EKOFIZJOLOGIA MIKROORGANIZMÓW WODNYCH

EKOFIZJOLOGIA MIKROORGANIZMÓW WODNYCH I. AKTYWNOŚĆ ENZYMATYCZNA PLANKTONU JEZIORNEGO Prowadzący ćwiczenia: Mgr Tomasz Kaliński 1

Aktywność enzymatyczna mikroplanktonu Uwagi ogólne Aktywność ektoenzymów (m. inn. fosfatazy alkalicznej, aminopeptydazy, β- i α-glukozydazy, N-acetylo-glukozaminazy), enzymów pozakomórkowych (extracellular enzymes) oraz niektórych enzymów wewnątrzkomórkowych (m. inn. esterazy i ureazy) jest, obok szybkości produkcji pierwotnej i wtórnej oraz tempa respiracji, jednym z podstawowych parametrów charakteryzujących aktywność metaboliczną mikroplanktonu. Eksperymentalne określenie aktywności enzymu w wodzie polega na dodaniu do badanej próbki jednego ze standardowych substratów enzymatycznych i pomiarze tempa przyrostu w niej stężenia barwnego lub fluoryzującego produktu reakcji uwalnianego przez badany enzym. Jednakże ze względu na dużą zmienność fizykochemicznych i biologicznych naturalnych środowisk wodnych, ilości i jakości enzymów wytwarzanych przez mikroorganizmy wodne, a także na nie zawsze określone podobieństwo substratu standardowego do substratów naturalnych pomiar rzeczywistej aktywności określonego enzymu in situ jest niezwykle trudny a czasem wręcz niewykonalny. Dlatego też w badaniach ekofizjologicznych rutynowo określa się przede wszystkim tzw. potencjalną aktywność maksymalną enzymu (V max ). Wartość ta charakteryzuje maksymalną aktywność enzymu w badanej próbce wody w określonych warunkach pomiaru i przy całkowitym wysyceniu substratem dodanym do badanej próbki centrum aktywnych enzymu. 2

Stężenie substratu wysycające badany enzym w badanej próbce wody jest zwykle nieznane. Jego doświadczalne wyznaczenie, a przynajmniej oszacowanie, jest warunkiem koniecznym dla ustalenia prawidłowych warunków pomiaru V max. Zarówno ilość i jakość enzymu jak również pula jego naturalnych substratów podlegają w środowiskach wodnych ciągłym i dynamicznym zmianom. Dlatego też stężenie substratu konieczne do wysycenia badanego enzymu w próbkach pobranych z różnych środowisk rzadko bywa podobne. W krańcowych przypadkach, może wahać się ono nawet o rząd wielkości. W praktyce więc zbyt mała (niewysycająca) ilość substratu dodanego do badanych próbek przed pomiarem zaniża w sposób istotny wartość V max, zaś duży jego nadmiar może czasami znacząco hamować aktywność niektórych enzymów. Dokładne doświadczalne wyznaczenie stężenia standardowego substratu wysycającego badany enzym umożliwia procedura opisana w rozdziale Kinetyka reakcji enzymatycznej. Na potrzeby ćwiczeń aktywność badanych enzymów zewnątrzkomórkowych zostanie zmierzona w dwóch frakcjach: frakcji < 3.0 µm zawierającej głównie aktywność związaną z bakteriami swobodnie pływającymi i autotroficznym pikoplanktonem oraz frakcji całkowitej zawierającą także aktywność większych organizmów planktonowych i bakterii osiadłych. W celu określenia aktywności we frakcji > 3 µm należy od Vmax enzymu zmierzonego we frakcji całkowitej odjąć Vmax enzymu zmierzonego we frakcji < 3.0 µm. W celu uzyskania frakcji < 3.0 µm należy przesączyć 50 ml próby przez filtr poliwęglanowy o średnicy porów 3.0 µm. 3

v (nmol/l/godz) Kinetyka reakcji enzymatycznej Uwagi ogólne Zasada pomiaru Szybkość rozkładu enzymatycznego substratów przez większość enzymów hydrolitycznych (np. fosfatazy, aminopeptydazy, itp.) opisuje równanie Michaelis a-menten: V = Vmax x [S] Km + [S] Zależność opisaną wzorem obrazuje wykres przedstawiony na Rys. 1. 60 50 40 30 20 10 0 Vmax 1/2 Vmax Km 0 50 100 150 200 250 [s] (µmol/l) Rys. 1. Zależność szybkości reakcji enzymatycznej od stężenia substratu. 4

v = szybkość reakcji V max = szybkość maksymalna reakcji zachodząca, kiedy wszystkie centra aktywne enzymu zostały wysycone substratem. V max zależy of ilości i aktywności enzymu w badanych próbkach. K m = stężenie substratu, przy którym zachodzi połowiczna szybkość maksymalna reakcji (1/2 V max ). K m charakteryzuje powinowactwo enzymu do substratu (im mniejsza wartość tym większe powinowactwo). K m nie zależy od ilości badanego enzymu w próbce; na jego wartość może wpływać szereg warunków fizykochemicznych środowiska reakcji enzymatycznej (np. obecność stymulatorów i/lub inhibitorów enzymu) [S] = stężenie substratu enzymatycznego Parametry charakteryzujące powyższe równanie wylicza się na podstawie określonej eksperymentalnie zależności szybkości reakcji enzymatycznej (v) od stężenia substratu [S] dodanego do badanych próbek. 5

Aktywność L-Leucyno-Aminopeptydazy (AMP) Zasada oznaczania Aktywność L-leucyno-aminopeptydazy może zostać określona z wykorzystaniem sztucznego substratu L-leucyny-7-amido-4-metylkumaryny (LAMK), którego hydroliza przez aminopeptydazę prowadzi do uwolnienia silnie fluorescencyjnego rodnika 7-amino-metylkumaryny (AMK). Fluorescencję mierzy się przy ekscytacji 380 nm i emisji 440 nm. LAMK L-leucyno- aminopeptydaza L-leucyna + 7-amino-metylkumaryna (silnie fluorescencyjna) Odczynniki 1. Substrat: L-Leucyna-7-amido-4-metylkumaryna (LAMK; m.cz. 324.8) 2. Produkt reakcji: 7-amino-metylkumaryna (AMK; m.cz. 175.2) 3. Etanol 95% (m.cz. 46.0) Przygotowanie odczynników i roztworów Standard 10 nm AMK Rozpuścić 17.52 mg AMK w 10 ml alkoholu etylowego. Roztwór substratu LAMK Odważyć 16.240 mg L-leucyno-7-amido-4-metylkumaryny i w kolbce 25 ml rozpuścić w alkoholu etylowym i dopełnić do kreski. 1 ml tak przyrządzonego roztworu zawiera 2 µm substratu. Po dodaniu 0.1ml tego roztworu do 3.9 ml próbki finalna koncentracja będzie 50 µm. 6

Oznaczenie Kalibracja Roztwory kalibracyjne sporządza się dodając do 3.9 ml wody destylowanej 0.1 ml odpowiedniego stężenia AMK etanolu tak aby ostatecznie uzyskać stężenia 0.5, 1.0, 2.5, 5, 10, 20, 50, 100, 200 nm. Roztwór wyjściowy 2 mm. Próbki wody Należy przygotować serię 7 9 probówek i napełnić je 3.9 ml badanej wody. Przy spektro-fluorymetrze, z timerem w ręku, dodawać do kolejnych 3 probówek po 0.1 ml kolejnych stężeń (LAMK) tak aby uzyskać ostateczne stężenia substratu w próbkach wynosiły 0.25, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 5.0, 7.5, 10.0, 12.5, 15.0 µm. Po dodaniu substratu natychmiast wymieszać i mierzyć fluorescencję (ekscytacja 336, emisja 444 nm) w czasie T 0. Po 20-90 min. inkubacji w ciemności, z timerem w ręku mierzyć fluorescencję próbek ponownie. Wyniki podać jako przyrost stężenia AMK/godz. Blank Blank stanowi fluorescencja AMK (Fb) w badanych próbkach wody, w czasie T 0 inkubacji. 7

Obliczenia Aktywność aminopeptydazy przy określonym stężeniu substratu (v) wyliczyć wg wzoru: AMP (nmol/l/godz) = [(Fp Fb) b ] * 60 a * t F p F b a, b t = fluorescencja próbki badanej po inkubacji = fluorescencja próbki badanej w czasie T 0 inkubacji = współczynniki równania regresji liniowej fluorescencji r-rów kalibracyjnych = czas inkubacji (min) Szybkość reakcji enzymatycznej przy określonym stężeniu substratu (v) oraz parametry kinetyczne hydrolizy LAMK przez AMP (K m +S n,v max oraz T t ) określić analogicznie jak w przypadku EST. 8

Aktywność alkalicznej fosfatazy (APA) Zasada oznaczenia Fosfataza alkaliczna (APA; fosfohydrolaza monoestrów fosforowych; E.C. 3.1.3.1.) reagując z susbtratem sztucznym fosforanem 4-metylumbelliferonu (MUFP) powoduje jego hydrolizę enzymatyczną uwalniając do środowiska reakcji silnie fluorescencyjny rodnik (7-metylumbelliferon), którego fluorescencję mierzy się fluorometrycznie (ekscytacja 365 nm, emisja 460 nm) w środowisku alkalicznym (ph = 10,2). 4-metylumbelliferyl-PO 3-4 + H 2 O APA 3-4-metylumbelliferon + PO 4 (nie fluorescencyjny) H 2 0 (silnie fluorescencyjny) Odczynniki 1. Substrat: 4-metylumbelliferyl-PO 4 3- (MUFP; m.cz. 300.1) 2. Produkt reakcji: 4-metylumbelliferon (MUF; m.cz. 194.2) 3. Eter glikolu etylenowego (Cellosolve) Przygotowanie odczynników i roztworów 1. Roztwór substratu 0,4 mm MUFP Rozpuścić 24 mg MUFP w 1-2 ml Cellosolve, po całkowitym rozpuszczeniu roztwór uzupełnić woda destylowaną do objętości końcowej 20 ml. Uzyskany roztwór rozcieńczyć 10x wodą destylowaną. 1ml tak uzyskanego r-ru roboczego zawiera 0,4 µmol MUFP, i po dodaniu 0.1 ml tegoż 9

roztworu do badanej próbki finalne stężenie MUFP w badanej próbce będzie 10.0 µm. Przygotowany roztwór roboczy, rozcieńczony wodą dejonizowaną użyć do sporządzenia pozostałych roztworów roboczych substratu. 2. Standard 20 µm MUF Rozpuścić 19.4 mg MUF w 10 ml Cellosolve. Rozcieńczyć 5 00x (100x a nastepnie 5x) wodą dejonizowaną. 1 ml tak przygotowanego roztworu zawiera 20 µmol MUF. Oznaczenie Kalibracja Roztwory kalibracyjne sporządza się dodając do 3.9 ml zbuforowanej (ph 8) wody destylowanej 0.1 ml odpowiedniego stężenia rozcieńczonego wodą destylowaną standardu MUF tak, aby ostatecznie uzyskać stężenia 0.5, 1.0, 2.5, 5, 10, 20, 50, 100, 500 nm. Po sporządzeniu rozcieńczeń należy zmierzyć ich fluorescencję (ekscytacja 365 nm, emisja 460 nm) i wykreślić zależność: Fluorescencja = f (S) (krzywą wzorcową). Fluorescencja MUF = a * [S MUF ] + b [S MUF ] = (Fluorescencja MUF b)/a [S MUF ] = stężenie MUF w standardize a, b = współczynniki kierunkowe prostej Próbki wody Należy przygotować serię 7-9 probówek i napełnić je 3.9 ml badanej wody. Przy spektrofluorymetrze, z timerem w ręku, każdą z probówek uzupełnić 0.1 10

ml kolejnego roztworu roboczego MUFP tak, aby ostateczne stężenia substratu w próbkach wynosiły 0.1 0.25, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 5.0, 7.5, 10.0, µm. Po dodaniu substratu każdą z próbek natychmiast wymieszać i zmierzyć fluorescencję (ekscytacja 365, emisja 460 nm) w czasie T 0 (Fb). Po 0.30-60 min. inkubacji w ciemności, z timerem w ręku mierzyć fluorescencję próbek ponownie (F p ). Blank Blank stanowi fluorescencja MUF (Fb) w badanych próbkach wody, w czasie T 0 inkubacji. Obliczenia Aktywność APA przy określonym stężeniu substratu (v) wyliczyć wg wzoru: F p F b a, b t v APA (nmol/l/godz) = [(Fp Fb) b ] x 60 a x t = fluorescencja próbki badanej po inkubacji = fluorescencja próbki badanej w czasie T 0 inkubacji = współczynniki równania regresji liniowej fluorescencji r-rów kalibracyjnych = czas inkubacji (min) Ponieważ zależność szybkości reakcji enzymatycznej od stężenia substratu w badanych próbkach wody ma charakter funkcji hiperboli, aby wyliczyć V max i K m analizuje się równanie regresji nieliniowej zależności v od [S] stosując odpowiedni program komputerowy (np. Origin 6.1 lub Enzfitter, Biosoft). Na podstawie parametrów (V max i K m ) charakteryzujących kinetykę 11

enzymatycznej hydrolizy badanych związków organicznych wylicza się czas potrzebny do całkowitego ich rozkładu w próbkach wody, tzw. "turnover time" (T t ): T t = K m /V max 12