ZASTOSOWANIA SPEKTROMETRII MAS W CHEMII ORGANICZNEJ I BIOCHEMII WYKŁAD I PODSTAWY SPEKTROMETRII MAS

ZAKRESY PROMIENIOWANIA ELEKTROMAGNETYCZNEGO, WYKORZYSTYWANEGO WNAJWAŻNIEJSZYCH METODACH SPEKTRALNYCH 10 4 10 6 10 8 10 10 10 12 10 14 10 16 10 18 10 20 10 22 Hz fale radiowe mikrofale IR VIS UV X γ NMR IR UV-VIS Rtg 10 4 10 2 1 10-2 10-4 10-6 10-8 10-10 10-12 10-14 m

WIDMO EI KWASU OCTOWEGO 100 Jony fragmentacyjne 43 45 O Intensywność względna 50 15 C H 3 C O M = 60 H Jon molekularny 60 0 29 18 31 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 m/z

Abundance WIDMO EI CHOLESTEROLU 9500 9000 8500 8000 7500 7000 6500 6000 5500 #229209: Cholest-5-en-3-ol (3.beta.)- (CAS) $$ Lanol $$ Dyth HO 386 5000 4500 43 275 368 4000 81 107 3500 3000 145 301 2500 2000 161 213 255 1500 231 1000 123 178 m/z--> 500 0 326 65 197 342 40 60 80 100120140160180200220240260280300320340360380

DWA SPOSOBY PREZENTACJI WIDM MASOWYCH 14 208.2 raw data 14 208.2 centroid 12 207.2 12 10 199.2 10 199.2 Intensity (%age) 8 6 194.2 198.2 200.2 201.2 209.2 210.1 211.2 212.2 Intensity (%age) 8 6 194.2 201.2 209.2 4 2 190.2 191.2 192.2 193.1 195.2 196.2 197.1 206.1 203.2 205.1 202.2 204.2 216.1 213.1214.1 215.2 217.2 218.1219.2 4 2 192.2 203.2 212.2 216.1 217.2 0 0 190 195 200 205 210 215 220 Low Resolution M/z 195 200 205 210 215 220 Low Resolution M/z widmo nieprzetworzone (raw data spectrum) widmo po procedurze centroidowania (centroid spectrum)

PYTANIA, NA KTÓRE MOŻE ODPOWIEDZIEĆ SPEKTROMETRIA MAS 1. Jaka jest masa cząsteczkowa związku? Metody: widmo EI 70 ev i np. 12 ev lub łagodne metody jonizacji (FAB, LSIMS, CI, ESI, MALDI) w celu otrzymania jonu molekularnego. 2. Jaki jest skład elementarny związku (wzór sumaryczny)? Metody: dokładny pomiar masy jonu molekularnego i komputerowe dopasowanie możliwych składów elementarnych, badanie profilu izotopowego. 3. Jaka jest budowa cząsteczki związku (wzór strukturalny)? Metody: analiza fragmentacji w standardowym widmie EI, badanie ścieżek fragmentacji poprzez rejestrowanie jonów metastabilnych i jonów powstających w wyniku aktywacji zderzeniowej, dokładne pomiary masy jonów fragmentacyjnych, wymiana izotopowa, otrzymywanie i badanie pochodnych. Identyfikacja związków znanych przez porównanie widma eksperymentalnego z widmami z komputerowej biblioteki widm. 4. Czy związek jest czysty? Metody: zachowanie próbki podczas parowania w źródle jonów, obecność więcej niż jednego jonu molekularnego. 5. Jaki jest skład mieszaniny związków? Metody: chromatografia gazowa lub cieczowa sprzężona ze spektrometrią mas (GC/MS, LC/MS) analiza jakościowa i ilościowa.

H, 2 DOKŁADNE MASY ATOMOWE I SKŁADY IZOTOPOWE NAJLŻEJSZYCH PIERWIASTKÓW 1.00782504, 99.985 2.01410179, 0.015 He, 2 3.01602930, 0.00013 4.00260325, 99.99987 Li, 2 6.01512320, 7.52 7.01600450, 92.48 Be, 1 9.01218250, 100.0 B, 2 10.01293800, 18.98 11.00930530, 81.02 C, 2 12.00000000, 98.892 13.00335484, 1.108 N, 2 14.00307401, 99.635 15.00010898, 0.365 O, 3 15.99491464, 99.759 16.99913060, 0.037 17.99915939, 0.204 F, 1 18.99840325, 100.0 Ne, 3 19.99243910, 90.92 20.99384530, 0.257 21.99138370, 8.82 Na, 1 22.98976970, 100.0 Mg, 3 23.98504500, 78.60 24.98583920, 10.11 25.98259540, 11.29 Al, 1 26.98154130, 100.0 Si, 3 27.97692840, 92.18 28.97649640, 4.71 29.97377170, 3.12 P, 1 30.97376340, 100.0 S, 4 31.97207180, 95.018 32.97145910, 0.750 33.96786774, 4.215 35.96707900, 0.107 Cl, 2 34.96885273, 75.4 36.96590262, 24.6

PROFILE IZOTOPOWE JONÓW W FUNKCJI ICH MASY C 3 H 7 NO 2 C 6 H 12 N 2 O 3 C 15 H 33 N 5 O 9 C 30 H 68 N 10 O 19 C 60 H 138 N 20 O 39 C 150 H 348 N 50 O 99 89 160 427 872 1762 4432 89.05 160.09 427.23 872.47 1762.94 4434.37 89.09 160.17 427.43 89.93 1763.87 4436.69 Masa nominalna Masa monoizotopowa Masa średnia

Przykład widma związku cynoorganicznego

SCHEMAT BLOKOWY SPEKTROMETRU MAS Analizator masy Źródło jonów Detektor Komputer Układ wprowadzania próbki Rejestracja i przetwarzanie wyników

SPEKTROMETR MAS TYPU AMD 604

ŚREDNIA DROGA SWOBODNA CZĄSTKI W GAZIE 0.005 L [ cm] P [ mmhg] P [mmhg] L 760 0.00065 mm 1 0.05 mm 0.1 0.5 mm 1 10-2 5 mm 1 10-3 5 cm 1 10-4 50 cm 1 10-5 5 m 1 10-6 50 m 1 10-7 500 m

WPROWADZANIE PRÓBEK DO SPEKTROMETRU MASOWEGO Ciśnienie atmosferyczne Ciało stałe lotne Ciało stałe nielotne Ciecz czysta lotna Ciecz czysta nielotna Roztwór niezjonizowany Źródło jonów Jony Wysoka próżnia ( < 10-5 mm Hg) Analizator masy Roztwór zjonizowany Gaz

UKŁAD DO WPROWADZANIA LOTNYCH PRÓBEK DO SPEKTROMETRU MAS septum z gumy silikonowej spirala grzejna komora zawór do pompy próżniowej obudowa źródła jonów zawór iglicowy kapilara

UKŁAD DO WPROWADZANIA LOTNYCH PRÓBEK W SPEKTROMETRZE AMD 604

SONDA DO WPROWADZANIA BEZPOŚREDNIEGO ogrzewanie i pomiar temperatury obudowa pręt szlifowany końcówka chłodzenie wodne lub powietrzne probówka (aluminiowa lub kwarcowa)

SONDA DO WPROWADZANIA BEZPOŚREDNIEGO

PODSTAWOWE METODY JONIZACJI STOSOWANE W SPEKTROMETRII MAS Jonizacja elektronowa (Electron Ionization, EI) Jonizacja chemiczna (Chemical Ionization, CI) Bombardowanie szybkimi atomami (Fast Atom Bombardment, FAB) oraz bombardowanie szybkimi jonami (Fast Ion Bombardment, FIB). Obie metody (chociaż druga częściej) określane są też mianem spektrometrii jonów wtórnych w ciekłej matrycy (Liquid Matrix Secondary Ion Mass Spectrometry, LSIMS) Jonizacja polem (Field Ionization, FI) i desorpcja polem (Field Desorption, FD) Termosprej (Thermospray, TS lub Thermospray Ionization, TSI) Elektrosprej, elektrorozpylanie (Electrospray, ES lub Electrospray Ionization, ESI) Jonizacja chemiczna pod ciśnieniem atmosferycznym (Atmosferic Pressure Chemical Ionization, APCI) Desorpcja promieniowaniem laserowym z użyciem matrycy (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization, MALDI) Jonizacja plazmą wzbudzaną indukcyjnie (Inductively Coupled Plasma Ionization, ICP)

ŹRÓDŁO JONÓW DO EI I CI miejsce wprowadzania próbki (prostopadle do płaszczyzny rysunku) elektroda odpychająca katoda + obudowa komory jonizacyjnej (U A = 8000 V) magnes N S - magnes - soczewki ogniskujące elektroda przyspieszająca (U = 0 V) szczelina wejściowa wiązka jonów (do analizatora) E = zeu A Czas przebywania próbki w źródle jonów: ok. 10-6 s

ŹRÓDŁO JONÓW W SPEKTROMETRZE AMD 604

ZALEŻNOŚĆ WYDAJNOŚCI JONIZACJI OD ENERGII ELEKTRONÓW Wydajność jonizacji 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 Energia elektronów [ev]

ANALIZATORY MASY STOSOWANE W SPEKTROMETRII MAS Analizator magnetyczny (magnet analyser, B) Analizator magnetyczny + analizator elektryczny i analizator elektryczny + analizator magnetyczny (BE i EB) Analizator kwadrupolowy (Quadrupole analyser, Q) Pułapka jonowa (Ion Trap lub Quadrupole Ion Trap, IT lub QIT) Analizator czasu przelotu (Time of Flight analyser, TOF) Jonowy rezonans cyklotronowy (Ion Cyclotron Resonance, ICR)

ANALIZATOR MAGNETYCZNY Elektromagnes r Źródło jonów Detektor V r 2 2 m 2V 3 B r = 2 M = 4.83 10 W analizatorze magnetycznym z eb V W AMD 604: B = 1.7 T, r = 60 cm, V = 8000 V M max = 6000 u promień toru jonu zależy zarówno od jego masy (ściślej: m/z), jak i energii

ANALIZATOR ELEKTRYCZNY U 1 (+) Jony o energii ezv U 2 (-) r d U E = 1 2 U d mv 2 r = eze mv 2 =ezv 2 r = 2 V E Promień toru jonów w analizatorze elektrycznym nie zależy od ich masy, a tylko od energii

SPEKTROMETR O PODWÓJNYM OGNISKOWANIU I GEOMETRII NIERA-JOHNSONA (EB) Analizator elektryczny Analizator magnetyczny Szczelina pośrednia Źródło jonów Szczelina wejściowa Szczelina wyjściowa Detektor

SPEKTROMETR O PODWÓJNYM OGNISKOWANIU I GEOMETRII BE Analizator magnetyczny Szczelina pośrednia...... Analizator elektryczny...... Komory zderzeń Szczelina wyjściowa Źródło jonów Szczelina wejściowa Powielacz elektronów

SPEKTROMETR MAS TYPU AMD 604

ANALIZATOR KWADRUPOLOWY

SPEKTROMETR Z ANALIZATOREM KWADRUPOLOWYM Źródło jonów EI Analizator kwadrupolowy Detektor do pompy do pompy sygnał do wzmacniacza

KWDRUPOLOWA PUŁAPKA JONOWA

wiązka światła lasera V Próbka na blaszce stalowej Spektrometr MALDI TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time Of Flight) Laser wiązka jonów droga wiązki jonów = l Detektor Zależność czasu przelotu jonu od jego masy t = l v ev = mv = 2 l 2eV m 2 m = = v = 2eV 2 l t l 2eV 2 2eV m m Znaczenie symboli: m masa jonu (kg) e ładunek elementarny (C) V napięcie przyspieszające (V) v prędkość liniowa jonu (m/s) t czas przelotu jonu (s) l droga wiązki jonów (m)

Schemat spektrometru czasu przelotu (TOF) z reflektorem jonów źródło jonów elementy ogniskujące reflektor jonów detektor

SCHEMAT SPEKTROMETRU MASOWEGO Z ORTOGONALNYM ANALIZATOREM CZASU PRZELOTU SPEKTROMETR GCT FIRMY MICROMASS

JONOWY REZONANS CYKLOTRONOWY

Przykłady widm FT-ICR M = 0.0017 u

Przykłady widm FT-ICR M = 0.0476 u

METODY ANALIZY JONÓW - - ZESTAWIENIE PORÓWNAWCZE Nazwa analizatora Akronim Zakres masy Szybkość analizy Rozdzielczość Tryb pracy Zastosowania Analizator magnetyczny B 1 10 000 niska średnia ciągły analizator o najbardziej ogólnym charakterze, chociaż obecnie praktycznie nie stosowany samodzielnie lecz w połączeniu z analizatorem elektrycznym Analizator magnetyczny + elektryczny BE lub EB 1 10 000 niska wysoka ciągły uniwersalny analizator do pomiarów niskiej i wysokiej rozdzielczości; badania jonów metastabilnych; stosowany jako analizator pierwotny w układach hybrydowych Analizator kwadrupolowy Q 1 2 000 (max. 4000) wysoka niska ciągły uniwersalny analizator niskiej rozdzielczości, dobrze nadaje się do współpracy z GC i HPLC; stosowany także w układach wielostopniowych i hybrydowych (do badania fragmentacji) Pułapka jonowa IT lub QIT 1 3 000 niska niska lub średnia impulsowy jak analizator kwadrupolowy; ponadto umożliwia badania fragmentacji (MS n ) Analizator czasu przelotu TOF 10 1000000 bardzo wysoka wysoka impulsowy obecnie coraz popularniejszy, także jako końcowy analizator w układach hybrydowych; bardzo szeroki zakres mierzonych mas Jonowy rezonans cyklotronowy ICR 1 2 000 niska bardzo wysoka impulsowy pomiary specjalne: pomiary b. wysokiej rozdzielczości, analiza fragmentacji, reakcje jonowo-cząsteczkowe

ZASADA DZIAŁANIA POWIELACZA ELEKTRONÓW z analizatora masy (spektrometru) szczelina wyjściowa jony (+) - U 1 U 2 < U 1 - U 2 R elektrony (-) R dynody R R R R R Schemat uproszczony w rzeczywistości liczba dynod wynosi 20-30 R R k - "kubek Faradaya" do rejestratora +