Bastin i in., J. Exp. Med. 165, 1508 (1987); A.R.M. Townsend i H. Bodmer, Annu. Rev. Immunol. 7, 601 (1989)) i uważa się je za istotne w odpowiedzi odpornościowej przeciwko wirusom (Y.-L. Lin i B.A. Askonas, J. Exp. Med. 154, 225 (1981); I. Gardner i in., Eur. J. Immunol. 4, 68 (19740; K.L. Yap i G.L. Ada, N ature 273, 238 (1978); A. J. M cm ichael i in., New Engl. J. Med. 309, 13 (1983); P.M. Taylor i B.A. Askonas, Immunol. 58, 417 (1986)), wysiłki skierowano na opracowanie szczepionek CTL zdolnych do zapewnienia heterologicznej ochrony przeciwko różnym szczepom wirusa. Wiadomo, że CTL niszczą komórki zakażone wirusem albo bakterią, gdy ich receptory limfocyta T rozpoznają obce peptydy związane z cząsteczkami MHC klasy I i/lub klasy II. Peptydy te m ogą być otrzym ane z białek syntetyzowanych endogennie, niezależnie od um iejscowienia i funkcji białka w patogenie. Przez rozpoznanie epitopów w zakonserwowanych białkach CTL m ogą zapewnić ochronę heterologiczną. W przypadku bakterii w ew nątrzkomórkowych, białka wydzielane albo uwalniane z bakterii ulegają opracowaniu i prezentacji przez cząsteczki MHC klasy I i II, wywołując w ten sposób odpowiedź limfocytów T, która może odgrywać rolę w redukcji albo eliminacji zakażenia. W większości wysiłków w kierunku wytworzenia odpowiedzi CTL stosowano wektory replikujące w celu wytworzenia antygenu białkowego wewnątrz komórki (J.R. Bennink i in., ibid. 311, 578 (1984); J.R. Bennink i J.W. Yewdell, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 163, 153 (1990); C.K. Stover i in. Nature 351, 456 (1991); A. Aldovini i R.A. Young, Nature 351, 479 (1991); R. Schafer i in., J. Immunol. 149, 53 (1992); C.S. Hahn i in. Proc. Natl. Acad. Sei. U SA 89, 2679 (1992)) albo skupiano się na w prow adzeniu peptydów do cytozolu (F.R. Carbone i M.J. Bevan, J. Exp. Med. 169, 603 (1989); K. Deres i in., Nature 342, 561 (1989); H. Takahashi i in., ibid. 344, 873 (1990); D.S. Collins i in., J. Immunol. 148, 3336 (1992); M.J. Newman i in., ibid. 148, 2357 (1992)). Oba te podejścia m ają ograniczenia, które m ogą zmniejszać ich użyteczność jako szczepionki. W ektory retrow irusow e m ają ograniczenia co do wielkości i budowy polipeptydów, które m ogą być ekspresjonowane jako białka fuzyjne, przy zachowaniu zdolności rekombinowanych wirusów do replikacji (A.D. Miller, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158, 1 (1992)), zaś skuteczność wektorów takich jak wirus krowianki w następnych szczepieniach może być osłabiona przez odpowiedź odpornościową przeciwko wirusowi krowianki (E.L. Cooney i in. Lancet 337, 567 (1991). Tak więc, wektory wirusowe i zmodyfikowane patogeny niosą związane ze sobą ryzyko, które m oże negatywnie wpływać na ich zastosowanie u ludzi (R.R. Redfield i in., New Engl. J. Med. 316, 673 (1987); L. Mascola i in., Arch. Intern. Med. 149, 1569 (1989)). Ponadto, wybór epitopów peptydowych do prezentacji zależy od budowy antygenów MHC osobnika i stąd szczepionki peptydowe m ogą mieć ograniczoną skuteczność z powodu różnorodności haplotypów HLA w nie w sobnych populacjach. Benvenisty N. i R eshef L. (PNAS 83, 9551-9555, (1986)) wykazali, że D N A precypitowany CaCl2 podawany myszom dootrzewnowo (i.p.), dożylnie (i.v.) albo domięśniowo (i.m.) może ulegać ekspresji. Wstrzyknięcie domięśniowe (i.m.) wektorów ekspresyjnych DNA u myszy powoduje, co wykazano, wychwyt DNA przez komórki m ięśniowe i ekspresję białka kodowanego przez DNA (J.A. W olff i in., Science 247, 1465 (1990);

4 184 839 G. Ascardi i in.(nature 352, 815 (1991)). Wykazano, że plazmidy m ogą być utrzymywane episom alnie i nie replikują. W następstwie, obserw owano ciągłą ekspresję po w strzyknięciu i.m. do mięśni szkieletowych szczurów, ryb i naczelnych oraz mięśnia sercowego szczurów (H. Lin i in., Circulation 82, 2217, (1990); R.N. Kitsis i in. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88, 2217 (1991); E. Hansen i in., FEBS Lett. 290, 73 (1991); S. Jiao i in., Hum. Gene Therapy 3, 21 (1992); J.A. W olff i in., H um an Mol. Genet. 1, 363 (1992)). Technikę zastosowania kwasu nukleinowego jako środka leczniczego opisano w WO 90/11092 (4 października 1990), w którym nagie polinukleotydy zastosowano do szczepienia kręgowców. Ostatnio, opisano rów norzędną rolę B7 i prezentacji epitopów przez główny układ zgodności tkankowej (MHC) na powierzchni komórek prezentujących antygen w aktywacji CTL w celu usuwania nowotworu (Edington, Biotechnology 11, 1117-1119, 1993). Gdy cząsteczka M HC na powierzchni komórki prezentującej antygen (APC) prezentuje epitop receptorowi łimfocyta T (TCR), B7 ekspresjonowana na powierzchni tej samej APC działa jako drugi sygnał przez w iązanie CTLA-4 albo CD28. W ynikiem jest gwałtowny podział limfocytów T pomocniczych CD4+, które pobudzają limfocyty T CD8+ do proliferacji i niszczenia APC. Do powodzenia sposobu nie jest konieczne aby immunizacja była domięśniowa. Tak więc. Tang i in., (Nature, 356, 152-154 (1992)) opisuje, że wprowadzenie mikropocisków ze złota opłaszczonych D NA kodującym bydlęcy horm on w zrostu (BGH) do skóry m yszy powoduje w ytw arzanie przeciw ciał przeciwko BG H przez myszy. Furth i in., (Analytical B iochemistry, 205, 356-368 (1992)) opisuje, że można zastosować urządzenie,je t injector w celu transfekcji skóry, mięśni, tkanki tłuszczowej i sutka żywych zwierząt. Różne sposoby wprowadzania kwasów nukleinowych zostały ostatnio opisane (Friedman T. Science, 244, 1275-1281 (1989)). Patrz również, Robinson i in., (Abstracts o f Papers Presented at the 1992 meeting on M odem Approaches to New Vaccines, Including prevention of Aids, Cold Spring Harbor, str. 92; Vaccine 11, 957 (1993)) gdzie udowodniono, że podawanie i.m., i.p. i i.v. DNA grypy ptasiej kurczętom zapewniało ochronę przed letalną ekspozycją. Dożylne wstrzyknięcie kompleksu DNA:liposomy kationowe myszom opisano w Zhu i in., (Science 261, 209-211 (1993); patrz również WO 93/24640, 9 grudnia 1993) w celu wywołania uogólnionej ekspresji klonowanego transgenu. Ostatnio, U lmer i in., (Science 259, 1745-1749 (1993)) opisał ochronę heterologiczną przed zakażeniem wirusem grypy, przez wstrzyknięcie D NA kodującego białka w irusa grypy. Wang i in., (PNAS U SA 90, 4156-4160 (1993)) opisał w ywołanie odpowiedzi odpornościowej przeciwko HIV u myszy, przez szczepienie domięśniowe klonowanym, genomowym (nie składanym) genem HIV. Jednakże, poziom uzyskanej odpowiedzi odpornościowej był bardzo niski, zaś układ wykorzystywał części promotora długich końcowych powtórzeń (LTR) mysiego wirusa guza sutka (MMTV) oraz części promotora i terminatora małpiego wirusa 40 (SV40). SV40 jak wiadomo transformuje komórki, prawdopodobnie przez integrację z komórkowym DNA gospodarza. Tak więc, układ opisany przez Wang i in., jest całkowicie nieodpowiedni do podaw ania ludziom, co stanowi jed en z przedm iotów niniejszego w y- nalazku. W O 93/17706 opisuje sposób szczepienia zwierząt przeciwko wirusowi, w którym cząstki nośnika opłaszczono konstruktem genowym zaś, opłaszczone cząstki rozpędzano w głąb komórek zwierzęcia. Badania Wolffa i in., (wyżej) jako pierwsze pokazały, że domięśniowe wstrzyknięcie plazmidowego DNA kodującego gen reporterowy powoduje ekspresję genu w miocytach w pobliżu m iejsca wstrzyknięcia. Ostatnie doniesienia pokazują pom yślną im m unizację m y- szy przeciwko wirusowi grypy przez wstrzyknięcie plazmidów kodujących hemaglutyninę (Montgomery D.L. i in., 1993, Cell Biol. 12, 777-783), albo nukleoproteinę (Montgomery D.L. i in., wyżej; Ulmer J.B. i in., 1993, Science, 259, 1745-1749) wirusa grypy typu A. Pierwsze zastosowanie immunizacji DNA przeciwko wirusowi opryszczki opisano w Cox i in., 1993, J. Virol. 5664-5667). W strzyknięcie plazm idu kodującego glikoproteinę g IV bydlęcego w irusa herpes typu 1 (BHV-1) spowodowało wzrost przeciwciał przeciwko g IV

184 839 5 u myszy i cieląt. Po donosowej ekspozycji BHV-1, im m unizowane cielęta w ykazyw ały słabsze objawy i w ydzielały zasadniczo mniej w irusa niż kontrole. Gruźlica (TB) jest przew lekłą chorobą zakaźną płuc w yw ołaną przez patogen M ycobacterium tuberculosis. TB jest jedną z najbardziej klinicznie istotnych chorób w świecie, z częstością 3 milionów zgonów i 10 milionów nowych przypadków rocznie. Ocenia się, że zakażona być m oże około 1/3 populacji świata, zaś w krajach rozw ijających się donosi się o około 55 milionach przypadków. Do przełomu wieków, TB była w iodącą przyczyną śmierci w USA. Dzięki popraw ie warunków sanitarnych i nadejściu leków przeciw bakteryjnych częstość śmiertelności stale się zm niejsza do punktu gdzie, jak się oczekuje, choroba ulegnie całkowitemu zanikowi około roku 2000. Jednakże, w większości kraj rozwijających się, liczbą przypadków czynnej gruźlicy rośnie z każdym rokiem od połow y lat 80-ych. Część tego nawrotu przypisuje się imigracji i rosnącej liczbie osób osobników z niedoborem odporności, zakażonych HIV. Pozostawiona bez ingerencji, TB jak się ocenia zabierze ponad 30 milionów ludzkich istnień w ciągu następnych 10 lat. Podobnie jak te liczby, alarmujące jest powstanie wielolekoopomych szczepów M. tuberculosis. Te szczepy M DR są niemożliwe do wyleczenia tradycyjnymi lekami i są odpowiedzialne za kilka ostatnich epidemii TB, szczególnie w ośrodkach miejskich. Stąd, jednym z kluczowych składników długofalowego postępowania z TB będzie skuteczna szczepionka (patrz, Bloom i Murray, 1993, Science 257, 1055). M. tuberculosis je st w ew nątrzkom órkow ym patogenem zakażającym m akro fagi i zdolnym do przeżycia w surowych w arunkach fagolizosom ów tego typu kom órek. W iększość inhalowanych prątków jest niszczona przez aktywowane makrofagi pęcherzykowe. Jednakże, przeżywające prątki m ogą się dzielić wewnątrz makrofagów i uwalniać się po śmierci komórki co powoduje napływ limfocytów, monocytów i makrofagów do tego miejsca. Rozpad m akrofagów w ypełnionych prątkam i spowodow any je st nadw rażliw ością typu późnego (DTH) i powoduje powstanie litego serowatego guzka otaczającego obszar zakażonych komórek. Trwająca DTH powoduje rozpływ guzka i uwolnienie zamkniętych prątków. Wielka dawka zewnątrzkomórkowych prątków wyzwala dalszą DTH, powodując uszkodzenie oskrzeli i rozsiew drogam i limfatycznymi, krwionośnymi i oskrzelow ym i i ew entualne rozprzestrzenienie zakaźnych prątków przez wydychane powietrze. Odporność na TB obejm uje kilka rodzajów kom órek efektorowych. A ktyw acja m akrofagów przez cytokiny, takie ja k interferon-γ, jest skutecznym sposobem zm niejszania w e- wnątrzkomórkowego namnażania mykobakterii. Jednakże, całkowite wykorzenienie prątków tym sposobem nie jest osiągalne. Nabycie odporności przeciwko TB wymaga limfocytów T. Wśród nich, istotne w ydają się być zarówno limfocyty CD8+ jak i CD4+ (Orme i in., 1993, J. Infect. Dis. 167, 1481). Te rodzaje komórek wydzielają interferon-y w odpowiedzi na mykobakterie, co w skazuje na odpow iedź Thl i w ykazują aktywność cytotoksyczną wobec komórek docelowych pulsowanych mykobakteriami. Jak wykazano w najnowszych badaniach z użyciem myszy defektywnych pod względem β2-mikroglobuliny i CD8, odpowiedź CTL jest kluczowa w zapewnieniu odporności na M. tuberculosis (Flynn i in., 1992, PNAS USA 89, 12013; Flynn i in., 1993, J. Exp. Med., 178, 2249; Cooper i in., 1993, J. Exp. Med., 178, 2243). W przeciwieństwie, lim focyty B nie w ydają się być związane, zaś pasyw ne przeniesienie przeciwciał przeciwko m ykobakteriom nie zapewnia odporności. Stąd, skuteczne szczepionki przeciwko TB m uszą w ywoływać odporność komórkową. Pobudzenie antygenowe limfocytów T wymaga prezentacji przez cząsteczkę MHC. Aby antygeny m ykobakteryjne m iały dostęp do szlaku prezentacji antygenu m uszą być uw olnione z bakterii. W zakażonych makrofagach może to być osiągnięte przez wydzielenie albo rozpad bakterii. Mykobakterie m ają wiele potencjalnych antygenów limfocytów T, zaś kilka z nich zidentyfikowano (Andersen 1994, Dań. Med. Buli., 41, 205). N iektóre z nich są w y- dzielane przez bakterie. Uważa się ogólnie, że odporność przeciwko TB spowodowana jest przez limfocyty T CD8+ i CD4+ skierowane przeciwko tym wydzielanym antygenom. Na modelu TB myszy i świnek morskich, ochrona przed ekspozycją na bakterie, mierzona zmniejszeniem utraty ciężaru ciała, została osiągnięta przez zastosow anie m ieszaniny w y- dzielanych antygenów mykobakteryjnych (Pal i Horowitz, 1992, Infect. Immunity 60, 4781; Andersen 1994, Infect. Im m unity 62, 2536; Collins, 1994, Veterin. M icrobiol. 40, 95).

6 184 839 U M. tuberculosis zidentyfikow ano kilka potencjalnie chroniących antygenów lim focytów T, zaś niektóre z nich są badane jako potencjalne szczepionki. Ostatnie prace wskazują, że głównymi antygenami limfocytów T są te białka, które są wydzielane przez mykobakterie w trakcie ich pobytu w makrofagach, takie jak: i) kompleks białek antygenu 85 (85A, 85B, 85C) (Wiker i Harboe, 1992, Microbiol. Rev. 56, 648), ii) białko 6 kda określane jako ESAT-6 (Andersen 1994, Infect. Immunity 62, 2536), iii) lipoproteina 38 kda o homologii zphos (young i Garbe, 1991, Res. Microbiol. 142, 55; Andersen 1992. J. Infect. Dis. 166, 874), iv) białko wstrząsu cieplnego GroEL 65 kd a (Siva i Lowrie, 1994, Immunol. 82, 244), v) białko 55 kda bogate w prolinę i treoninę (Romain i in., 1993, PNAS USA 90, 5322), i vi) lipoproteina 19 kda (Faith i in., 1991, Immunol. 74,1). Geny dla każdego z trzech białek antygenu 85 (A, B i C) sklonowano i sekwencjonowano (Borremans i in., 1989, Infect. Immunity 57, 3123; Content i in., Infect. Immunity 59, 3205; DeWit i in., 1994, DNA Seq. 4, 267). Oprócz tego, te spokrewnione strukturalnie białka stanowią cel dla silnej odpowiedzi limfocytów T po zakażeniu jak i po szczepieniu (Huygen i in., 1988, Scand. J. Iimnunol. 27, 187; Launois i in., 1991, Clin. Exp. Immunol. 86, 286; Huygen i in., 1992, Infect. Immunity 60, 2880; Munk i in., 1994, Infect. Immunity 62, 726; Launois i in., 1994, Infect. Immunity 62, 3679). Tak więc, białka antygenu 85 uważane są za dobre cele szczepionki. Streszczenie wynalazku W celu zbadania skuteczności immunizacji DNA w zapobieganiu chorobie wywołanej przez M. tb., sekwencje D NA kodujące białka M. tb. klonowano do eukariotycznych w ektorów ekspresyjnych. Te konstrukcje D NA wywoływały odpow iedź odpornościow ą po w strzyknięciu zwierzętom. Immunizowane zwierzęta zakażano mykobakteriami w celu zbadania, czy bezpośrednia immunizacja DNA genem (albo innymi genami M. tb.) może chronić je przed chorobą. Ujawniono więc kwasy nukleinowe, w tym konstrukty DNA i transkrypty RNA, zdolne do wywoływania ekspresji in vivo białek M. tb. po bezpośrednim wprowadzeniu do tkanek zwierzęcych przez wstrzyknięcie albo w inny sposób. W strzyknięcie tych kwasów nukleinowych może w ywołać odpow iedź odpornościową, pow odującą w ytw arzanie cytotoksycznych limfocytów T (CTL) swoistych wobec antygenów M. tb., jak również wywołanie odpowiedzi limfocytów T pom ocniczych swoistej wobec antygenów M. tb., która chroni podczas kolejnej ekspozycji. Te kwasy nukleinowe są przydatne jako szczepionki do wywołania odporności wobec M. tb., która może zapobiegać zakażeniu i/lub złagodzić chorobę w yw ołaną przez M. tb. Krótki opis rysunków Figura 1 pokazuje ogólną zasadę klonowania genów M. tb. do w ektorów ekspresyjnych. Figura 2 pokazuje m apę V I Jns.tPA85A.C1. Figura 3 pokazuje mapę VI Jns.85A.C2. Figura 4 pokazuje m apę V 1 Jns.85A.C3. Figura 5 pokazuje mapę V in s.tpa85b.cl. Figura 6 pokazuje mapę V 1 Jns.tPA85C.Cl. Figura 7 pokazuje potw ierdzenie sekwencji N-końcowej konstruktu. Figura 8 pokazuje ekspresję białek M. tb. w hodowli tkankowej. Figura 9 pokazuje wytwarzanie przeciwciał swoistych wobec antygenu 85A przez szczepione D NA myszy. Figura 10 pokazuje wytwarzanie IL-2 przez myszy BALB/c po szczepionce DNA Tb. Figura 11 pokazuje wytwarzanie IL-2 przez myszy C57BL/6 po szczepionce DNA Tb. Figura 12 pokazuje wytwarzanie IFN-γ przez myszy BALB/c po szczepionce DNA Tb. Figura 13 pokazuje wytwarzanie IFN-γ przez myszy C57BL/6 po szczepionce DNA Tb. Figura 14 pokazuje brak wytwarzania IL-4 przez myszy BALB/c po szczepionce DNA Tb. Figura 15 pokazuje brak wytwarzania IL-6 przez myszy po szczepionce DNA Tb. Figura 16 pokazuje brak wytwarzania IL-10 przez myszy po szczepionce DNA Tb. Figura 17 pokazuje zm niejszenie namnażania BCG w płucach m yszy C57BL/6 szczepionych szczepionką DNA Tb.

184 839 7 Figura 18 pokazuje zm niejszenie nam nażania BCG w płucach m yszy B A LB/c szczepionych szczepionką D NA Tb. Figura 19 pokazuje zmniejszenie namnażania BCG w śledzionach m yszy BALB/c szczepionych szczepionką DNA Tb. Figura 20 pokazuje zmniejszenie namnażania BCG w śledzionach m yszy C57BL/6 szczepionych szczepionką DNA Tb. Szczegółowy opis wynalazku W ynalazek dostarcza polinukleotydów, które po wprowadzeniu bezpośrednio do organizmu kręgowców in vivo, w tym ssaków takich jak człowiek, wywołują ekspresję kodowanych białek w organizmie zwierzęcia. W znaczeniu tu użytym, polinukleotyd je st kw asem nukleinowym, który zawiera istotne elementy regulatorowe takie, że po wprowadzeniu do komórki żywego kręgowca są zdolne do kierowania aparatem komórkowym w celu wytwarzania produktów translacji kodowanych przez geny zawarte w polinukleotydzie. W jednym wykonaniu wynalazku, poinukleotydem jest kwas polidezoksyrybonukleinowy, obejmujący geny Mycobaterium tuberculosis (M. tb.) połączone funkcjonalnie z promotorem transkrypcyjnym. W innym wykonaniu wynalazku, szczepionka polinukleotydowa obejmuje kwas polirybonukleinowy, kodujący geny M. tb., które są możliwe do translacji przez eukariotyczny aparat kom órkow y (rybosomy, trna i inne czynniki translacyjne). Gdy białko kodow ane przez polinukleotyd nie jest jednym z norm alnie w ystępujących u zw ierzęcia z w yjątkiem stanów patologicznych (tj. białkiem heterologicznym) takim ja k białka zw iązane z M. tb., układ odpornościowy zw ierzęcia jest aktywow any w sposób wyzw alający ochronną odpow iedź odpornościową. Ponieważ te białka egzogenne są wytwarzane przez własne tkanki zwierzęcia, ekspresjonowane białka są przetwarzane przez główny układ zgodności tkankowej (MHC) w sposób analogiczny do zachodzącego podczas zakażenia M. tb. W ynikiem jest, jak pokazano w niniejszym opisie, indukcja odpowiedzi odpornościowej przeciwko M. tb. Polinukleotydy do wywoływania odpowiedzi odpornościowej na kodow ane białka określane są tu jako szczepionki polinukleotydowe albo PNV. Istnieje wiele wykonań niniejszego wynalazku, które specjaliści wywnioskują z opisu. Tak więc, z powodzeniem m ogą być zastosow ane różne prom otory transkrypcyjne, term inatory, wektory nośnikowe albo konkretne sekwencje genowe. Niniejszy wynalazek pozwala na zastosowanie polinukleotydu, który po wprowadzeniu do tkanek ssaka wywołuje ekspresję in vivo polinukleotydu w ytw arzając kodow ane białko. Oczywiste jest dla specjalisty, że możliwe są do w ykonania odm iany albo pochodne sekwencji nukleotydowej kodującej białko, zmieniające sekwencję am inokwasow ą kodowanego białka. Zmienione ekspresjonowane białko może mieć zm ienioną sekwencję aminokwasową, ale wciąż może w ywoływać odpow iedź odpornościow ą oddziaływ ującą z białkam i m ykobakterii, i jest uważane za funkcjonalny równoważnik. Oprócz tego, m ogą być konstruowane fragmenty genów pełnej długości, które kodują części białek pełnej długości. Fragmenty te m ogą kodować białko albo peptyd w ywołujący przeciw ciała, które reagują z białkam i m ykobakterii i są uważane za funkcjonalne równoważniki. W jednym z wykonań wynalazku, gen kodujący produkt genowy M. tb. włączony jest do wektora ekspresyjnego. Wektor zawiera promotor transkrypcyjny rozpoznawany przez eukariotyczną polimerazę RNA oraz terminator transkrypcyjny na końcu sekwencji kodującej gen M. tb. W korzystnym wykonaniu, prom otor je st prom otorem w irusa cytom egalii z sekw encją intronu A (CM V-intA), jednakże specjaliści zauważą, że m oże być zastosow any dowolny spośród licznych znanych promotorów takich jak silny prom otor immunoglobuliny albo inne eukariotyczne prom otory genów. Korzystny term inator transkrypcji je st term inatorem bydlęcego hormonu wzrostu. Korzystne jest skojarzenie CM VintA-terminator BGH. Oprócz tego, w celu ułatwienia wytwarzania polinukleotydów w kom órkach prokariotycznych, do wektora ekspresyjnego włączony jest ewentualnie m arker oporności na antybiotyki pod kontrolą transkrypcyjną odpowiedniego prom otora prokariotycznego. M ogą być zastosowane geny oporności na ampicylinę, neomycynę albo dowolny inny stosowny marker oporności na antybiotyk. W korzystnym wykonaniu wynalazku, gen oporności na antybiotyk koduje produkt genow y oporności na neom ycynę/kanam ycynę. D alej, w celu ułatw ienia

8 184 839 w ytw arzania polinukleotydu w dużych ilościach w organizmach prokariotycznych, korzystne jest aby zawierał prokariotyczny początek replikacji oraz był wektorem występującym w licznych kopiach. Dowolny spośród dostępnych w handlu prokariotycznych wektorów do klonow ania zapewnia te elementy. W korzystnym w ykonaniu wynalazku, czynności te są zapewnione przez w ektory dostępne w handlu znane jako szereg puc. M oże być jednakże konieczne usunięcie sekwencji DNA, które nie są konieczne. Tak więc, sekwencje kodujące lacz i laci puc m ogą być usunięte. Jest również pożądane, aby wektory nie były zdolne do replikacji w kom órkach eukariotycznych. M inim alizuje to ryzyko integracji sekwencji szczepionki polinukleotydowej do genomu biorcy. W innym wykonaniu, zastosowany jest wektor ekspresyjny pnrsv, w którym jako promotor zastosowano sekwencję długich końcowych powtórzeń (LTR) wirusa mięsaka Rous'a (RSV). W jeszcze innym wykonaniu zastosowano V 1, zmutowany wektor pbr322, w którym klonowano prom otor CM V i term inator transkrypcji BGH. W korzystnym wykonaniu w ynalazku, elementy V 1 i puc19 połączono tworząc w ektor określany jako V1J. Do V1J, V 1JtPA albo innego pożądanego wektora ekspresyjnego klonowany jest gen M. tb., taki jak jeden z genów kompleksu antygenu 85 albo dowolny inny gen M. tb., który może wywołać odpowiedź odpornościową, przeciwko M. tb. (CTL, limfocyty T pomocnicze i przeciwciała). W innym wykonaniu, gen oporności na antybiotyki usuwany jest z V 1J i zastępowany genem oporności na neomycynę, tworząc V 1J-neo, do którego może być klonowany dowolny spośród licznych genów M. tb. do zastosowania zgodnego z wynalazkiem. W jeszcze innym wykonaniu, wektorem jest V 1Jns, który jest tym samym co V 1J-neo, z takim wyjątkiem, że zaprojektowano unikalne miejsce restrykcyjne SfiI w pojedynczym miejscu KpnI w pozycji 2114 V 1J-neo. Występowanie miejsc SfiI w ludzkim genomowym DNA jest niezwykle rzadkie (około 1 miejsce na 100000 zasad). Tak więc, wektor ten umożliwia dokładne śledzenie integracji w ektora ekspresyjnego z D NA gospodarza, przez traw ienie SfiI ekstrahowanego genomowego DNA. W dalszym wykonaniu, wektorem jest V1R. W tym wektorze, usunięto tyle DNA ile to możliwe, tworząc niezwykle zwarty wektor. Wektor ten umożliwia zastosowanie większych wstawek, bez zwracania uwagi na to, że kodowane są niepożądane sekwencje i poprawia wychwyt przez komórki, gdy konstrukt kodujący konkretne geny wirusowe jest wprowadzany do otaczających tkanek. Zastosowane sposoby w wytwarzaniu powyższych odmian wektora i opracowywanych procedur m ogą być osiągane sposobami znanymi specjalistom. Z opisanej pracy specjalista zauważy, że jedną z korzyści niniejszego wynalazku jest zapewnienie układu do testowania i analizowania in vivo jak i in vitro, tak że można skorelować różnorodność sekwencji M. tb. z odpowiedzią proliferacyjną CTL i limfocytów T, jak również inne parametry. Izolacja i klonowanie tych różnych genów może być osiągnięta sposobami znanym i specjalistom. W ynalazek dostarcza dalej sposobu systematycznej identyfikacji szczepów M. tb. i sekwencji do wytwarzania szczepionek. W łączenie genów z pierw o- tnych izolatów szczepów M. tb. zapewnia immunogen, który w yw ołuje odpowiedź odpornościow ą przeciwko izolatora klinicznym organizmu, i w ten sposób spełnia dotąd niezaspokojoną potrzebę. Ponadto, jeżeli szczep zakaźny się zm ienia, im m unogen może być m odyfikowany odzw ierciedlając jeżeli to konieczne nowe sekwencje. W jednym wykonaniu wynalazku, gen kodujący białko M. tb. połączono bezpośrednio z promotorem transkrypcji. W celu ograniczenią ekspresji polinukleotydu do konkretnego rodzaju tkanki może być pożądane zastosowanie swoistych dla tkanek prom otorów i w zm a- cniaczy, przykładowo elem entu wzmacniającego kinazę kreatyniny mięśni (MCK). Przykładowo, m iocyty są zróżnicowanym i końcowo komórkami, które się nie dzielą. Integracja obcego DNA do chromosomów wydaje się wymagać podziału komórki jak i syntezy białka. Tak więc, ograniczenie ekspresji do nie dzielących się kom órek takich jak m iocyty może być korzystne. Jednakże, zastosowanie promotora CMV jest adekwatne do osiągnięcia ekspresji w wielu tkankach do których wprowadzana jest PNV. M. tb. oraz inne geny są korzystnie ligowane z wektorem ekspresyjnym, który specyficznie optymalizowano do szczepienia polinukleotydem. Elementy obejmują promotor transkrypcyjny, immunogenne epitopy oraz dodatkowe cistrony kodujące geny im munowzmacniające

184 839 9 albo immunomodulujące, z ich własnymi promotorami, terminatorami transkrypcyjnymi, bakteryjnymi początkam i replikacji i genami oporności na antybiotyki, ja k to tu opisano. Ewentualnie, w ektor m oże zawierać w ew nętrzne miejsce w iązania rybosom u (IR ES) w celu ekspresji mrna policistronowego. Specjaliści zauważą, że RNA poddawane transkrypcji in vitro w celu wytworzenia wielocistronowych mrna kodowanych przez odpowiednie DNA również leży w zakresie wynalazku. W tym celu pożądane jest, zastosowanie promotora transkrypcyjnego takiego jak silny promotor polimerazy RNA, taki jak prom otor T7 albo SP6, i wykonanie transkrypcji in vitro z użyciem matrycy linearyzowanego DNA. Sposoby te są znane w dziedzinie wiedzy. Skuteczność ochronną polinukleotydowych immunogenów M. tb. przed następującą potem ekspozycją w ykazano im m unizację DNA w edług wynalazku. Jest to korzystne ponieważ nie stosuje się żadnego czynnika zakaźnego, nie jest konieczne żadne łączenie/replikacja bakterii oraz możliwa jest selekcja determinant. Ponadto, ponieważ sekwencja produktów genowych mykobakterii może być zakonserwowana pomiędzy różnymi szczepami M. tb., uzyskiwana je st ochrona przed kolejną ekspozycja na inny szczep M. tb. Wstrzyknięcie wektora ekspresyjnego DNA kodującego antygen 85A, B albo C może spowodować wytworzenie znacznej ochronnej odporności przed kolejną ekspozycją. W szczególności, może być wytworzona odpowiedź swoistych CTL i limfocytów T pomocniczych. Poniew aż każdy z produktów genow ych M. tb. w ykazuje w ysoki stopień zakonserwowania wśród różnych szczepów M. tb. oraz ponieważ odpowiedź odpornościow a może być wytworzona w odpowiedzi na wewnątrzkom órkową ekspresję i przetwarzanie przez MHC, należy oczekiwać, że wiele różnych konstruktów PNV M. tb. może dawać odporność krzyżową. W ynalazek oferuje sposoby w ywołania heterologicznej ochronnej odporności bez potrzeby czynników samoreplikujących albo adiuwantów. Wytworzenie przeciwciał o wysokim mianie przeciwko ekspresjonowanym białkom po wstrzyknięciu DNA dla białek wirusowych i ludzkiego hormonu wzrostu (Tang i in., Nature 356, 152, 1992) wskazuje, że jest to wygodny i niezwykle skuteczny sposób tworzenia szczepionek opartych na przeciwciałach, zarówno osobno jak i w połączeniu ze szczepionkami opartymi na limfocytach T cytotoksycznych i limfocytach T pom ocniczych skierow anych przeciwko zakonserw ow anym regionom antygenów. Łatwość w ytw arzania i oczyszczania konstruktów D N A korzystnie konkuruje z tradycyjnym oczyszczaniem białek, ułatwiając wytwarzanie szczepionek poliwalentnych. Tak więc, m ogą być w ytw orzone liczne konstrukty, przykładowo kodujące geny kom pleksu antygenu 85 i dowolny inny gen M. tb. jak również inne geny nie należące do M. tb. m ogą być wytwarzane, m ieszane i podaw ane równocześnie. Oprócz tego, ekspresja białka po w strzyknięciu jest utrzymywana (H. Lin i in., Circulation 82, 2217 (1990); R.N. K itsis i in., PNAS USA 88, 4138 (1991); E. Hansen i in., FEBS Lett. 290, 73 (1991); S. Jiao i in., Hum. Gene Therapy 3, 21 (1992); J.A. W olff i in., Human Mol. Genet. 1, 363 (1992)). Trwałość pamięci limfocytów B i T m oże być przedłużona (D. G ray i P. M atzinger, J. Exp. M ed. 174, 969 (1991); S. Oehen i in., ibid. 176, 1273 (1992)), dając w ten sposób długotrwałą odporność hum oralną i komórkową. Ilość zdolnego do ekspresji DNA albo możliwego do transkrypcji R N A w prow adzanego do organizmu biorcy szczepionki zawiera się w szerokich granicach i może zależeć od siły zastosowanych prom otorów transkrypcyjnych i translacyjnych. O prócz tego, w ielkość odpowiedzi odpornościowej może zależeć od poziomu ekspresji białka oraz od immunogenności ekspresjonowanego produktu genowego. Ogólnie, skuteczny dawka w zakresie od około 1 ng do około 5 mg, 100 ng do 2,5 mg, 1 µg do 750 0181g, zaś korzystnie około 10 µg do 300 µg podawana jest bezpośrednio do tkanki mięśniowej. Odpowiednie jest również wstrzyknięcie podskórne, wprowadzanie śródskórne, wgniatanie przez skórę i inne sposoby podawania takie jak podawanie dootrzewnowe, dożylne albo wziewne. Uwzględniane jest również szczepienie przypominające. Uwzględniane jest również szczepienie przypominające immunogenami białkowymi M. tb. takimi jak produkty genowe kompleksu antygenu 85 po szczepieniu immunogenem polinukleotydowym M. tb. M oże być korzystne podaw anie pozajelitow e, takie

10 184 839 jak dożylne, domięśniowe, podskórne albo innym sposobem białka interleukiny-12 (albo innych cytokin np. GM-CSF) równocześnie albo po wprowadzeniu pozajelitowym PNV według wynalazku. Polinukleotydy m ogą być nagie, tj. niezwiązane z żadnymi białkami, adiuwantami albo innymi czynnikami wpływającym i na układ odpornościowy biorcy. W tym przypadku, pożądane jest aby polinukleotyd był w roztworze dopuszczalnym fizjologicznie, takim jak, choć nie wyłącznie sterylny roztwór soli albo sterylny buforowany roztwór soli. Alternatywnie, DNA może być związany z liposomami, takimi jak liposomy lecytynowe albo inne liposomy znane w dziedzinie wiedzy, w postaci mieszaniny DNA-liposomy, albo DNA może być związane ze znanym w dziedzinie wiedzy adiuwantem wzmagającym odpowiedź odpornościową takim jak białko albo inny nośnik. M ogą być również zastosowane czynniki zwiększające komórkowy wychwyt DNA takie jak, choć nie ograniczone do jonów wapnia. Czynniki te określa się tu ogólne jako reagenty wspom agające transfekcję i nośniki dopuszczalne farmaceutycznie. Znane są również techniki opłaszczania mikropocisków polinukleotydami i są również przydatne w połączeniu z niniejszym wynalazkiem. Dla DNA przeznaczonego do podawania ludziom może być przydatne przechowyw anie końcow ego produktu DNA w nośniku dopuszczalnym farm aceutycznie albo buforow anym roztworze. Znane są nośniki dopuszczalne farm aceutycznie i buforow ane roztw ory i opisano je w różnych dokum entach takich jak Rem ington's Pharm aceutical Sciences. W innym wykonaniu, wynalazek stanowi polinukleotyd obejmujący ciągłe sekwencje kwasu nukleinowego m ożliw e do ekspresji z wytworzeniem produktu genowego po w prow a- dzeniu do tkanek eukariotycznych in vivo. Kodowany produkt genowy korzystnie działa albo jako immunostumulator albo jako antygen zdolny do wywołania odpowiedzi odpornościowej. Tak więc, sekwencje kwasu nukleinowego w tym wykonaniu kodują immunogenny epitop M. tb. oraz ewentualnie cytokinę albo element kostymulujący limfocyta T, taki jak jeden z członków rodziny białek B 7. Istnieje kilka zalet im munizacji genem w stosunku do im m unizacji produktem genowym. Pierwszą z nich jest względna prostota z jaką natywny albo prawie natywny antygen może być prezentowany układowi odpornościowemu. Białka ssaków ekspresjonowane rekombinacyjnie w bakteriach, drożdżach albo nawet komórkach ssaków często wymagają, intensywnego traktowania w celu zapewnienia odpowiedniej antygenowości. Drugą zaletą immunizacji D NA jest praw dopodobieństw o wejścia w szlak M HC klasy I i w ywołania odpowiedzi limfocytów T cytotoksycznych. Immunizacja myszy zużyciem DNA kodującego nukleoproteinę w irusa grypy typu A (NP) wywoływała odpow iedź CD8+ na NP, która chroniła myszy przed ekspozycją na heterologiczne szczepy grypy (M ontgomery D.L. i in., wyżej; Ulmer J. i in., wyżej). Istnieją silnie dowody na to, że odporność kom órkow a jest istotna w kontrolowaniu zakażenia M. tb. (Orme i in., 1993, J. Infect. Dis. 167, 1481; Cooper i in., 1993, J. Exp. Med. 178, 2243; Flynn i in., 1993, J. Exp. Med. 178, 2249; Orme i in., 1993, J. Immunol. 151, 518). Ponieważ im m unizacja DNA m oże w ywołać zarówno hum oralną ja k i kom órkow ą odpowiedź odpornościową, jej największą zaletą może być to, że zapewnia względnie prosty sposób zbadania wielkiej liczby genów M. tb. w kierunku ich potencjalnego zastosowania w szczepionce. Immunizacja przez wstrzyknięcie DNA umożliwia również, jak to dyskutowano wyżej, łatwe komponowanie szczepionek poliwalentnych. Ostatnio została opisana równoczesna im munizacja licznymi genam i w irusa grypy (Donelly i in., 1994, Vaccines, 55-59). W prow a- dzenie do szczepionki M. tb. genów, których produkty aktyw ują różne szlaki odpowiedzi odpornościowej może również zapewnić gruntow ną ochronę przed kolejną ekspozycją. Szczepionki według niniejszego wynalazku są przydatne do podawania zwierzętom domowym i hodowlanym jak również ludziom. Szczepionki według wynalazku m ogą być zastosowane w celu zapobiegania i/lub zwalczania zakażenia u dow olnego zw ierzęcia hodowlanego w tym, choć nie wyłącznie krów mlecznych, które są podatne na zakażenie mykobakteriami. Techniki podaw ania tych szczepionek zwierzętom i ludziom znane są specjalistom w dziedzinie, odpowiednio, weterynarii i medycyny.

184 839 11 Poniższe przykłady dostarczono w celu zilustrow ania niniejszego w ynalazku, bez ograniczania go do nich. Przykład 1 Wektory do wytwarzania szczepionek A) Wektor ekspresyjny VI Wektor ekspresyjny VI skonstruowano z pcm VIEAKI-DHFR (Y. Wang i in., J. Virol. 61, 1796 (1987)). Geny AKI i DHFR usunięto przez cięcie w ektora EcoRI i religację. Wektor ten nie zawierał intronu A w promotorze CMV, a więc dodano go jako fragment PCR, z którego usunięto wewnętrzne miejsce SacI (w pozycji 1855 według numeracji Chapmana i in. N ucl. Acids Res. 19, 3979 (1991)). Jako matrycę do reakcji PCR zastosowano pcmvinta-lux wytworzony przez ligację fragmentu HindIII i NheI z pc M V 6a120 (patrz, Chapman i in., ibid.) obejmującego wzmacniacz/promotor hcm V -IE1 i intron A, w miejscu HindIII i XbaI pbl3, tworząc pcmvintbl. Fragment genu lucyferazy wielkości 1881 par zasad (HindIII-Smal wypełniony fragmentem Klenowa) z RSV-Lux (J.R. de Wet i in. Mol. Cell Biol. 7, 725, 1987) klonowano w miejsce SalI pcm VIntA, który w ypełniono fragm entem K lenowa i traktowano fosfatazą. Startery obejmujące intron A miały sekwencje: starter 5', Identyfikator Sekw. N r 1: 5'CTATATAAGCAGAGCTCGTTTAG3'; starter 3, Identyfikator Sekw. N r 2: 5'GTAGCAAAGATCTAAGGACGGTGACTGCA G 3'. Startery zastosowane w celu usunięcia miejsca SacI miały sekwencje: starter sensowny, Identyfikator Sekw. N r 3: 5'GTATGTGTCTGAAAATGAGCGTGGAGATTGGGCTCGCAC3 ; starter antysensowny. Identyfikator Sekw. Nr 4: 5'GTGCGAGCCCAATCTCCACGCTCATTTTCAGACACATAC3'. Fragment PCR cięto SacI i B g lii i wprowadzono do wektora, który przecięto tymi samymi enzymami. B) Wektor ekspresyjny V1J Celem wytworzenia V 1J było usunięcie elementów prom otora i term inatora transkrypcji z wektora VI w celu umieszczenia ich w bardziej zdefiniowanym kontekście, stworzenie bardziej zwartego wektora i popraw a ilości oczyszczanego plazm idu. V 1J otrzymano z wektorów V 1 ipu C 18, plazmidów dostępnych w handlu. V 1 trawiono enzymami restrykcyjnymi Sspl i EcoRI tworząc dwa fragmenty DNA. M niejszy z nich, zawierający elementy promotora CMVintA i terminatora transkrypcji bydlęcego hormonu wzrostu (BGH), kontrolujące ekspresję genów heterologicznych oczyszczono przez elektroforezę na żelu agarozowym. Końce tego fragmentu DNA stępiono stosując polimerazę DNA T4, w celu ułatwienia jego ligacji z innym tępym fragmentem DNA. puc18 wybrano jako szkielet w ektora ekspresyjnego. Znany je st on z w ytw arzania dużej ilości plazmidu, jest dobrze scharakteryzowany pod względem sekwencji i funkcji i ma małe wymiary. Z wektora tego usunięto przez częściowe trawienie enzymem restrykcyjnym HaeII cały operon lac. Pozostały plazm id oczyszczono przez elektroforezę na żelu agarozowym, stępiono na końcach polim erazą D NA T4, traktowano cielęcą je lito w ą fosfatazą alkaliczną i ligowano z elem entem CM VintA/BGH opisanym wyżej. U zyskano plazm idy w ykazujące obie możliwe orientacje elementu prom otora w szkielecie puc. Jeden z tych plazm i- dów dawał znacznie wyższe ilości DNA w E. coli i został oznaczony V 1J. Strukturę tego wektora sprawdzono przez analizę sekwencji regionów połączeń, a następnie wykazano porównywalną albo w yższą ekspresję genów heterologicznych w porów naniu z V 1. C) Wektor ekspresyjny V1Jneo Okazało się konieczne usunięcie genu ampr, stosowanego do selekcji na antybiotyku bakterii niosących V 1J, ponieważ ampicylina nie może być stosowana w fermentatorach wielkiej skali. Gen ampr usunięto ze szkieletu puc V 1J przez trawienie enzymami restrykcyjnymi SspI

12 184 839 i Eam 1105I. Powstały plazmid oczyszczono przez elektroforezę na żelu agarozowym, stępiono końce polimerazą DNA T4 i traktowano cielęcą jelitową fosfatazą alkaliczną. Dostępny w handlu gen kanr, uzyskany ztranspozonu 903 i zawarty w plazmidzie puc4k, wycięto stosując enzym restrykcyjny PstI, oczyszczono przez elektroforezę na żelu agarozowym i stępiono końce polimerazą DNA T4. Fragment ten poddano ligacji ze szkieletem V 1J i uzyskano plazmidy z genem kanr w obu możliwych orientacjach, które nazwano V 1 Jneo#1 i #3. Każdy z tych potwierdzono analizą restrykcyjną, sekwencjonowaniem DNA regionów połączeń i jak wykazano powodowały one powstanie podobnych ilości plazmidu co V1J. Ekspresja produktów genów heterologicznych była również dla tych wektorów V 1Jneo porównywalna z V 1J. Jako konstrukt ekspresyjny, wybrano V 1 Jneo#3, określany dalej jako V 1Jneo, zawierający gen kanr w tej samej orientacji co gen ampr. D) Wektor ekspresyjny V1Jns W celu ułatwienia badania integracji, do V 1Jneo wprowadzono miejsce SfiI. W miejscu KpnI w sekwencji BGH wektora dodano dostępny w handlu łącznik SfiI wielkości 13 par zasad (New England Biolabs). V 1Jneo linearyzowano przez trawienie KpnI, oczyszczono na żelu, stępiono na końcach polim erazą DNA T4 i ligowano ze stępionym łącznikiem SfiI. Izolaty klonalne wybrano przez mapowanie restrykcyjne i potwierdzono przez sekwencjonowanie przez łącznik. Nowy wektor określono jako V 1Jns. Ekspresja genów heterologicznych w V 1Jns (z SfiI) była porównywalna z ekspresją tych samych genów w V 1Jneo (z KpnI). E) VIJns-tPA W celu dostarczenia sekwencji heterologicznego peptydu sygnałowego białkom w y- dzielanym i/lub błonow ym, V 1Jns zmodyfikowano w prow adzając sekw encję sygnałow ą ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu (tpa). D w a syntetyczne oligomery kom plementarne hybrydyzowano i ligowano z trawionym B g 1II V 1Jns. Oligomery sensowne i antysensowne m iały sekwencje: 5'GATCACCATGGATGCAATGAAGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTGCTGCTGTG TGG AGCAGTCTTCGTTTCGCCCAGCGA3', Identyfikator Sekw. N r 5; i 5'GATCTCGCTGGGCGAAACGAAGACTGCTCCACACAGCAGCAGCACACAGC AGAG CCCTCTCTTCATTGCATCCATGGT3', Identyfikator Sekw. N r 6. Sekwencję Kozaka podkreślono w oligomerze sensownym. O-ligomery te miały niesparowane zasady kompatybilne z sekwencją ciętą B g1ii. Po ligacji miejsce B g1ii po stronie 5' zostało zniszczone podczas gdy miejsce po stronie 3 ' jest zachowane do dalszych ligacji. Oba miejsca połączeń jak również całą sekwencję sygnałową tpa potwierdzono przez sekwencjonowanie DNA. Oprócz tego, w celu zachowania zgodności z optymalizowanym wektorem V 1Jns (=V 1Jneo z miejscem SfiI) miejsce restrykcyjne SfiI wprowadzono w miejsce KpnI w regionie terminatora BGH V 1Jn-tPA przez stępienie końców m iejsca KpnI polimerazą DNA T4, a następnie ligację z łącznikiem SfiI (Nr kat. 1138, N ew England Biolabs). M odyfikacje tą potw ierdzono przez traw ienie restrykcyjne i elektroforezę na żelu agarozowym. F) pg EM -3-X-IRES-B 7 (w którym X = dowolny gen antygenowy). Jako przykład konstruktu dicistronowego szczepionki zapewniającego rów noczesną ekspresję genu kodującego im m unogen i genu kodującego białko immunostymulujące, mysi gen B7 amplifikowano przez PCR z linii komórkowej chłoniaka z limfocytów B CH 1 (uzyskanej z ATCC). B7 jest członkiem rodziny białek zapewniających istotną kostymulację aktywacji limfocytów T przez antygen w kontekście głównego układu zgodności tkankowej I i II. Komórki C H 1 zapewniają dobre źródło mrna B7 ponieważ w ykazują fenotyp aktywowany konstytutywnie, zaś B7 jest ekspresjonowane przede wszystkim przez aktywowane komórki prezentujące antygen takie jak limfocyty B i makrofagi. Komórki te były dalej aktywowane in vivo przez zastosowanie camp albo IL-4, zaś mrna wytworzono z użyciem standardowych procedur wykorzystujących tiocyjanian guanidyny. Syntezę cdna przeprowadzono stosując to mrna i zestaw GeneAmp RNA PCR kit (Perkin-Elmer Cetus) i starter oligomerowy (5'GTACCTCATGAGCCACATAATACCA- TG3', Identyfikator Sekw. N r 7) specyficzny dla B7 położony poniżej otwartej ramki odczytu B7. B7 am plifikowano przez PCR stosując startery sensow ny i antysensowny o następujących sekwencjach:

184 839 13 5'GGTACAAGATCTACCATGGCTTGCAATTGTCAGTTGATGC3', Identyfikator Sekw. Nr 8; i 5'CCACATAGATCTCCATGGGAACTAAAGGAAGACGGTCTGTTC3', Identyfikator Sekw. Nr 9. Oligomery te zapewniały miejsca restrykcyjne B g1ii na końcach wstawki, jak również sekw encję startu translacji K ozaka zaw ierającą m iejsce restrykcyjne N coi oraz dodatkowe miejsce N coi położone bezpośrednio przed 3'-końcowym miejscem B g 1II. Trawienie NcoI dało fragment odpowiedni do klonowania do pgem-3-ires który trawiono NcoI. Powstały wektor, pg EM-3-IRES-B7, zaw ierał kasetę IRES-B7, którą łatw o m ożna było przenieść do V 1Jns-X, w którym X oznacza gen kodujący antygen. G) p G EM-3-X-IRES- GM- CSF (w którym X = dowolny gen antygenowy). Wektor ten zawierał kasetę analogiczną do opisanej w punkcie C, z takim wyjątkiem, że zamiast B7 zastosowano cytokinę immunostymulującą GM-CSF. GM-CSF jest cytokiną w yw ołującą różnicowanie i stym ulację m akrofagów, która wywołuje, jak opisano silną aktywność przeciwnowotworową limfocytów T in vivo (G. D ranoff i in., PNAS USA 90, 3539 (1993)). H) pg EM -3-X-IRES-IL-12 (w którym X = dowolny gen antygenowy). Wektor ten zawierał kasetę analogiczną do opisanej w punkcie C, z takim wyjątkiem, że zamiast B7 zastosowano cytokinę immunostymulującą IL-12. IL-12 wykazuje kluczową rolę w przesuwaniu odpowiedzi odpornościowej w kierunku szlaku komórkowego, zdominowanego przez limfocyty T, w przeciwieństwie do odpowiedzi humoralnej (L. Alfonso i in., Science 263, 235,1994). Przykład 2 Wytwarzanie wektora V1R W celu ciągłej optym alizacji podstaw ow ego w ektora do szczepienia w ytw orzono pochodną V1 Jns oznaczoną V1R. Celem konstrukcji tego wektora było uzyskanie wektora do szczepienia o minimalnych rozmiarach, bez niepotrzebnych sekwencji DNA, który by wciąż zachowywał ulepszoną charakterystykę ekspresji genów heterologicznych i znaczne ilości uzyskiwanego plazmidu, które zapewniały V 1J i V 1Jns. Określono na podstawie literatury, jak również z doświadczeń, że (1) regiony w szkielecie puc obejmujące początek replikacji E. coli mogą być usunięte bez wpływu na ilość uzyskiwanego z bakterii plazmidu; (2) region 3' genu kanr następujący po otwartej ramce odczytu kanamycyny może być usunięty jeżeli w to m iejsce zostanie wprowadzony bakteryjny terminator; i (3) ~300 bp z połowy 3' terminatora BGH może być usunięte bez wpływu na jego funkcje regulacyjne (po oryginalnym m iejscu restrykcyjnym KpnI w elemencie BGH). V 1R skonstruowano przez zastosowanie PCR w celu syntetyzowania trzech segmentów DNA z V 1Jns stanowiąc, odpowiednio, promotor CMVintA/terminator BGH, początek replikacji i element oporności na kanamycynę. M iejsca restrykcyjne unikalne dla każdego segmentu zostały dodane do każdego końca segmentu przy użyciu oligomerów PCR: SspI i XhoI dla CMVintA/BGH; EcoRV i BamHI dla genu kanr i BclI i SalI dla orir. Te m iejsca restrykcyjne wybrano ponieważ umożliwiały one ukierunkowaną ligację każdego z uzyskanych przez PCR segmentów DNA z następującym po tym zniszczeniem miejsc: EcoRV i SspI pozostawiały tępe końce kompatybilne do ligacji, podczas gdy BamHI i B cli pozostawiały niesparowane zasady kompatybilne do SalI i Xhol. Po uzyskaniu tych segmentów przez PCR, każdy z segmentów trawiono odpowiednim enzymem restrykcyjnym wskazanym powyżej, a następnie ligowano razem w jednej mieszaninie reakcyjnej zawierającej wszystkie trzy segmenty DNA. K oniec 5' orir został zaprojektow any tak, aby zawierał sekw encję niezależnego terminatora T2 rho, który jest normalnie spotykany w tym regionie tak, że m oże zapewnić sygnał terminacji dla genu oporności na kanam ycynę. Ligowany produkt potw ierdzono trawieniem enzymami restrykcyjnymi (>8 enzymów), jak również sekwencjonowaniem DNA przez miejsca połączeń. Ilość uzyskiwanego plazm idow ego DNA i ekspresja genów heterologicznych. z użyciem genów wirusowych w V1R wydaje się być podobna do V 1Jns. Ogólna redukcja wielkości wektora wyniosła 1346 bp (V 1Jns = 4,86 kb; V1R = 3,52 kb). Sekwencje oligom erów PCR zastosowane do syntezy V1R (m iejsca restrykcyjne podkreślono i zaznaczono w nawiasach po sekwencji):