(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/IT00/00158 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 197885 (21) Numer zgłoszenia: 346160 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: 19.04.2000 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: 19.04.2000, PCT/IT00/00158 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: 02.11.2000, WO00/64426 PCT Gazette nr 44/00 (51) Int.Cl. A61K 31/205 (2006.01) A61K 31/6615 (2006.01) A61P 9/10 (2006.01) (54) Kompozycja zawierająca propionylo-l-karnitynę i jej zastosowania (30) Pierwszeństwo: 22.04.1999,IT,RM99A000248 (73) Uprawniony z patentu: SIGMA-TAU HEALTHSCIENCE S.P.A., Pomezia,IT (43) Zgłoszenie ogłoszono: 28.01.2002 BUP 03/02 (72) Twórca(y) wynalazku: Claudio Cavazza,Roma,IT (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 30.05.2008 WUP 05/08 (74) Pełnomocnik: Elżbieta Pietruszyńska Dajewska, POLSERVICE, Kancelaria Rzeczników Patentowych Sp. z o.o. (57) 1. Kompozycja zawierająca propionylo-l-karnitynę, znamienna tym, że zawiera kombinację: (a) propionylo-l-karnityny lub jej farmakologicznie dopuszczalnej soli; oraz (b) fosforanu inozytolu. 17. Zastosowanie kompozycji określonej w zastrz. 1 do wytwarzania leku do leczenia patologii powodowanych przez wolne rodniki, zaburzeń sercowo-naczyniowych lub mózgowych związanych z ostrym albo przewlekłym niedotlenieniem tkanek lub starzeniem, zmian koagulacji krwi takich jak zakrzepica, zaburzeń typu zapalnego, deficytów energii w mięśniach, którym towarzyszy astenia i zmęczenie oraz jako środek pomocniczy w leczeniu form proliferacji tkankowej. PL 197885 B1

2 PL 197 885 B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest kompozycja zawierająca propionylo-l-karnitynę i fosforan inozytolu oraz jej zastosowania do wytwarzania leku i suplementu diety do profilaktyki i/lub leczenia zaburzeń sercowo-naczyniowych i neuromózgowych, różnych form niedotlenienia tkankowego, deficytu energetycznego mięśni, zaburzeń typu zapalnego, zmian koagulacji krwi, takich jak zakrzepica oraz form proliferacji tkankowej. Kompozycja może mieć postać i działać jako suplement diety lub faktyczny lek w zależności od działania wzmacniającego lub profilaktycznego albo bezpośrednio leczniczego, do którego kompozycja ta jest przeznaczona w związku z poszczególnymi przypadkami, w których się ją stosuje. Zarówno karnityny, jak i heksafosforan inozytolu są dobrze znane ze swoich ważnych efektów metabolicznych i farmakologicznych, które doprowadziły do licznych korzystnych odkryć farmakologicznych i klinicznych. Co do karnityn, rola jaką odgrywają w procesach β-utleniania kwasów tłuszczowych i syntezie ATP jest dobrze znana. Przypisuje się im również ważne działanie antyoksydacyjne, ze względu na wykazywany przez nie zapobiegawczy wpływ przeciw lipoperoksydacji fosfolipidowych błon komórkowych oraz przeciw stresowi oksydacyjnemu indukowanemu na poziomie komórek mięśnia sercowego i komórek śródbłonkowych. Te biochemiczne efekty karnityn znajdują odbicie w korzystnych wynikach otrzymywanych w praktyce klinicznej, gdy stosuje się je w leczeniu różnych form miażdżycy naczyń, niedokrwienia mięśnia sercowego, niewydolności naczyń obwodowych lub cukrzycy. Także co do heksafosforanu inozytolu (IP6), opublikowano liczne badania o charakterze zarówno biochemicznym, jak i klinicznym, które dokładnie określają jego działanie i stosowanie do zapobiegania i leczenia różnych zmian patologicznych. Chociaż zainteresowanie tym związkiem datuje się wiele lat wstecz, gdy zdolności nasion pewnych roślin o wysokiej zawartości IP6 do utrzymywania ich stałej zdolności kiełkowania przez długi okres czasu przypisywano antyoksydacyjnemu działaniu IP6, to niedawno badacze zaczęli wykrywać jego przeciwzakrzepowe i przeciwmiażdżycowe właściwości oraz zdolność do ochrony serca przed uszkodzeniem spowodowanym zawałem, jak również zdolność do zapewnienia ochrony przed powstaniem procesów nowotworowych. Te właściwości mogą być częściowo związane z jego wysoką zdolnością antyoksydacyjną, jak również z jego zdolnością do interferencji przy uwalnianiu cytokin i innych produktów indukowanych przez aktywację receptorów regulujących system przetwarzania komórkowego. W rzeczywistości dobrze wiadomo, że heksafosforan inozytolu (IP6) lub fityna, występuje na wysokim poziomie we wszystkich tkankach i komórkach. IP6 stanowi 1-5% wagowych wielu zbóż i roślin strączkowych, takich jak na przykład ryż, pszenica i soja, w których stanowi około 50% zapasu fosforu. W praktyce klinicznej głównymi dziedzinami, w których IP6 jest z powodzeniem stosowany jest przede wszystkim leczenie hipercholesterolemii i miażdżycy naczyń, jak również hiperkalcemii i rozpuszczania kamieni nerkowych. Równie obiecujące wyniki osiągnięto doświadczalnie z zastosowaniem go do hamowania indukowanej przez ADP agregacji płytek krwi lub reperfuzyjnych uszkodzeń organów, takich jak serce. Włączenie go do erytrocytów prowadzi ponadto do większej dostępności wykorzystywanego tlenu, w takich sytuacjach, gdzie wydaje się, że zdolność do wykorzystania tlenu jest obniżona, jak w niedokrwieniu organów, niedokrwistości hemolitycznej, niewydolności płuc i erytrocytozie. Należy powtórzyć, że głównym czynnikiem będącym podstawą tej aktywności IP6 jest jego silne działanie antyoksydacyjne związane przede wszystkim z jego zdolnością chelatowania żelaza. Co do efektów IP6 chroniących układ naczyniowy, nerwowy i przeciwniedotlenieniowych, włączenie go do erytrocytów zwiększa ich trwałość w stosunku do jonów żelaza, które mogą być uwalniane w samych erytrocytach, a ponadto, przez zwiększenie ich powinowactwa do tlenu, wytwarzane są większe ilości dostępnego tlenu na poziomie tkanek, które stawały się niedotlenione. Chociaż antyoksydacyjny wpływ IP6 może tłumaczyć jego korzystną aktywność na poziomie metabolicznym i sercowo-naczyniowym, należy wziąć także pod uwagę inne mechanizmy wyjaśnione w ostatnich badaniach, wiążące się z jego właściwościami przeciwzapalnymi, stymulującymi układ immunologiczny i przeciwnowotworowymi. IP6 i pentafosforan inozytolu, IP5, należą do głównych fosforanów inozytolu obecnych w komórkach. Oprócz modyfikowania powinowactwa hemoglobiny do tlenu i działania jako neurotransmitery, odgrywają one ważną funkcję w przekazywaniu sygnałów z powierzchni komórki do jej wnętrza, w aktywacji genów oraz w tworzeniu cytokin i czynników regulujących wzrost komórki.

PL 197 885 B1 3 W przypadku przeciwnowotworowego działania IP6, postuluje się defosforylację IP6 do IP5 i IP3 oraz obniżenie ilości fosforanów inozytolu charakteryzujących się niższą fosforylacją, których obecność reguluje lub hamuje wzrost komórki. Ponadto IP6 jest zdolny do blokowania aktywności kinazy fosfatydylo-3-inozytolu (kinaza PI-3) i blokowania przez to naskórkowego czynnika wzrostu i przewodzenia sygnałów pozakomórkowych, regulowanego przez aktywację kinazy białkowej. Innym czynnikiem, na którym opiera się przeciwnowotworowa aktywność IP6 jest to, że jego defosforylacja do IP3 uważana jest za wiążącą się z otwarciem odpowiednich kanałów wapniowych, których wzrost jest nie tylko krytycznym elementem w proliferacji komórkowej, ale także ważnym czynnikiem w indukowaniu apoptozy komórkowej. Stwierdzono ponadto, że IP6 konkuruje z receptorami insulinopodobnego czynnika wzrostu (IGF-II) i w związku z tym wykazano, że nadekspresja jego genu powoduje wzrost różnych linii nowotworowych. W każdym razie stwierdzono, że receptory IGF są ważne w inicjowaniu rozrostu komórkowego. Należy rozważyć dwa różne mechanizmy działania przeciwzapalnego, stymulującego układ immunologiczny oraz przeciwnowotworowego IP6. Jeden jest ściśle związany z czynnikami antyoksydacyjnymi, które, jak kwas salicylowy, hamują aktywację przewodzenia genu przez układ NK-kb-IkB, oraz drugi, który poprzez fosforan inozytolu reguluje czynniki wzrostu. Z praktycznego punktu widzenia, co do działania przeciwnowotworowego, udowodniono, że stosowanie IP6 jest skuteczne w hamowaniu nowotworów okrężnicy indukowanych u zwierząt przez azoksymetan, z aktywnością zależną od dawki. Jego stosowanie okazało się równie skuteczne w przypadku nowotworów sutka indukowanych przez 7,12-dimetylobenzantracen (DMBA) lub przez metylonitrozomocznik. Korzystne wyniki otrzymano także stosując IP6 w przypadku nowotworów płuc, prostaty i wątroby. Testy prowadzone na ludziach, głównie na komórkach raka gruczołowego i białaczkowych, zweryfikowały skuteczność przeciwnowotworową IP6. Obecnie niespodziewanie stwierdzono, że kompozycja zawierająca kombinację składników: (a) propionylo-l-karnityny lub jej farmakologicznie dopuszczalnej soli; oraz (b) fosforanu inozytolu wybranego z grupy składającej się z monofosforanu inozytolu, tetrafosforanu inozytolu, pentafosforanu inozytolu, a zwłaszcza heksafosforanu inozytolu (IP6) jest nadzwyczaj skuteczna w profilaktyce i/lub leczeniu zaburzeń sercowo-naczyniowych i neuromózgowych oraz różnych form niedotlenienia tkankowego, zaburzeń typu zapalnego, deficytów energii mięśni oraz form proliferacji tkankowej, w wyniku silnego, niespodziewanego działania synergistycznego wykazywanego przez jej składniki. Stwierdzono także, że składnik (a) może ponadto korzystnie zawierać inną karnitynę, wybraną z grupy składającej się z L-karnityny, acetylo-l-karnityny, butyrylo-l-karnityny, walerylo-l-karnityny i izowalerylo-l-karnityny lub ich farmakologicznie dopuszczalnych soli albo ich mieszanin, i że składnik (b) może dodatkowo zawierać inozytol. Korzystny stosunek wagowy składnika (a) do składnika (b) może wynosić w zakresie od 1:10 do 1:1. Składnik (b) może występować w kompozycji w postaci produktu roślinnego lub ekstraktu z produktów roślinnych o wysokiej zawartości procentowej fosforanów inozytolu. Odpowiednimi produktami roślinnymi są, na przykład, otręby ryżowe lub ryż pełnoziarnisty. Kompozycję według wynalazku można stosować zarówno jako suplement diety lub dodatek odżywczy o działaniu głównie zapobiegawczym, jak i jako lek do leczenia stanów chorobowych. Kompozycja według wynalazku zawiera kombinację: (a) propionylo-l-karnityny lub jej farmakologicznie dopuszczalnej soli; oraz (b) fosforanu inozytolu. Korzystnie fosforan inozytolu wybrany jest z grupy obejmującej monofosforan inozytolu, tetrafosforan inozytolu, pentafosforan inozytolu i heksafosforan inozytolu (IP6). Korzystnie składnik (a) zawiera ponadto karnitynę wybraną z grupy obejmującej L-karnitynę, acetylo-l-karnitynę, butyrylo-l-karnitynę, walerylo-l-karnitynę, izowalerylo-l-karnitynę lub ich farmakologicznie dopuszczalne sole albo ich mieszaniny. Korzystnie składnik (b) zawiera ponadto inozytol. Korzystnie stosunek wagowy (a):(b) wynosi od 1:10 do 1:1. Korzystnie składnik (b) ma postać produktu roślinnego lub zawierającego ten składnik ekstraktu produktu roślinnego. Korzystniej produkt roślinny stanowią otręby ryżowe lub ryż pełnoziarnisty, i/lub ich ekstrakty. Korzystnie dopuszczalna farmakologicznie sól L-karnityny lub alkanoilo-l-karnityny wybrana jest z grupy obejmującej: chlorek, bromek; jodek; asparginian; monoester kwasu asparginowego; cytrynian;

4 PL 197 885 B1 monoester kwasu cytrynowego; winian; fosforan; monoester kwasu fosforowego; fumaran; monoester kwasu fumarowego; glicerofosforan; glukozofosforan; mleczan; maleinian; monoester kwasu maleinowego; orotan; szczawian; monoester kwasu szczawiowego; siarczan; monoester kwasu siarkowego; trichlorooctan; trifluorooctan i metanosulfonian. Korzystnie kompozycja według wynalazku zawiera ponadto witaminy, koenzymy, substancje mineralne i przeciwutleniacze. Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie kompozycji określonej powyżej do wytwarzania suplementu diety do zapobiegania formom niedotlenienia tkanek, zaburzeniom sercowym lub nerwowym, deficytowi energii w mięśniach, astenii i zmęczeniu, zaburzeniom typu zapalnego oraz formom proliferacji tkankowej. Korzystnie składnik (a) kompozycji zawiera ponadto karnitynę wybraną z grupy obejmującej L- -karnitynę, acetylo-l-karnitynę, butyrylo-l-karnitynę, walerylo-l-karnitynę, izowalerylo-l-karnitynę lub ich farmakologicznie dopuszczalne sole albo ich mieszaniny. Korzystnie składnik (b) zawiera ponadto inozytol. Korzystnie kompozycja zawiera ponadto witaminy, koenzymy, substancje mineralne i przeciwutleniacze. Korzystnie suplement diety ma postać odpowiednią do podawania doustnego. Korzystniej suplement diety ma postać tabletek, pigułek, kapsułek, granulatów lub syropów. Przedmiotem wynalazku jest ponadto zastosowanie kompozycji określonej powyżej do wytwarzania leku do leczenia patologii powodowanych przez wolne rodniki, zaburzeń sercowo-naczyniowych lub mózgowych związanych z ostrym albo przewlekłym niedotlenieniem tkanek lub starzeniem, zmian koagulacji krwi takich jak zakrzepica, zaburzeń typu zapalnego, deficytów energii w mięśniach, którym towarzyszy astenia i zmęczenie oraz jako środek pomocniczy w leczeniu form proliferacji tkankowej. Korzystnie składnik (a) kompozycji zawiera ponadto karnitynę wybraną z grupy obejmującej L- -karnitynę, acetylo-l-karnitynę, butyrylo-l-karnitynę, walerylo-l-karnitynę, izowalerylo-l-karnitynę lub ich farmakologicznie dopuszczalne sole albo ich mieszaniny. Korzystnie składnik (b) zawiera ponadto inozytol. Korzystnie kompozycja zawiera ponadto witaminy, koenzymy, substancje mineralne i przeciwutleniacze. Korzystnie lek ma postać odpowiednią do podawania doustnego, pozajelitowego, doodbytniczego lub przezskórnego. Korzystniej lek ma postać tabletek, pigułek, kapsułek, granulatów, syropów, czopków, fiolek lub kropli. Kompozycja według wynalazku zawierająca kombinację następujących składników: a) propionylo-l-karnityny lub jej farmakologicznie dopuszczalnej soli, ewentualnie w kombinacji z inną karnityną, przy czym przez karnitynę rozumie się L-karnitynę lub alkanoilo-l-karnitynę wybraną z grupy zawierającej acetylo-l-karnitynę, butyrylo-l-karnitynę, walerylo-l-karnitynę i izowalerylo-l-karnitynę albo ich farmakologicznie dopuszczalne sole dopuszczone; oraz (b) fosforanu inozytolu wybranego z grupy zawierającej monofosforan inozytolu, tetrafosforan inozytolu, pentafosforan inozytolu, a zwłaszcza heksafosforan inozytolu (IP6) nadaje się do podawania doustnego, pozajelitowego, doodbytniczego lub przezskórnego. Zaskakujący efekt synergistyczny, który osiąga się za pomocą kombinacji karnityn i fosforanów inozytolu, a zwłaszcza propionylo-l-karnityny i IP6, potwierdzono licznymi testami farmakologicznymi (z których niektóre tu poniżej opisano) wybranymi w taki sposób, aby dostarczyć wysoce prawdopodobne wskazania co do zakresu praktycznego stosowania tej kompozycji zarówno w zakresie zapobiegawczo/odżywczym, jak i jako środek ściśle terapeutyczny. Testy toksykologiczne Wiadomo, że zarówno L-karnityna, propionylo-l-karnityna, jak i heksafosforan inozytolu (IP6) charakteryzują się niską toksycznością i są dobrze tolerowane. Te korzystne cechy potwierdzono przez pojedyncze doustne podawanie szczurom i myszom dawek L-karnityny i IP6 wynoszących, odpowiednio 1 g/kg i 750 mg/kg, oraz dawek propionylo-l-karnityny i IP6 wynoszących, odpowiednio, 750 mg/kg i 500 mg/kg, bez wykrycia jakiejkolwiek toksycznej reakcji lub nietolerancji. Dootrzewnowe podawanie szczurom 500 mg propionylo-l-karnityny i 300 mg heksafosforanu inozytolu było również dobrze tolerowane i nie wykryto żadnych toksycznych efektów. Te korzystne cechy niskiej toksyczności potwierdzono również przez wyniki testów obejmujących dzienne doustne podawanie szczurom 300 mg/kg propionylo-l-karnityny wraz z /kg IP6 przez trzydzieści kolejnych dni. Na końcu tych testów nie wykryto ani redukcji wzrostu traktowanych zwierząt, ani zauważalnych zmian

PL 197 885 B1 5 zarówno w wartościach hematokrytycznych, jak i innych zmiennych chemizmu krwi, zwłaszcza glukozy w surowicy, BUN i cholesterolu. Ponadto podczas autopsji nie można było stwierdzić odchyleń ani w tkance badanych głównych organów miąższowych, ani zmian histologicznych. Aktywność przeciwzapalna oceniana na podstawie testu z obrzękiem karageninowym W celu oceny efektu przeciwzapalnego nowej kompozycji zastosowano test z obrzękiem karageninowym, w którym do łap szczura wstrzykuje się karageninę. Wstrzyknięcie 0,1 ml 1% roztworu karageniny (Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA) w podpodeszwową powierzchnię prawej łapy szczura indukowało znaczny obrzęk łapy, który osiągał maksimum intensywności 4-5 godzin po wstrzyknięciu. Obrzęk mierzono za pomocą pletyzmografii rtęciowej w różnych przedziałach czasu, do czwartej godziny po wstrzyknięciu karageniny. Zarówno propionylo-l-karnitynę (250 mg/kg), jak i IP6 (250 mg/kg) podawano doustnie pół godziny przed podpodeszwowym wstrzyknięciem karageniny. Wyniki testu (patrz Tabela 1) wykazują, że zarówno propionylo-l-karnityna, jak i heksafosforan inozytolu wykazały słabe działanie hamujące reakcję zapalną indukowaną przez karageninę, podczas gdy ich połączone użycie było w stanie prawie całkowicie hamować obrzęk spowodowany karageniną, wykazując przez to niespodziewany i zaskakujący efekt synergistyczny propionylo-l-karnityny i heksafosforanu inozytolu. T a b e l a 1 Działanie przeciwzapalne oceniane na podstawie testu z obrzękiem karageninowym % hamowania 1 h 2 h 3 h Propionylo-L-karnityna 250 mg/kg --- 15 ± 0,3 8 ± 0,9 IP6 250 mg/kg 15 ± 1,1 20 ± 2,1 15 ± 0,6 Propionylo-L-karnityna 250 mg/kg + IP6 250 mg/kg 00 ± 4,8 80 ± 7,1 50 ± 3,9 Aktywność przeciwzapalna oceniana na podstawie testu z zapaleniem stawów indukowanym przez kolagen Potwierdzenie przeciwzapalnego wpływu kompozycji według niniejszego wynalazku uzyskano stosując test z zapaleniem stawów indukowanym przez kolagen typu II, według techniki opisanej przez Trenthama (Trentham D.R., J. Exp. Med., 146:857, 1977). W teście tym grupę myszy poddawano immunizacji przez przezskórne wstrzyknięcie u nasady ogona 100 μg naturalnego kolagenu, zemulgowanego w kompletnym adiuwancie Freunda (Difco Labs., Detroit, USA). Po trzech tygodniach zwierzętom tak traktowanym znów wstrzyknięto dootrzewnowo taką samą dawkę zemulgowanego kolagenu. Podczas traktowania propionylo-l-karnityną (/kg) lub heksafosforanem inozytolu (/kg) albo tymi dwoma związkami w kombinacji podawano je doustnie od dnia wstrzyknięcia kolagenu, aż do końca szóstego tygodnia. Jednej grupy zwierząt nie traktowano i służyła ona jako grupa kontrolna. Intensywność obrzęku oceniano przydzielając punkty od 1 do 4. Wyniki tego testu także wykazały silny synergizm pomiędzy propionylo-l-karnityną i heksafosforanem inozytolu. Rzeczywiście, podczas gdy sama propionylo-l-karnityna nie wykazywała hamującego wpływu na obrzęk indukowany przez kolagen, a IP6 wykazywał jedynie słabą redukcję (około 20%), po połączeniu tych dwóch związków hamowanie obrzęku przekraczało 80%. Aktywność przeciwagregacyjna w stosunku do płytek krwi Aktywność przeciwagregacyjna w stosunku do płytek krwi kompozycji według niniejszego wynalazku oceniano w próbkach krwi od zdrowych ochotników. Próbki traktowano cytrynianem sodu, wirowano (145 x g przez 5 min. w 22 C) i liczono liczbę płytek (CA 580=4 Platelet Counter - DelCon). Tę liczbę płytek doprowadzono, w miarę potrzeby, do wartości 300000 płytek/ml przez dodanie PPP (plazma o niskiej zawartości płytek) otrzymanej przez wirowanie krwi przy 1600 x g przez 10 min. w 22 C. Stosowanym środkiem agregacyjnym był kolagen (2,5 ng/ml, 5 ng/ml, a indukowaną agregację mierzono fotometrycznie zgodnie z metodą opisaną przez Borna (Born G.V., Nature, 194:927, 1962).

6 PL 197 885 B1 Agregację płytek mierzono w warunkach podstawowych i po 10 min. inkubowania z samą propionylo- -L-karnityną lub IP6 albo ich kombinacją. Stosowane dawki propionylo-l-karnityny wynosiły 10 ng i 20 ng/ml, podczas gdy dawki IP6 wynosiły 4 ng i 8 ng/ml. Wyniki testów wykazują, że chociaż sama propionylo-l-karnityna nie hamuje agregacyjnego działania kolagenu, sam IP6 redukuje je w 40%. Jednak połączenie tych dwóch związków wykazuje pełne hamowanie aktywności agregacyjnej (100%), które jest wskaźnikiem skutecznego działania synergistycznego pomiędzy propionylo-l-karnityną i IP6. Aktywność przeciw miażdżycy naczyń Aktywność kompozycji według wynalazku przeciw miażdżycy naczyń oceniano dla różnych grup szczurów (samce szczura Wistar), którym podawano pokarm aterogenny przez kolejne sześć tygodni, składający się z 24% kazeiny, 1% cholesterolu, 15% oleju z nasion bawełny, 60% cukru i witaminy D 2 200 mu/g, według zaleceń proponowanych przez Melinowa (Melinow M.R., Alteriosclerosis, 48:105, 1983). W końcu szóstego tygodnia traktowania utworzyły się widoczne miażdżycowe zmiany naczyniowe, które były szczególnie wyraźne na poziomie tętnicy brzusznej. Natężenie tych zmian oceniano metodą morfometryczną, mierząc grubość tętnicy brzusznej i intensywność barwienia indukowanego za pomocą Sudan IV, stosując progresywny system oceny od 1 do 5. W testach tych szczurom podawano dziennie 150 mg/kg propionylo-l-karnityny i 100 mg/kg IP6 wraz z dietą miażdżycową. Wyniki badań prowadzonych na szczurach tak traktowanych wykazały, że chociaż zarówno sama propionylo- L-karnityna, jak i IP6 dawały jedynie słaby efekt ochronny, podanie tych dwóch związków w kombinacji prawie całkowicie zapobiegało występowaniu zmian miażdżycowych, co wykazano przez badanie morfometryczne i barwienie przez Sudan IV, wykazując także w tym przypadku silny efekt synergistyczny połączonych propionylo-l-karnityny i IP6. Wpływ na wysiłek mięśni Ponieważ IP6, który jest bogaty w grupy fosforanowe, jest pożytecznym źródłem energii, przeprowadzono serię testów, aby ustalić czy podawanie go może zwiększyć czas wytrzymałości zmęczeniowej myszy poddawanych wymuszonemu pływaniu w prostokątnym zbiorniku pełnym wody, według techniki opisanej przez Zhenga (Zheng R.L., Acta Pharmacol. Sinica, 14:47, 1993), i czy ten wpływ można zwiększyć stosując go w kombinacji z karnityną, taką, jak na przykład, propionylo-l-karnityna. Testy przeprowadzono na różnych grupach zwierząt traktowanych samą propionylo-l-karnityną (/kg) lub IP6 (100 mg/kg) albo tymi dwoma związkami w kombinacji. Związki podawano doustnie przez trzy dni poprzedzające test. Mierzono czas wytrzymałości zmęczeniowej podczas pływania zwierząt traktowanych w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi. Średni czas wytrzymałości zmęczeniowej podczas pływania był nieco wyższy zarówno u zwierząt traktowanych samą propionylo-l-karnityną, jak i u zwierząt traktowanych samym IP6, natomiast stwierdzono znaczne wydłużenie czasu pływania u zwierząt traktowanych kombinacją propionylo-l- -karnityny i IP6, wykazując oczywisty efekt synergistyczny (patrz Tabela 2). W innej serii testów oceniano wpływ kombinacji propionylo-l-karnityny i IP6 na wymuszony wysiłek mięśniowy, który, jak wiadomo może generować reaktywne rodniki tlenowe (ROS), stany zapalne i uszkodzenie struktur mięśniowych. Wymuszony wysiłek mięśniowy testowano na różnych grupach szczurów przez zmuszanie ich do biegu na ruchomej taśmie o kontrolowanej szybkości i kącie nachylenia, jak opisano przez Li (Li J.X., Acta Pharmacologica Sinica, 20:126, 1999) i Husaina (Husain H., Phatophysicology, 4:69, 1997). Zwierzęta zmuszano do biegu na taśmie o nachyleniu 5 i szybkości 28 m/min. Energia zwierząt osiągała punkt wyczerpania po około 85 min. wysiłku. Test prowadzono w grupach zwierząt, które przez trzy dni poprzedzające test otrzymywały /kg samej propionylo-l-karnityny lub IP6 albo ich kombinację. Odpowiednio po 5 i 30 minutach po ustaniu wysiłku, pobierano od uśmierconych zwierząt próbki mięśnia brzuchatego łydki i wykorzystywano do pomiaru zawartość dialdehydu malonowego (MDA) jako znacznika poziomu lipoperoksydacji za pomocą reakcji z kwasem tiobarbiturowym, według metody opisanej przez Okhawa (Okhawa H., Anal. Biochem., 95:351, 1979). Jak widać na podstawie wyników podanych w Tabeli 3, zarówno sama propionylo-l-karnityna, jak i IP6 były zdolne do redukcji poziomu lipoperoksydacji mięśniowej w homogenacie mięśniowym, co wykryto na podstawie niższego wzrostu MDA, który, przeciwnie, był bardzo wyraźny u zwierząt kontrolnych 5 minut po zakończeniu wysiłku. Z drugiej strony kombinacja propionylo-l-karnityny i IP6 dawała

PL 197 885 B1 7 prawie całkowite zabezpieczenie przeciwko lipoperoksydacji w mięśniach traktowanych zwierząt, wykazując także w tym przypadku synergistyczny efekt propionylo-l-karnityny i IP6. Traktowanie T a b e l a 2 Test na wytrzymałość zmęczeniową podczas pływania Czas pływania (min.) Kontrola 98 ± 15 Propionylo-L-karnityna 116 ± 19 IP6 136 ± 16 Propionylo-L-karnityna + IP6 184 ± 22 Traktowanie T a b e l a 3 Testy na zmęczenie mięśni Zawartość MDA w mięśniach [nmol g -1 (WW)] po 5 min. po 30 min. Kontrola 234 ± 9 225 ± 11 Propionylo-L-karnityna 210 ± 10 212 ± 14 IP6 200 ± 16 205 ± 8 Propionylo-L-karnityna + IP6 175 ± 12 181 ± 12 Wpływ na niedotlenienie neuronów W celu oceny aktywności zabezpieczającej kompozycji według wynalazku w stosunku do uszkodzeń powodowanych niedotlenieniem na poziomie neuronów, przeprowadzono testy z hodowlami neuronów mózgowych piskląt, w których redukcję oddychania komórkowego indukowano przez wprowadzenie do hodowli NaCN. Metabolizm energetyczny hodowli neuronów oceniano przez pomiar stężenia ATP występującego w hodowlach nie traktowanych lub w hodowlach, do których dodawano propionylo-l-karnitynę i IP6 odpowiednio w dawkach 100 i 50 mg/kg. Hodowle neuronów mózgowych piskląt otrzymano według techniki opisanej przez Pettmana (Pettman B., Nature, 281:378, 1979). Cytotoksyczne niedotlenienie indukowano przez dodanie do środowiska hodowli NaCN do końcowego stężenia 1 mmol/l. Po 120 minutach środowisko wymieniano na środowisko nie zawierające NaCN, a metabolizm komórkowy blokowano przez przemycie roztworem buforu chłodzonego lodem. Oznaczenie ATP wykonano zgodnie z procedurą opisaną przez Wernera (Werner A.J., Chromatogr. Biomed. Appl., 421:257, 1987). Wyniki tych testów przedstawiono w Tabeli 4. Pomiar ATP pokazuje, że poziomy ATP są zasadniczo zredukowane w skutek niedotlenienia tkanek i pozostają niskie, nawet po trzydziestominutowym ponownym utlenianiu, natomiast gdy propionylo-l-karnityna lub IP6 są obecne same lub w kombinacji, obserwuje się niższą redukcję poziomu ATP, jak również szybszy powrót do normalnego poziomu ATP. Traktowanie T a b e l a 4 Wpływ na niedotlenienie neuronów nmol ATP/g białka po czasie ponownego utlenienia 0 30 min. Kontrola 9,2 ± 0,9 14,4 ± 1,2 Propionylo-L-karnityna 11,1 ± 1,6 16,3 ± 2,2 IP6 12,4 ± 2,1 16,9 ± 1,9 Propionylo-L-karnityna + IP6 15,8 ± 2,4 23,7 ± 2,3

8 PL 197 885 B1 Aktywność antyproliferacyjna W świetle licznych badań dotyczących zapobiegawczej chemoterapeutycznej aktywności przeciwnowotworowej wykazanej doświadczalnie przez IP6, zwłaszcza przeciwko nowotworom okrężnicy i sutka, oceniano antyproliferacyjną aktywność kompozycji według wynalazku w odniesieniu do proliferacji tkanki skórnej indukowanej doświadczalnie u myszy przez podskórne wstrzykiwanie teleocydyny, która, podobnie jak mirystyniany forbolu zdolna jest do powodowania rakopodobnych zaburzeń proliferacji skóry (Fujiki A., Biochem. Biophys. Res. Comm., 90:976, 1979). Ponieważ reakcjom skórnym indukowanym przez teleocydynę towarzyszy wzrost aktywności dekarboksylazy ornityny, enzym ten można traktować jako znacznik dla reakcji proliferacji i różnicowania stopni jej natężenia. W testach tych teleocydynę wstrzykiwano podskórnie w wydepilowane grzbiety myszy w dawce 5 μg/mysz. Tydzień przed wstrzyknięciem teleocydyny różnym grupom zwierząt podano doustnie propionylo-l-karnitynę (/kg) lub IP6 (100 mg/kg) albo te dwa związki w kombinacji. Pięć godzin po wstrzyknięciu teleocydyny przeprowadzano próbę z dekarboksylazą ornityny na homogenizowanym naskórku zwierząt traktowanych według metody O'Briena'a (O'Brien T.G., Cancer Res., 42 :2841, 1982). Ocenę stężenia dekarboksylazy ornityny w białku ekstraktu z naskórka wykonano według techniki opisanej przez Lowry'ego (Lowry O.H., J. Biol. Chem., 193:265, 1951). Jak widać na podstawie wyników z Tabeli 5 wzrost aktywności dekarboksylazy ornityny indukowanej przez teleocydynę był znacznie zredukowany przez wcześniejsze podanie samej propionylo-l-karnityny lub IP6. Jednak, gdy użyto te dwa związki w kombinacji, redukcja aktywności dekarboksylazy ornityny stała się wyraźna i wysoce znacząca. Traktowanie T a b e l a 5 Aktywność antyproliferacyjna Aktywność dekarboksylazy ornityny nmol CO 2 /60 min./mg białka Kontrola 0,055 ± 0,004 Teleocydyna 2,6 ± 0,4 Propionylo-L-karnityna 2,1 ± 0,2 IP6 1,95 ± 0,2 Propionylo-L-karnityna + IP6 0,58 ± 0,9 Przez farmakologicznie dopuszczalną sól L-karnityny lub alkanoilo-l-karnityny rozumie się każdą sól tych składników z kwasem, która nie powoduje wzrostu niepożądanych efektów toksycznych lub efektów ubocznych. Kwasy te są dobrze znane fachowcom w dziedzinie farmacji. Przykłady odpowiednich soli są następujące: chlorek, bromek; jodek; asparginian; monoester kwasu asparginowego; cytrynian; monoester kwasu cytrynowego; winian; fosforan; monoester kwasu fosforowego; fumaran; monoester kwasu fumarowego; glicerofosforan; glukozofosforan; mleczan; maleinian; monoester kwasu maleinowego; orotan; szczawian; monoester kwasu szczawiowego; siarczan; monoester kwasu siarkowego; trichlorooctan; trifluorooctan i metanosulfonian. Spis soli dopuszczonych do stosowania w farmacji przez FDA podano w Int. J. of Pharm. 33, (1986), 201-217. Kompozycja według wynalazku może także zawierać witaminy, koenzymy, substancje mineralne i przeciw-utleniacze. Odpowiednie zaróbki do stosowania w celu otrzymania kompozycji według wynalazku zależą od szczegółowego sposobu podania i będą oczywiste dla fachowców w dziedzinie przemysłu farmaceutycznego i spożywczego.

PL 197 885 B1 9 Poniżej podano przykłady kompozycji według wynalazku 1) Propionylo-L-karnityna 250 mg 250 mg 2) L-karnityna 150 mg Propionylo-L-karnityna 150 mg 300 mg 3) Mieszanina karnityn 300 mg (L-karnityna 75 mg, acetylo-l-karnityna 75 mg, propionylo-l-karnityna 75 mg, izowalerylo-l-karnityna 75 mg) 300 mg 4) Propionylo-L-karnityna Inozyna 100 mg 5) Mieszanina karnityn (L-karnityna 50 mg, acetylo-l-karnityna 50 mg, propionylo-l-karnityna 50 mg, izowalerylo-l-karnityna 50 mg) Mieszanka fosforanów inozytolu (heksafosforan inozytolu 100 mg, pentafosforan inozytolu 50 mg, tetrafosforan inozytolu 50 mg) Inozyna 100 mg 6) Acetylo-L-karnityna Propionylo-L-karnityna 400 mg Inozyna 7) Propionylo-L-karnityna Inozyna 100 mg Koenzym Q 10 20 mg Witamina E 5 mg β-karoten 10 mg Bioflawonoidy 25 mg Witamina C 25 mg Selen 50 mg Błonnik roślinny 50 μg Stearynian magnezu 5 mg 8) Propionylo-L-karnityna Inozyna 100 mg Kreatyna 100 mg Witamina B 1 1 mg Witamina B 2 3 mg Witamina B 6 5 mg Amid kwasu nikotynowego 5 mg Witamina E 5 mg β-karoten 10 mg Witamina B 12 2 μg Kwas foliowy 700 μg

10 PL 197 885 B1 Zastrzeżenia patentowe 1. Kompozycja zawierająca propionylo-l-karnitynę, znamienna tym, że zawiera kombinację: (a) propionylo-l-karnityny lub jej farmakologicznie dopuszczalnej soli; oraz (b) fosforanu inozytolu. 2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że fosforan inozytolu wybrany jest z grupy obejmującej monofosforan inozytolu, tetrafosforan inozytolu, pentafosforan inozytolu i heksafosforan inozytolu (IP6). 3. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że składnik (a) zawiera ponadto karnitynę wybraną z grupy obejmującej L-karnitynę, acetylo-l-karnitynę, butyrylo-l-karnitynę, walerylo-l-karnitynę, izowalerylo-l-karnitynę lub ich farmakologicznie dopuszczalne sole albo ich mieszaniny. 4. Kompozycja według zastrz. 1 albo 3, znamienna tym, że składnik (b) zawiera ponadto inozytol. 5. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że stosunek wagowy (a):(b) wynosi od 1:10 do 1:1. 6. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że składnik (b) ma postać produktu roślinnego lub zawierającego ten składnik ekstraktu produktu roślinnego. 7. Kompozycja według zastrz. 6, znamienna tym, że produkt roślinny stanowią otręby ryżowe lub ryż pełnoziarnisty, i/lub ich ekstrakty. 8. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że dopuszczalna farmakologicznie sól L-karnityny lub alkanoilo-l-karnityny wybrana jest z grupy obejmującej: chlorek, bromek; jodek; asparginian; monoester kwasu asparginowego; cytrynian; monoester kwasu cytrynowego; winian; fosforan; monoester kwasu fosforowego; fumaran; monoester kwasu fumarowego; glicerofosforan; glukozofosforan; mleczan; maleinian; monoester kwasu maleinowego; orotan; szczawian; monoester kwasu szczawiowego; siarczan; monoester kwasu siarkowego; trichlorooctan; trifluorooctan i metanosulfonian. 9. Kompozycja według zastrz. 1 albo 3, znamienna tym, że zawiera ponadto witaminy, koenzymy, substancje mineralne i przeciwutleniacze. 10. Kompozycja według zastrz. 4, znamienna tym, że zawiera ponadto witaminy, koenzymy, substancje mineralne i przeciwutleniacze. 11. Zastosowanie kompozycji określonej w zastrz. 1 do wytwarzania suplementu diety do zapobiegania formom niedotlenienia tkanek, zaburzeniom sercowym lub nerwowym, deficytowi energii w mięśniach, astenii i zmęczeniu, zaburzeniom typu zapalnego oraz formom proliferacji tkankowej. 12. Zastosowanie według zastrz. 11, znamienne tym, że składnik (a) kompozycji zawiera ponadto karnitynę wybraną z grupy obejmującej L-karnitynę, acetylo-l-karnitynę, butyrylo-l-karnitynę, walerylo-l-karnitynę, izowalerylo-l-karnitynę lub ich farmakologicznie dopuszczalne sole albo ich mieszaniny. 13. Zastosowanie według zastrz. 11, znamienne tym, że składnik (b) zawiera ponadto inozytol. 14. Zastosowanie według zastrz. 11, znamienne tym, że kompozycja zawiera ponadto witaminy, koenzymy, substancje mineralne i przeciwutleniacze. 15. Zastosowanie według zastrz. 11 albo 12, albo 13, albo 14, znamienne tym, że suplement diety ma postać odpowiednią do podawania doustnego. 16. Zastosowanie według zastrz. 15, znamienne tym, że suplement diety ma postać tabletek, pigułek, kapsułek, granulatów lub syropów. 17. Zastosowanie kompozycji określonej w zastrz. 1 do wytwarzania leku do leczenia patologii powodowanych przez wolne rodniki, zaburzeń sercowo-naczyniowych lub mózgowych związanych z ostrym albo przewlekłym niedotlenieniem tkanek lub starzeniem, zmian koagulacji krwi takich jak zakrzepica, zaburzeń typu zapalnego, deficytów energii w mięśniach, którym towarzyszy astenia i zmęczenie oraz jako środek pomocniczy w leczeniu form proliferacji tkankowej. 18. Zastosowanie według zastrz. 17, znamienne tym, że składnik (a) kompozycji zawiera ponadto karnitynę wybraną z grupy obejmującej L-karnitynę, acetylo-l-karnitynę, butyrylo-l-karnitynę, walerylo-l- -karnitynę, izowalerylo-l-karnitynę lub ich farmakologicznie dopuszczalne sole albo ich mieszaniny. 19. Zastosowanie według zastrz. 17, znamienne tym, że składnik (b) zawiera ponadto inozytol. 20. Zastosowanie według zastrz. 17, znamienne tym, że kompozycja zawiera ponadto witaminy, koenzymy, substancje mineralne i przeciwutleniacze. 21. Zastosowanie według zastrz. 17 albo 18, albo 19, albo 20, znamienne tym, że lek ma postać odpowiednią do podawania doustnego, pozajelitowego, doodbytniczego lub przezskórnego. 22. Zastosowanie według zastrz. 21, znamienne tym, że lek ma postać tabletek, pigułek, kapsułek, granulatów, syropów, czopków, fiolek lub kropli. Departament Wydawnictw UP RP Nakład 50 egz. Cena 2,00 zł.