WYKŁAD 6 PRÓBKA PIERWOTNA PRZYGOTOWANIE PRÓBKI OBIEKT POMIARU PRÓBKA ANALITYCZNA PROCES ANALITYCZNY POBIERANIE PRÓBKI STRATEGIA POBIERANIA PRÓBKI POMIAR SYSTEM SYGNAŁ POMIAROWY REJESTRACJA/OCENA WYNIK POMIARU KALIBRACJA BADANY OBIEKT PROBLEM WYNIK ANALIZY ZMIENNE UKRYTE METODY CHEMO- METRYCZNE INERPRETACJA INFORMACJA PERCEPCJA ROZWIĄZANIE PROBLEMU KALIBRACJA Kalibracja - proces, w którym wyznaczana jest zależność funkcyjna pomiędzy mierzonym, w danej metodzie, sygnałem a wielkością określającą ilość oznaczanego składnika, na podstawie danych obarczonych błędami przypadkowymi. Kalibracja instrumentu (cechowanie, wzorcowanie) - proces, w którym przenoszona jest nominalna (certyfikowana) wartość przypisana do wzorca (próbki wzorcowej) na rzeczywiste wartości sygnału otrzymywane przy pomiarze danym instrumentem. Kalibracja metody polega na wyznaczeniu funkcji pomiarowej F (zwanej także funkcją kalibracyjną): y = F(x) gdzie: y - mierzony sygnał (prąd, natężenie światła itp.) x - wielkość związana z ilością oznaczanej substancji (stężenie, masa itp.). W większości metod analitycznych nie jest znana teoretycznie dokładna postać funkcji pomiarowej. Zwykle znana jest jej przybliżona postać, która nie może być podstawą oznaczeń analitycznych (jest natomiast przydatna w określeniu typu funkcji - liniowa, kwadratowa, wykładnicza itp.). Tylko w kilku przypadkach funkcja pomiarowa jest dokładnie znana teoretycznie (analiza wagowa, miareczkowanie, kulometria, elektrograwimetria). W tych metodach konieczna jest kalibracja instrumentu. W celu wyznaczenia funkcji kalibracyjnej należy: Dokonać szeregu pomiarów w roztworach standardowych o różnym stężeniu substancji oznaczanej. Zwykle stosuje się 7-10 roztworów o różnych stężeniach. Pomiar w każdym roztworze standardowym powtarzany jest zwykle 3-razy, a do dalszej interpretacji wykorzystywana jest ich średnia (po ewentualnym odrzuceniu błędów skrajnych i grubych). UWAGA: stężenia roztworów użytych do kalibracji powinny mieścić się w zakresie liniowości (zakresie roboczym metody). Wskazane jest także aby stężenia roztworów kalibracyjnych jednolicie pokrywały przedział badanych stężeń. Aby wyniki oznaczenia na podstawie kalibracji były poprawne matryca próbki i roztworów standardowych powinna być praktycznie identyczna (szczególnie jest to ważne gdy metoda nie jest selektywna). Otrzymany zestaw par liczb: (stężenie roztworu standardowego, zmierzony sygnał) stanowi dane kalibracyjne. Do tych danych dopasowuje się funkcję kalibracyjną. 1
Otrzymany zestaw par liczb: (stężenie roztworu standardowego zmierzony sygnał) stanowi dane kalibracyjne. stężenie [ppm] 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 prąd [na] 20.0 40.6 59.0 78.3 101 118 143 Do tych danych dopasowuje się funkcję kalibracyjną Funkcja kalibracyjna jest najczęściej dopasowywana metodą najmniejszych kwadratów (LS) lub jej modyfikacją (ważone najmniejsze kwadraty, regresja przez 0 itd.). Typ funkcji kalibracyjnej jest zwykle zakładany na podstawie modelu teoretycznego. W metodzie najmniejszych kwadratów poszukiwana jest taka funkcja F(x) aby suma kwadratów odchyleń danych kalibracyjnych od wyznaczanej funkcji była minimalna: Zakładając liniową funkcję kalibracyjną F(x)=bx+a: Rozwiązanie układu równań: Przykładowy zestaw danych kalibracyjnych i przebieg funkcji podany jest na rysunku. pozwala na znalezienie wartości parametrów b (nachylenie) i a (wyraz wolny). Analiza regresji pozwala także na oszacowanie przedziałów ufności parametrów b i a, współczynnika korelacji r oraz błędów predykcji wartości y dla znanego x oraz wartości x dla znanego y. stężenie [ppm] 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500 0.600 0.700 prąd [na] 20.0 40.6 59.0 78.3 101 118 143 Aby otrzymać informację analityczną na podstawie zmierzonego sygnału konieczna jest f-cja analityczna Φ: x=φ(y) Funkcja analityczna Φ jest funkcją odwrotną do funkcji pomiarowej F. W większości metod analitycznych dąży się do liniowej funkcji pomiarowej ponieważ: możliwe jest określenie błędu predykcji (oznaczenia ilościowego); odwrócenie funkcji jest trywialne; czułość oznaczenia jest stała w całym zakresie stężeń. 2
PORÓWNANIE ZE WZORCEM (kalibracja jednopunktowa). Stężenie analitu w próbce c x dające sygnał s x jest obliczane na podstawie sygnału s s otrzymywanego dla roztworu standardowego o stężeniu c s mierzonego w tych samych warunkach pomiarowych: Inne metody oznaczeń ilościowych: Metod daje prawidłowe wyniki gdy: stężenia analitu w próbce i roztworu standardowego są w przybliżeniu równe; matryca próbki i roztworu standardowego są identyczne; wyraz wolny liniowej funkcji pomiarowej stosowanej metody analitycznej nie różni się istotnie od zera. METODA DODATKU WZORCA Stężenie analitu w próbce jest obliczane na podstawie zmiany sygnału po dodaniu do próbki wzorca analitu. Dodatek może być pojedynczy lub wielokrotny. Objętość dodawanego wzorca powinna być zaniedbywalnie mała w stosunku do objętości próbki. Metoda daje prawidłowe wyniki tylko wówczas gdy wyraz wolny liniowej funkcji pomiarowej stosowanej metody analitycznej nie różni się istotnie od zera. Metoda dodatku wzorca jest szczególnie przydatna gdy matryca próbki jest skomplikowana lub nieznana. Ponieważ objętość dodawanego wzorca jest zaniedbywalnie mała w stosunku do objętości próbki zmiany stężenia matrycy (a zatem także jej wpływ na wynik) są zaniedbywalne. METODA DODATKU PRÓBKI Stężenie analitu w próbce jest obliczane na podstawie zmiany sygnału roztworu standardowego po dodatku próbki. Metoda jest przydatna gdy stężenie analitu w próbce jest wysokie lub gdy rozcieńczenie matrycy próbki eliminuje pochodzące od niej interferencje. 3
METODA WZORCA WEWNĘTRZNEGO METODA WZORCA WEWNĘTRZNEGO Stosowna do eliminacji wpływu fluktuacji parametrów operacyjnych metody na sygnał pochodzący od analitu. Zakłada, że wpływ niekontrolowanych fluktuacji parametrów operacyjnych na odpowiedź wzorca i analitu jest taka sama. W celu zastosowania metody do próbki dodaje się wzorca innej substancji (tj. nie analitu) a sygnał analitu mierzony jest w odniesieniu do sygnału wzorca. WZORCE I MATERIAŁY ODNIESIENIA PIERWOTNE WZORCE FIZYCZNE I CHEMICZNE Wzorzec masy (1 kg). Wzorzec jednostki masy atomowej (izotop C 12 ). Srebro 5N (tj. zawartość Ag > 99.999%, do kulometru srebrowego). Stała Faradaya (F = 9.64845 10 7 C), liczba Avogadro N = 6.02209 10 23 cząsteczek/mol). WZORCE STOSOWANE W ANALITYCE Wzorce podstawowe Wzorce chemiczne Materiały odniesienia (RM) Certyfikowane materiały odniesienia (CRM) Wzorce wtórne Przykładowe wzorce chemiczne: Węglan sodu Na 2 CO 3 Chlorek potasu KCl Azotan(V) srebra AgNO 3 Wzorce podstawowe - są stosowane do kalibracji instrumentów i systemów pomiarowych w celu zapewnienia spójności pomiarowej oraz wiarygodności i rzetelności procedury pomiarowej. Wzorce chemiczne - substancje chemiczne o wysokiej czystości i stechiometrycznym składzie. 4
Materiał odniesienia (RM) - materiały lub substancje, których właściwości są jednorodne i na tyle dobrze określone, aby mogły być stosowane do: - kalibracji przyrządu - walidacji metody pomiarowej - przypisania wartości cechom materiałów. Stosowane są materiały odniesienia składu chemicznego, składu izotopowego, właściwości fizycznych i specjalnych właściwości technicznych. Certyfikowany (atestowany) materiał odniesienia (CRM) - materiał odniesienia opatrzony certyfikatem, którego właściwości atestowano z wykorzystaniem procedury zapewniającej odniesienie do dokładnego wzorca jednostki miary, wyrażającej daną właściwość, z jednoczesnym podaniem, dla każdej certyfikowanej wartości, niepewności na określonym poziomie ufności. Materiały odniesienia do analizy stopów glinu Wzorce wtórne - substancje standardowe i materiały odniesienia stosowane w codziennej praktyce analitycznej. WZORCE CHEMICZNE Wzorce chemiczne to substancje chemiczne o wysokiej czystości stosowane do kalibracji instrumentów i metod analitycznych. Wymagania: Skład stechiometryczny. Wysoka czystość (99.99% lub lepiej). Nie powinny być higroskopijne. Nie powinny reagować z dwutlenkiem węgla i tlenem. Powinny mieć wysoką masę cząsteczkową. Przykłady: Na 2 CO 3, KCl Nie każdy związek chemiczny ma właściwości pozwalające zastosować go jako wzorzec chemiczny!!! Certyfikowane materiały odniesienia (CRM) - wykorzystywane są do walidacji metod analitycznych, kalibracji instrumentów pomiarowych, sprawdzania wiarygodności procesów analitycznych, laboratoriów i analityków oraz do charakteryzowania właściwości substancji i materiałów. W analityce najczęściej stosowane są matrycowe CRM są to substancje lub materiały naturalne odpowiednio przygotowane i przebadane w celu nadania wartości certyfikowanych. Produkcja CRM jest skomplikowanym procesem wieloetapowym. Obejmuje takie etapy jak: Selekcja - wymagania dotyczące składu matrycy, zawartości analitu, sposobu związania analitu, możliwych interferencji oraz fizycznej postaci materiału. 5
Przygotowanie - zebranie ilości materiału wystarczającej do zapewnienia wystarczającego zapasu na dłuższy czas. Przygotowanie materiału poprzez takie operacja jak: rozdrobnienie (rozkruszenie i utarcie), przesianie, odfiltrowanie i wymieszanie. Homogeniczność - CRM musi być homogeniczny w całej masie. Homogeniczność jest weryfikowana dla założonej wielkości próbki. Stabilność - musi być określona poprzez badanie zachowania w warunkach przyspieszonego starzenia. Otrzymanie wartości certyfikowanych - możliwe jest na drodze użycia metody definitywnej lub częściej przez zastosowanie różnych metod analitycznych w najlepszych laboratoriach. Wartość certyfikowana otrzymywana jest z rezultatów uzyskanych w różnych laboratoriach poprzez zastosowanie specjalnej procedury statystycznej (ISO guide 35). Przykłady: Matryca biologiczna: Liście tytoniu typu Oriental, CTA-OTL-1 atestowane zawartości: Al, As, Ba, Br, Ca, Cd, Ce, Co, Cr, Cs, Cu, Eu, K, La, Li, Mg,Mn,Ni,P,Pb,Rb,S,Se,Sm,Sr, Tb,Th,V,Zn IEAE Tuna Fish, IEAE-350 atestowane zawartości: Cd, Co, Cr, Cu, Fe, Hg, Mn, Ni, Rb, Se, Zn, MeHg(metylortęć) oraz: liście (kapusty, pomidora, szpinaku, jabłoni), siano, porosty, mąka, tkanka ostrygi, igły świerka, plankton itd. Matryca nieorganiczna: Koncentrat apatytowy, CTA-AC-1 atestowanezawartości:ba,ca,ce,co,cu,eu, Gd,Hf,La,Lu, Mn,Na,Nd, Sc, Si,Sm,Ta,Tb,Th,Ti,U,V,Y,Yb,Zn oraz: popiół lotny, osad rzeczny, gleba itd. Tytoń (Nicotiana tabacco) Ca 5[(F,Cl,OH)(PO 4) 3] Wytwarza i rozprowadza certyfikowane materiały odniesienia dla potrzeb analizy chemicznej i spektroskopowej. Powołane do istnienia w 1935 r. jako kontynuacja British Chemical Standards (BSC) istniejącej od 1916 roku. Pierwsze materiały były produkowane w kooperacji z amerykańskim NBS. Produkowane są materiały w postaci: proszków lub skrawków dla potrzeb analizy chemicznej, obejmujących stale (stopowe i węglowe), stopy żelaza i stopy innych metali, rudy i materiały ceramiczne. materiałów litych (dysków lub bloków) dla potrzeb analizy spektralnej obejmują-cych stale, stopy żelaza i stopy innych metali 6
PARAMETRY METOD ANALITYCZNYCH METODA Dokładność (accuracy) - stopień zgodności pomiędzy wynikiem pomiaru a wartością referencyjną (którą może być wartość prawdziwa, oszacowana lub oczekiwana). Dokładność wyrażana jest poprzez błąd bezwzględny (tj. różnicę między wartością zmierzoną a wartością referencyjną) lub błąd względny. Precyzja (precision) - wielkość charakteryzująca rozrzut wyników uzyskiwanych przy wielokrotnym oznaczaniu składnika daną metodą w zdefiniowanych warunkach. Precyzja wyrażana jest przez odchylenie standardowe (lub względne odchylenie standardowe) wyników. X precyzyjna i dokładna X nieprecyzyjna i dokładna X precyzyjna i niedokładna X nieprecyzyjna i niedokładna Czułość (sensitivity) - jest to stosunek przyrostu sygnału analitycznego do odpowiadającego mu przyrostu stężenia. Definiowana jest zatem jako nachylenie funkcji pomiarowej (kalibracyjnej) F: czułość Zakres liniowości (linear range) - przedział stężenia, w którym czułość metody ma wartość stałą. zakres liniowości Granica wykrywalności (detection limit) - stężenie składnika dla którego otrzymany sygnał może być odróżniony z dużym prawdopodobieństwem od sygnału ślepej próby. Pozwala to na półilościowe stwierdzenie obecności danego składnika w próbce. Granica oznaczalności (determination limit) - stężenie przy którym dana metoda analityczna jest wystarczająco precyzyjna i dokładna aby uzyskać zadowalające oznaczenia ilościowego danego składnika. 7
Selektywność (selectivity) - zdolność metody do dawania sygnału analitycznego tylko dla pewnej grupy substancji a nie reagownia na obecność innych substancji. Metoda selektywna ma ograniczoną ilość substancji interferujących. Specyficzność (specifity) - zdolność metody do dawania sygnału analitycznego tylko dla jednej substancji a nie reagownia na obecność innych substancji. W metodzie specyficznej nie ma wpływu interferencji. Powtarzalność (repeatability) - precyzja metody uzyskana w warunkach praktycznie identycznych (ten sam wykonawca, materiał, próbka, aparatura, laboratorium, niewielkie odstępy czasowe). Odtwarzalność (reproducibility) - precyzja metody uzyskana w warunkach porównywalnych (taki sam materiał ale mogą być różni wykonawcy, sprzęt, laboratorium względnie długie odstępy czasu pomiędzy analizami). WŁAŚCIWOŚCI WYNIKU ANALIZY NIEPEWNOŚĆ POMIAROWA SPÓJNOŚĆ POMIAROWA wynik analizy = x sr ±ε [jednostka] NIEPEWNOŚĆ POMIAROWA SPÓJNOŚĆ POMIAROWA NIEPEWNOŚĆ POMIAROWA jest parametrem określającym przedział wokół wartości przyjętej jako wynik pomiaru, w którym na założonym poziomie prawdopodobieństwa można spodziewać się wystąpienia wartości prawdziwej (oczekiwanej). złożona standardowa niepewność wyniku oznaczenia standardowa niepewność oznaczenia, której wartość uwzględnia niepewności standardowe parametrów wpływających na wynik analizy (np. niepewność pomiaru, niepewność wzorca, niepewność stałych użytych do obliczeń itp.). Obliczana jest na podstawie prawa propagacji tj. SPÓJNOŚĆ POMIAROWA to właściwość wyniku pomiaru (lub wzorca jednostki miary), pozwalająca na jego powiązanie z określonymi odniesieniami (najczęściej z wzorcami państwowymi lub między-narodowymi jednostkami miar) za pośrednictwem nieprzerwanego łańcucha porównań, o określonej niepewności. BŁĘDY ANALIZY I ICH ŹRÓDŁA Błędy przypadkowe - wynikają z losowych fluktuacji warunków pomiarowych. Podlegają rozkładowi normalnemu (w nielicznych przypadkach możliwe są inne rozkłady błędu). Są naturalnym składnikiem mierzonych wielkości a oszacowaniem ich wielkości i ich wpływam na wynik analizy zajmują się metody statystyczne. Błędy skrajne - błędy przypadkowe o bardzo dużych wartościach i bardzo małym prawdopodobieństwie wystąpienia. Ponieważ mogą wpłynąć w sposób istotny na wartość średnią wyniku powinny być odrzucane przy interpretacji przy pomocy odpowiednich testów statystycznych (np. test Deana-Dixona). Błędy grube - błędy o bardzo dużych wartościach spowodowane czynnikiem ludzkim. Ponieważ podobnie jak błędy skrajne mogą wpłynąć w sposób istotny na wartość średnią wyniku powinny być odrzucane przy interpretacji przy pomocy testów statystycznych (np. test Deana-Dixona). Błędy systematyczne - błędy powodujące systematyczne odchylenie wartości średniej od wartości rzeczywistej. Wyróżnia się błędy systematyczne proporcjonalne (o wielkości proporcjo-nalnej do mierzonej wielkości) i stałe (ich wielkość nie zależy od wielkości mierzonej). Wynikają z czynników aparaturowych, ludzkich lub odczynnikowych. Eliminowane są w procesie kalibracji. 8
Błędy przypadkowe Błędy skrajne i grube Błąd systematyczny ŹRÓDŁA BŁĘDÓW W ANALIZIE ŚLADÓW Stężenie oznaczanego składnika jest znacznie mniejsze niż innych składników próbki. Kontaminacja próbki pochodząca od odczynników, naczyń, instrumentów oraz środowiska laboratoryjnego. Straty oznaczanego składnika na skutek adsorpcji, rozkładu oraz w trakcie operacji analitycznych. Składniki matrycy próbki mogą interferować ze stosowanym detektorem. Trudności ze sprawdzeniem rzetelności metody analitycznej dla konkretnego zastosowania (niewielka ilość dostępnych materiałów referencyjnych). KONTAMINACJA Kontaminacja (zanieczyszczenie) - polega na niekontrolowanej zmianie stężenia oznacznego pierwiastka w próbce w trakcie etapów procesu analitycznego. Kontaminacja jest głównym źródłem niedokładności w śladowej analizie elementarnej. Problem kontaminacji jest szczególnie istotny gdy: oznaczane stężenie jest niższe od 1 ppm; oznaczany pierwiastek występuje w środowisku w wysokim stężeniu; oznaczany pierwiastek jest w lotnych związkach. Źródła kontaminacji środowisko; urządzenia do pobierania próbek i pojemniki; procedury pobierania próbek; rozplanowanie i urządzenie laboratorium; sprzęt laboratoryjny; odczynniki i rozpuszczalniki; mikroorganizmy; personel. Kanał wentylacyjny wyciągu. Łaźnia wodna 9
Zapobieganie kontaminacji Mycie szkła laboratoryjnego Przykładowa procedura: 1.umycie w alkalicznym roztworze detergenta; 2.staranne opłukanie w wodzie dejonizowanej; 3.zanurzenie w 6 M HCl w 60 C przez trzy dni lub w pokojowej przez tydzień; 4.staranne opłukanie w wodzie dejonizowanej; 5.zanurzenie w 7 M HNO 3 w 60 C przez trzy dni lub w pokojowej przez tydzień; 6.kilkakrotne opłukanie w wodzie dejonizowanej; 7.kondycjonowanie w 0.05 M HNO 3 przez co najmniej momentu użycia; 8.kilkakrotne opłukanie w wodzie dejonizowanej przed temperaturze temperaturze tydzień lub do użyciem. Oczyszczanie odczynników i rozpuszczalników. Odczynniki rozprowadzane przez firmy takie jak: Merck, Aldrich, Sigma, Fluka, Baker, POCh itd. O różnym stopniu czystości: techniczne, czyste, czyste do analizy, czyste spektralnie oraz ultraczyste (suprapur, ultranal itd.) Odczynniki i rozpuszczalniki mogą wymagać dodatkowego oczyszczenia. W tym celu wykorzystywane są różne metody destylacji (np. subboiling), sublimacja, ekstrakcja, rafinacja strefowa, wytrącanie i współstrącanie zanieczyszczeń, rekrystalizacja, chromatografia i bezpośrednia synteza. Woda. Tradycyjne metody oczyszczania takie jak wielokrotna destylacja i wymiana jonowa są obecnie uzupełnione przez metody wykorzystujące procesy membranowe takie jak odwrotna osmoza, ultrafiltracja i elektrodializa. Dostępne są komercyjnie kompletne systemy laboratoryjne do oczyszczania wody takie jak Milli-Q, Direct-Q, Super-Q (Millipore LabWater Products, USA), Continuous Deionisation Process CDI (US Filter, USA), NANOpure, E-pure, B-pure Water Purification Systems (Barnstead, USA). 10
BIDESTYLARKA KWARCOWA sterowanie chłodnica spirale grzejne odbieralnik wlew wody oczyszczanej (zwykle destylowanej lub dejonizowanej) Systemy oczyszczania wody Milli-Q 5 opcji dostosowanych do potrzeb od laboratoryjnych do biologii molekularnej i analizy śladowej. Wbudowane mierniki przewodnictwa i TOC Zawierają między innymi naświetlanie UV obniża zanieczyszczenia organiczne do < 5 ppb, filtr 5000 Daltonów itd. ELGA LabWater system ELGA LabWater system OKULARY OCHRONNE SĄ OBOWIĄZKOWE W KAŻDYM LABORATORIUM NAWET JEŻELI PRACUJEMY Z WODĄ!!! Stężenia [ppb] jonów metali w wodzie oczyszczonej różnymi metodami. Metal dejon. kom. dejon. lab. dest.2x srebro dest.4x kwarc Milli-Q CDI Cu 37±1 17±2 10±1 2,3±0,8 1,8±0,8 1,7±0,8 Pb 17±6 12±4 16±1 1,6±0,1 0,3±0,1 0,6±0,1 Prowadzenie operacji i analizy w czystym pomieszczeniu (clean room) lub komorze z laminarnym przepływem powietrza. Czyste pomieszczenia klasyfikowane są na podstawie ilości cząstek pyłu na ft 3 (klasa 100000, 10000, 1000, 100). Czyste pomieszczenia stawiają skrajnie wysokie wymagania wobec personelu - jedynie wysoko wykwalifikowani pracownicy mają wstęp (każdy człowiek pozostając w spoczynku emituje ok. 6000000 cząstek pyłu w ciągu godziny, a 20 razy więcej poruszając się wolno). Cd 6,8±0,3 2,1±0,3 1,2±0,1 0,2±0,1 <0,01 <0,01 Zn 33±6 14±4 17±3 5±1 2,4±0,8 2,0±0,8 11
Przyczyny strat substancji oznaczanej (analitu) adsorpcja lub absorpcja; wytrącenie; odparowanie; dyfuzja lub permacja; zmiana temperatury; utlenienie (w niektórych przypadkach także redukcja); rozkład pod wpływem światła (fotoliza); polimeryzacja lub depolimeryzacja; reakcja chemiczna (inna niż wymienione); biodegradacja. Do zobaczenia za tydzień! 12