Ćwiczenie laboratoryjne nr 5 dla e-rolnictwa (3 - skrypt). Metody chromatograficzne rozdział białka i jonów amonowych na kolumnie wypełnionej żelem Sephadex G-25. Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest zapoznanie studentów z podstawami teoretycznymi metod chromatograficznych stosowanych bardzo często w laboratorium biochemicznym. Ponadto studenci zapoznają się z frakcjonowaniem związków na zasadzie różnic w ich masach cząsteczkowych metodą sączenia na żelu Sephadex. Wiadomości wstępne Chromatografia jako metoda rozdzielania składników mieszanin różnych substancji jest bardzo szeroko stosowana w pracach biochemicznych. Rozdział chromatograficzny jest wynikiem zróżnicowanego powinowactwa poszczególnych składników mieszaniny do fazy stacjonarnej i ruchomej, w których ten proces zachodzi. Powinowactwo z kolei jest uzależnione od stopnia adsorpcji, wymiany jonów i rozpuszczalności związków w określonych warunkach rozdziału oraz masy cząsteczkowej związku. W praktyce w każdym procesie chromatograficznym współdziałają ze sobą przynajmniej dwa spośród tych zjawisk. W zależności od przewagi czynników działających różnicująco na rozdzielane substancje można wydzielić 4 zasadnicze metody chromatograficzne: chromatografię adsorpcyjną, jonowymienną, podziałową i sita molekularnego. Chromatografia adsorpcyjna. Jest to najstarsza metoda chromatograficzna. Opiera się ona na zjawisku adsorpcji, czyli przechwytywaniu z roztworu cząsteczek różnych substancji i wiązania ich za pomocą słabych oddziaływań fizykochemicznych występujących na powierzchni adsorbenta. Powinowactwo rozdzielanych związków do adsorbenta jest funkcją ich budowy chemicznej, charakteru adsorbenta i stosowanych rozpuszczalników. Adsorbentem jest nierozpuszczalna w stosowanym rozpuszczalniku substancja, nie reagująca z rozdzielanymi związkami, zazwyczaj uformowana w postaci kolumny w rurce szklanej lub plastikowej. Na szczycie kolumny, zrównoważonej rozpuszczalnikiem, umieszcza się mieszaninę związków rozpuszczonych we właściwym, zwykle niepolarnym rozpuszczalniku, i po wsiąknięciu przemywa następnymi porcjami tego samego rozpuszczalnika. Ponieważ różne związki wykazują różne powinowactwo do adsorbenta, w czasie przesuwania się roztworu po powierzchni jego cząstek następuje rozdzielenie mieszaniny na poszczególne składniki. Ruchliwość chromatograficzna związków jest odwrotnie proporcjonalna do ich powinowactwa sorpcyjnego i dlatego substancje słabo adsorbujące się (o mniejszym powinowactwie) przesuną się na większą odległość niż substancje silnie adsorbowane (o większym powinowactwie). Przy rozdzielaniu substancji barwnych jest to widoczne bezpośrednio. Można wówczas zawartość kolumny wypchnąć z rurki, pociąć na warstwy odpowiadające poszczególnym związkom, wymyć odpowiednim rozpuszczalnikiem i oznaczyć ilościowo. Można także, w miarę rozwijania kolumny, zbierać frakcje określonej objętości wypływające z dolnego jej końca. Jakość rozdziału zależy w dużym stopniu od równomiernego wypełnienia kolumny adsorbentem. Stosowane adsorbenty dzieli się na 3 grupy zależnie od ich zdolności sorpcyjnej, mianowicie na: 1) słabe sacharoza, skrobia, celuloza, węglan sodowy, 2) średnie węglan wapniowy, fosforan wapniowy, węglan magnezowy, tlenek magnezowy, 3) silne krzemian magnezowy, tlenek glinowy, węgiel aktywowany. Kolumnę można wypełnić adsorbentem bądź na sucho, przez wsypywanie małych porcji i równomierne lekkie ubijanie, bądź na mokro, przez wlewanie zawiesiny adsorbenta w rozpuszczalniku. Najczęściej stosowane są rozpuszczalniki niepolarne lub o niskiej polarności, takie jak heksan, benzen, eter naftowy, cykloheksan, toluen, chloroform i różne alkohole. 1
Uwaga! Toluen i benzen ze względu na działanie rakotwórcze stosuje się z największą ostrożnością. Chromatografia adsorpcyjna ma zastosowanie przy rozdzielaniu licznych związków niepolarnych, takich jak tłuszcze, sterydy, karotenowce, chlorofile. Rozdział oparty na zjawisku adsorpcji towarzyszy także w pewnym stopniu innym metodom chromatograficznym. Chromatografia jonowymienna. Jest to metoda stosowana do rozdzielania substancji o charakterze jonowym i polega na wymianie jonów między związkami rozdzielanymi zawartymi w mieszaninie i substancją wiążącą, czyli jonitem. Jako substancje wiążące stosowane są nierozpuszczalne żywice wielkocząsteczkowe, zawierające liczne grupy dysocjujące. Główne zastosowanie mają jonity syntetyczne, tzw. żywice, w których do wysoce spolimeryzowanych i rozgałęzionych węglowodorów wbudowane są liczne grupy funkcyjne zdolne do dysocjacji. Jako jonity mogą być stosowane między innymi pochodne celulozy i sefadeksu. W zależności od rodzaju zdolnych do dysocjacji grup funkcyjnych jonity dzielimy na kationity i anionity. Kationity dysocjują na ruchliwy kation i związany z nierozpuszczalną siecią anion, anionity zaś odwrotnie, na ruchliwy anion i związany z siecią kation. Oddysocjowane kationy (najczęściej H + i Na + ) i aniony (najczęściej OH ) mogą być wymieniane na inne jony pochodzące z roztworu. W wyniku działania sił elektrostatycznych między jonami jonitu i jonami rozdzielanych związków następują reakcje wymiany. Zależnie od wypadkowego ładunku każdego z tych związków ich powiązanie z jonitem wykazuje różny stopień trwałości i dlatego mogą one być wymywane selektywnie z kolumny za pomocą roztworów o odpowiedniej sile jonowej. Na tej podstawie następuje rozfrakcjonowanie składników mieszaniny. Chromatografia sita molekularnego. Rozdział mieszaniny tą metodą opiera się na różnej szybkości migracji poszczególnych związków przez złoże utworzone z granulek żelu o porach określonej wielkości. Szybkość ta jest uzależniona od wielkości cząstek rozdzielanych związków. Najbardziej rozpowszechnionym preparatem do rozdziału tą metodą jest żel dekstranowy Sephadex firmy Pharmacia, z którego po napęcznieniu formuje się kolumnę w rurce szklanej. Żel ten zbudowany jest z łańcuchów α-d-glukozy połączonych między sobą mostkami poprzecznymi z epichlorohydryny (Rys. 1). Od liczby tych mostków zależy wielkość porów, a od niej z kolei zdolność rozdzielcza żelu. Rys. 1. Struktura Sephadexu. Istnieją preparaty Sephadexu o różnej, ściśle określonej wielkości porów, dostosowane do rozdziału cząsteczek różnej wielkości. Najważniejsze ich typy mają następującą charakterystykę (Tab. 1): 2
typ zdolność wiązania H 2 O w g/g s.m. preparatu Średni rozmiar oczek sita (mesh) Zdolność rozdzielcza cząsteczek w Da G-25 2,5 2500 100-5000 G-50 5,0 15000 500-10000 G-100 10,0 65000 1000-100000 G-200 20,0 150000 1000-200000 Tabela 1. Wybrane cechy rożnych typów żeli Sephadex dostępnych w sprzedaży. W miarę rozdzielania na kolumnie z sefadeksu mieszaniny złożonej np. z trzech związków, różniących się masą cząsteczkową, będzie zachodził następujący proces. Duże cząsteczki (większe od wielkości porów) nie są w stanie wnikać w pory granulek żelu ze względu na swój rozmiar, wobec czego będą szybko przemieszczać się przez wolne przestrzenie między granulkami i wędrować w dół kolumny wraz z czołem rozpuszczalnika (Rys. 2). Prędkość przemieszczania się wzdłuż żelu cząsteczek mniejszych zdolnych do dyfundowania przez pory jest niejednakowa i odwrotnie proporcjonalna do ich masy cząsteczkowej, tzn. większe cząsteczki wędrują szybciej niż mniejsze. Im mniejsza jest więc cząsteczka, tym droga jej migracji przez złoże kolumny jest dłuższa i dłuższy czas wypływu. Rys 2. Przepływ przez kolumnę wypełnioną sefadeksem związków nisko- i wysokocząsteczkowych. Procesowi sączenia na sicie utworzonym z porowatych granulek żelu towarzyszą często zjawiska adsorpcji i podziału. Żel Sephadex stosowany jest do: rozdzielania mieszanin na kolumnie, odsalania w roztworze substancji wysokocząsteczkowych, wyznaczania mas cząsteczkowych, zagęszczania roztworów substancji wysokocząsteczkowych. Żel Sephadex stosuje się najczęściej do oznaczania orientacyjnej masy cząsteczkowej białek. Można także mierzyć objętość roztworu wypływającego z kolumny od momentu startu do wpływu nieznanego białka i porównując go z objętością roztworu, przy której wypływa białko o znanej masie cząsteczkowej, wnioskować o masie cząsteczkowej białka nieznanego. Przy zagęszczaniu roztworów substancji wysokocząsteczkowej wykorzystuje się zdolność pęcznienia żelu. Dobierając odpowiedni typ preparatu, można doprowadzić do pochłaniania przez żel wody i związków o niskiej masie cząsteczkowej, a pozostawiania na zewnątrz żelu składnika zagęszczonego. Zagęszczanie prowadzi się przez wsypanie określonej ilości suchego sefadeksu do zlewki z roztworem; po jego napęcznieniu oddziela się żel przez wirowanie lub filtrowanie. Chromatografia podziałowa. W metodzie tej rozdział mieszaniny na poszczególne składniki jest oparty na różnej rozpuszczalności rozdzielanych związków w dwóch nie mieszających się fazach ciekłych: fazie stacjonarnej i fazie ruchomej. Prędkość migracji poszczególnych związków jest 3
uzależniona od stopnia ich rozpuszczalności w obu tych fazach. Stosunek stężenia rozdzielanej substancji w fazie stacjonarnej (A 1 ) do jej stężenia w fazie ruchomej (A 2 ) nosi nazwę współczynnika podziału (α): α = A A 1 2 Różne związki charakteryzują się różnymi wartościami współczynnika α i to umożliwia ich rozdział chromatograficzny. Najszerzej stosowanymi typami tej metody są chromatografia bibułowa i cienkowarstwowa. W chromatografii bibułowej rolę nośnika pełni bibuła chromatograficzna, która wraz z naniesioną mieszaniną związków zostaje zanurzona w układzie rozpuszczalników (faza rozwijająca). Nanosi się na nią punktowo mieszaninę związków i koniec najbliższy, ale poniżej punktu naniesienia zanurza się w układzie rozpuszczalników. Układ taki składa się z rozpuszczalników o różnej polarności, np. butanol woda. Zachodzi wówczas następujący proces: nośnik, czyli celuloza, tworzy z fazą polarną kompleks wskutek właściwości hydrofilowych bibuły, wobec czego faza ta zostaje unieruchomiona i stąd nosi nazwę fazy stacjonarnej. Faza ta jest sukcesywnie przemywana przez przesuwającą się po niej ruchomą fazę niepolarną, którą w tym wypadku będzie butanol. W trakcie tej migracji naniesiona na bibułę mieszanina ulega podziałowi ze względu na różną rozpuszczalność poszczególnych składników w obydwóch fazach. Droga przemieszczenia tych składników od punktu naniesienia w trakcie tzw. rozwijania chromatogramu będzie więc różna. Na przykład, związki rozpuszczające się lepiej w rozpuszczalnikach polarnych (fazie stacjonarnej) przesuwają się na mniejszą odległość niż związki lepiej rozpuszczalne w rozpuszczalnikach o mniejszej polarności (fazie ruchomej). Prędkość wędrówki poszczególnych składników w określonych warunkach wyraża się tzw. współczynnikiem przesunięcia (Rf): przesunięcie badanej substancji Rf = przesunięcie czoła rozpuszczalnika Wartość Rf badanej substancji zależy przede wszystkim od współczynnika podziału (α), a więc od rodzaju fazy rozwijającej, oraz takich warunków, jak: wysycenie kamery parami rozpuszczalników, temperatura otoczenia, rodzaj bibuły i czystość odczynników. W chromatografii bibułowej można stosować technikę wstępującą, zstępującą i krążkową. W technice wstępującej układ rozpuszczalników podsiąka od dołu arkusza bibuły ku górze, w technice zstępującej spływa pionowo z góry w dół, a w technice krążkowej podsiąka za pomocą "knota" od środka krążka bibuły umieszczonego poziomo i rozprzestrzenia się promieniście. W celu zlokalizowania i zidentyfikowania rozdzielonych związków chromatogram wywołuje się spryskując go po wysuszeniu roztworem odpowiedniego odczynnika dającego z tymi związkami reakcję barwną. Jeżeli rozdzielone związki fluoryzują lub pochłaniają światło ultrafioletowe, to można je łatwo zlokalizować oglądając chromatogram w świetle ultrafioletowym o odpowiedniej długości fali. Ze względu na znaczne uzależnienie wartości Rf od warunków rozdziału przy identyfikacji rozdzielonych związków należy raczej posługiwać się wzorcami, tj. roztworami znanych związków o bardzo wysokiej czystości, których występowanie w rozdzielanej mieszaninie jest spodziewane. Związki takie nakrapla się na tym samym chromatogramie obok mieszaniny związków nieznanych, rozwija w tych samych warunkach, a następnie po wywołaniu chromatogramu porównuje ich barwę i współczynniki Rf. 4
W chromatografii cienkowarstwowej warstwę nośnika sporządza się na płytce szklanej lub plastikowej. Jako nośnik stosuje się najczęściej celulozę, żel krzemionkowy, tlenek glinowy. Warunki i zasady rozdziału oraz metody identyfikacji w technice cienkowarstwowej są takie same jak w technice bibułowej, przy czym szybkość rozdziału jest tu znacznie większa i w pewnych wypadkach może wynosić zaledwie kilkanaście minut. Stąd technika ta ma w pracach laboratoryjnych coraz większe zastosowanie. Rozdział białka i jonów amonowych na kolumnie wypełnionej żelem Sephadex G-25. Wprowadzenie Chromatografia sita molekularnego znalazła zastosowanie m.in. przy odsalaniu substancji wysokocząsteczkowych, np. białek, od związków niskocząsteczkowych. Proces ten zastępuje długotrwałą i często kłopotliwą dializę, podczas której składniki niskocząsteczkowe przenikają przez błonę półprzepuszczalną. Odsalanie przeprowadza się na kolumnie sporządzonej z żelu Sephadex G-25. Rozdział taki można przyrównać do chromatografii podziałowej, przyjmując, że na objętość całkowitą żelu w kolumnie V c przypada objętość rozpuszczalnika nie związanego z żelem V o, objętość rozpuszczalnika związanego z żelem V i i objętość samego żelu V g : V c = V o + V i + V g Rozpuszczalnik nie związany z żelem można więc traktować jako fazę ruchomą, a związany z żelem jako fazę stacjonarną. Objętość rozpuszczalnika nie związanego z żelem V o wyznacza się najczęściej stosując błękit dekstranowy związek barwny o wysokiej masie cząsteczkowej, wędrujący w kolumnie z czołem rozpuszczalnika. W wypadku sączenia molekularnego fazę ruchomą i stacjonarną stanowi zwykle ten sam roztwór. Przy określonej szybkości przepływu rozpuszczalnika przez kolumnę substancje przesuwają się tym wolniej, im łatwiej wnikają do wnętrza żelu, a więc przy podobnej rozpuszczalności rozdzielanych składników w cieczy elucyjnej im mniejszą mają masę cząsteczkową. Przy zastosowaniu kolumny z żelu Sephadex G-25 do odsalania białka od siarczanu amonowego jako rozpuszczalnik używana jest woda. Stanowi ona zarówno fazę stacjonarną, jak i ruchomą. W takich warunkach duże cząsteczki białka, niezdolne do wnikania do wnętrza żelu, wędrują z czołem rozpuszczalnika. Pojawienie się białka w eluacie (czyli objętość elucyjna V e ) odpowiada równocześnie objętości zerowej kolumny (V o ) V e białka = V o Składniki soli natomiast wnikają bez trudu do rozpuszczalnika wypełniającego pory sefadeksu i dlatego wędrują znacznie wolniej. Ich objętość elucyjna będzie więc sumą objętości rozpuszczalnika nie związanego z żelem (V o ) i związanego z żelem (V i ). V e soli = V o + V i Przebieg procesu odsalania kontrolowany jest przez oznaczanie rozdzielanych składników w eluacie z kolumny. Do wykrywania białka w eluacie stosowana jest metoda Lowry ego. W metodzie tej wykorzystuje się dwie cechy budowy białek: obecność wiązań peptydowych oraz obecność aminokwasów aromatycznych. Metoda ta składa się z 2 etapów, w pierwszym zachodzi reakcja biuretowa (tworzenie barwnych kompleksów przez wiązania peptydowe i jony miedziowe w 5
środowisku zasadowym). W drugim etapie metody reakcja biuretowa jest wzmocniona reakcją z odczynnikiem Folina-Ciocalteu, w której kwasy: fosforomolibdenowy i fosforowolframowy ulegają redukcji do odpowiednich tlenków z udziałem głównie tyrozyny i tryptofanu. Stężenie barwnego (fioletowego) kompleksu można mierzyć w zakresie widma widzialnego długości 600 750 nm. Podobnie jak w innych metodach kolorymetrycznych stężenie białka odczytuje się z krzywej wzorcowej. Jony amonowe w eluacie wykrywane są za pomocą odczynnika Nesslera (silnie alkaliczny roztwór jodku rtęciowego w jodku potasowym), który daje barwny kompleks o natężeniu barwy proporcjonalnym do stężenia NH + 4 w badanej próbie. Tworzenie się barwnego kompleksu przedstawia reakcja: NH 4 OH + 2(KI) 2 HgI 2 + 3KOH NHg 2 I + 7KI + 4H 2 O barwny kompleks Odczynniki: 1. Sephadex G-25 drobnoziarnisty (fine). 2. Odczynnik Nesslera. 3. Odczynnik miedziowy (patrz str. 20). 4. Odczynnik Folina (wykonanie patrz str. 131). 5. 2,5-proc. roztwór białka w 5-proc. siarczanie amonowym. Wykonanie Ćwiczenie wykonuje się w zespołach 2-osobowych. Studenci oddzielają białko od soli amonowej na kolumnie z Sephadeksem G-25, ponadto oznaczają zawartość białka w roztworze wyjściowym nanoszonym na kolumnę oraz w eluacie, a także wykrywają jony amonowe. 1. Sporządzanie kolumny. Kolumnę formuje się z uprzednio napęczniałego wodą żelu Sephadex G-25 (1). Rurę chromatograficzną o wymiarach dostosowanych do rodzaju rozdzielanej mieszaniny (długość) i ilości substancji (średnica) zawierającą przy wylocie zwitek z waty szklanej umocować pionowo w statywie i napełnić jednorazowo żelem do wysokości ok. 20 cm. Na powierzchni żelu ułożyć delikatnie krążek z bibuły filtracyjnej w celu zabezpieczenia kolumny przed uszkodzeniem. Następnie otworzyć kran, aby płyn wyciekał z szybkością 15 20 kropli na minutę i przemywać kolumnę 2 3-krotną objętością wody dejonizowanej. 2. Rozdział na kolumnie (studenci wykonują parami). Wyskalować 20 probówek na 1 ml i jedną probówkę na 5 ml. Z przygotowanej kolumny wypełnionej Sephadexem G-25 zdjąć zacisk z końcówki i odsączyć wodę znad żelu. Gdy warstwa H 2 O nad żelem będzie wynosiła ok. 1 mm zakręcić zacisk kolumny, nanieść ostrożnie pipetą (aby nie naruszyć żelu) 2 ml roztworu białkowego (5) i pod wylot kolumny podstawić probówkę wyskalowaną na 5 ml, po czym odkręcić zacisk. Po prawie całkowitym wniknięciu naniesionego roztworu w żel również ostrożnie nanieść na kolumnę 1 ml wody w celu wmycia białka i soli do wnętrza żelu. Po wniknięciu i tej porcji czynność powtórzyć jeszcze raz. Następnie kolumnę nad żelem napełnić ostrożnie wodą i utrzymywać jej objętość na względnie stałym poziomie przez cały czas prowadzenia rozdziału. Po zebraniu pierwszych 5 ml podstawić kolejne wyskalowane na 1 ml probówki, zbierając do nich następne frakcje po 1 ml. W sumie zebrać 20 frakcji, po czym zamknąć wylot kolumny za pomocą ściskacza. 3. Oznaczanie zawartości białka w próbie wyjściowej i frakcjach wycieku z kolumny. W celu oznaczenia zawartości białka w roztworze wyjściowym należy przenieść dokładnie 2 ml tego roztworu do kolby miarowej na 50 ml, kolbę dopełnić wodą do kreski i dobrze wymieszać. Do 2 probówek pobrać po 1 ml roztworu, do 3 probówki dodać 1 ml H 2 O (próba materiałowa), do wszystkich probówek dodać po 5 ml odczynnika miedziowego (3), wymieszać i po upływie 10 min dodać, intensywnie wstrząsając probówkę, po 0,5 ml odczynnika Folina (4). Po 30 min mierzyć intensywność zabarwienia w kolorymetrze przy długości fali 670 nm wobec próby materiałowej. 6
Uzyskaną wartość absorbancji (A) przeliczyć na µg białka, wykorzystując w tym celu krzywą wzorcową (ew. własną, wykonaną w ramach kursu). W celu oznaczenia zawartości białka w kolejnych frakcjach wycieku z kolumny należy pobrać pipetą po 0,1 ml z frakcji od 1 do 10, uzupełnić wodą do 1 ml i postępować dalej jak podano przy oznaczeniu białka w próbie wyjściowej. Do wyzerowania fotometru równolegle trzeba przygotować próbę materiałową (z 1 ml wody). 4. Wykrywanie jonu amonowego. Do czystych probówek pobrać kolejno po 0,1 ml roztworu z frakcji od 6 do 18, do każdej dodać po 4,4 ml wody dejonizowanej i po 0,5 ml odczynnika Nesslera (2); całość dobrze wymieszać i obserwować intensywność wytworzonego pomarańczowego zabarwienia. Opracowanie wyników W sprawozdaniu należy podać wyniki pomiarów stężenia białka w roztworze wyjściowym i w eluacie, obliczyć procent odzyskanego białka w stosunku do naniesionego na kolumnę. Ponadto wskazać numery frakcji, w których pojawia się jon NH 4 +, osiąga maksimum i zanika, oraz obliczyć objętość zerową kolumny na podstawie objętości potrzebnej do wyeluowania maksymalnego stężenia białka. Pytania 1. Na jakich zasadach opiera się rozdział substancji w metodach chromatografii: adsorpcyjnej, jonowymiennej i podziałowej? 2. Co to są jonity? Jaki jest mechanizm działania kationitu, a jaki anionitu? 3. Którą z metod chromatograficznych można zastosować do rozdziału mieszaniny aminokwasów? Uzasadnić odpowiedź. 4. Jakie techniki stosuje się w chromatografii podziałowej? Na czym one polegają? 5. Co to jest współczynnik Rf? Od czego zależy jego zawartość? 6. Co to jest współczynnik podziału α? 7. Na jakiej zasadzie opiera się rozdział substancji metodą chromatografii sita molekularnego? 8. Jakie zastosowania w biochemii może mieć Sephadex? 9. Jak zbudowany jest żel Sephadex? 10. Od czego zależy zdolność rozdzielcza żelu Sephadex? 11. W jaki sposób można się przekonać o skutkach rozdziału mieszaniny na kolumnie z sefadeksu? 12. W jakiej kolejności wypływają z kolumny wypełnionej żelem Sephadex G-25 i G-100 jon amonowy, peptyd protamina (2 3 kda) i pepsyna (35 kda)? 13. Na jakiej zasadzie oparty jest proces odsalania białek? 14. Wymień dwie właściwości odróżniające Sephadex G-25 od G-200. 15. Opisać zasady metod oznaczania stężenia rozdzielanych związków we frakcjach zbieranych po kolumnie. 7