RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (21 ) Numer zgłoszenia: 316941 (22) Data zgłoszenia 13.04.1995 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego 13.04.1995, PCT/US95/04611 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego 26.10.1995, W095/28488, PCT Gazette nr 46/95 (11) 181881 (13) B1 (51 ) IntCl7 C12N 15/38 C12N 1/21 C07K 14/05 A61K 39/245 A61P 31/22 (54) Wydzielona sekwencja DNA, wektor, transformowana komórka gospodarza, sposób wytwarzania białka gp350, homogeniczne białko gp350, środek farmaceutyczny oraz kompozycja immunogenna (30) Pierwszeństwo: 18.04.1994,US,08/229291 (73) Uprawniony z patentu: AVIRON, Burlingame, US (43) Zgłoszenie ogłoszono: 17.02.1997 BUP 04/97 (72) Twórcy wynalazku: Richard Spaete, Belmont, US Winthrop T Jackman, Berkeley, US (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 28.09.2001 WUP 09/01 (74) Pełnomocnik: Muszyński Andrzej, POLSERVICE PL 181881 B1 (57) 1 Wydzielona sekwencja DNA zawierająca sekwencję nukleotydową przedstawioną na figurze 1 lub jej fragment, kodująca białko EBV gp350 albo skróconą wersję białka EBV gp350, przy czym skrócona wersja posiada delecję w regionie błonowym, delecję w części lub całości regionu błonowego 1 pozostawiającą C-koniec i/lub delecję części lub całości sekwencji sygnałowej, przy czym sekwencja DNA posiada mutację w jednym lub więcej miejscu składania II Wektor według zastrz 10, znamienny tym, że koduje sekrecyjną skróconą wersję EBV gp350 posiadającą delecję przynajmniej 8 aminokwasów w regionie błonowym, korzystnie od Met 861 do 881 zgodnie z SEQ ID No 18 19 Komórka gospodarza transformowana sekwencją DNA pozostającą w operacyjnym połączeniu z sekwencją zdolną do kierowania jej replikacją iekspresją, znamienna tym, że sekwencja kodująca zawiera sekwencję nukleotydową przedstawioną na figurze 1 lub jej fragmenty, kodującą białko EBV gp350 albo skróconą wersję białka EBV gp350, przy czym skrócona wersja posiada delecję w regionie błonowym, delecję w części lub całości regionu błonowego ipozostawiającą C-koniec i/lub delecję części lub całości sekwencji sygnałowej, przy czym sekwencja DNA posiada mutację w jednym lub więcej miejscu składania 28 Sposób wytwarzania białka gp350, znamienny tym, że hoduje się komórkę gospodarza iwydziela się białko gp350 z tej komórki, przy czym stosuje się komórkę gospodarza transformowaną kodującą sekwencją DNA pozostającą w operacyjnym połączeniu z sekwencją zdolną do kierowania jej replikacją iekspresją, a sekwencja kodująca zawiera sekwencję nukleotydową przedstawioną na figurze 1 lub jej fragmenty, kodującą białko EBV gp350 albo skróconą wersję białka EBV gp350, przy czym skrócona wersja posiada delecję w regionie błonowym, delecję w części lub całości regionu błonowego ipozostawiającą C-koniec i/lub delecję części lub całości sekwencji sygnałowej, przy czym Sekwencja DNA posiada mutację w jednym lub więcej miejscu składania 37 Homogeniczne białko gp350 będące białkiem EBV gp350 albo skróconą wersją białka EBV gp350, zawierające sekwencję aminokwasową przedstawioną na figurze 1lub jej fragment, przy czym skrócona wersja posiada delecję w regionie błonowym, delecję w części lub całości regionu błonowego ipozostawiającą C-koniec i/lub delecję części lub całości sekwencji sygnałowej, natomiast kodująca to białko sekwencja DNA posiada mutację w jednym lub więcej miejscu składania, która korzystnie jest mutacją zmiany sensu, przy czym zmiana w sekwencji aminokwasowej jest zmianą konserwatywną 38 Środek farmaceutyczny przydatny w zapobiegawczym leczeniu choroby lub stanu związanego z EBV, zawierający czynnik aktywny ifarmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienny tym, że jako czynnik aktywny zawiera homogeniczne białko gp350 będące białkiem EBV gp350 albo skróconą wersją białka EBV gp350, zawierające sekwencję aminokwasową przedstawioną na figurze 1lub jej fragment, przy czym skrócona wersja posiada delecję w regionie błonowym, delecję w części lub całości regionu błonowego ipozostawiającą C-koniec i/lub delecję części lub całości sekwencji sygnałowej, natomiast kodująca to białko sekwencja DNA posiada mutację w jednym lub więcej miejscu składania, która korzystnie jest mutacją zmiany sensu, przy czym zmiana w sekwencji aminokwasowej jest zmianą konserwatywną 40 Kompozycja immunogenna, znamienna tym, że zawiera homogeniczne białko gp350 oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, przy czym homogeniczne białko gp350 posiada delecję aminokwasów od 863 do 907 w pełnej długości białka EBV gp350
Wydzielona sekwencja DNA, wektor, transformowana komórka gospodarza, sposób wytwarzania białka gp350, homogeniczne białko gp350, środek farmaceutyczny oraz kompozycja immunogenna Zastrzeżenia patentowe 1. Wydzielona sekwencja DNA zawierająca sekwencję nukleotydową przedstawioną na figurze 1 lub jej fragment, kodująca białko EBV gp350 albo skróconą wersję białka EBV gp350, przy czym skrócona wersja posiada: delecję w regionie błonowym, delecję w części lub całości regionu błonowego i pozostawiającą C-koniec i/lub delecję części lub całości sekwencji sygnałowej, przy czym sekwencja DNA posiada mutację w jednym lub więcej miejscu składania. 2. Sekwencja DNA według zastrz. 1, znamienna tym, że koduje sekrecyjną skróconą wersję EBV gp350 posiadającą delecję przynajmniej 8 aminokwasów w regionie błonowym, korzystnie od Met 861 do 881 zgodnie z SEQ ID No 18. 3. Sekwencja DNA według zastrz. 1, znamienna tym, że mutacja w miejscu składania jest mutacją w donorowym miejscu składania. 4. Sekwencja DNA według zastrz. 1, znamienna tym, że mutacja w miejscu składania jest mutacją w akceptorowym miejscu składania. 5. Sekwencja DNA według zastrz. 4, znamienna tym, że zawiera sekwencję nukleotydową, w której został zmieniony co najmniej jeden nukleotyd kodonu 501 kodującego serynę z SEQ ID No 18 oraz w której został zmieniony co najmniej jeden nukleotyd kodonu 698 kodującego glicynę z SEQ ID No 18. 6. Sekwencja DNA według zastrz. 1, znamienna tym, że koduje sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję wybraną z grupy obejmującej: a) kodony od 19 do 862 z SEQ ID No 18; b) kodony od 1 do 862 z SEQ ID No 18; c) kodony od 19 do 862 i od 882 z SEQ ID No 18; oraz d) kodony od 1 do 862 i od 882 z SEQ ID No 18. 7. Sekwencja DNA według zastrz. 1, znamienna tym, że mutacja w miejscu składania jest mutacją synonimową. 8. Sekwencja DNA według zastrz. 1, znamienna tym, że mutacja w miejscu składania jest mutacją zmiany sensu. 9. Sekwencja DNA według zastrz. 8, znamienna tym, że zmiana w sekwencji aminokwasowej jest zmianą konserwatywną. 10. Wektor zawierający sekwencję DNA zawierającą sekwencję nukleotydową przedstawioną na figurze 1 lub jej fragment, kodującą białko EBV gp350 albo skróconą wersję białka EBV gp350, przy czym skrócona wersja posiada: delecję w regionie błonowym, delecję w części lub całości regionu błonowego i pozostawiającą C-koniec i/lub delecję części lub całości sekwencji sygnałowej, przy czym sekwencja DNA posiada mutację w jednym lub więcej miejscu składania. 11. Wektor według zastrz. 10, znamienny tym, że koduje sekrecyjną skróconą wersję EBV gp350 posiadającą delecję przynajmniej 8 aminokwasów w regionie błonowym, korzystnie od Met 861 do 881 zgodnie z SEQ ID No 18. 12. Wektor według zastrz. 10, znamienny tym, że mutacja w miejscu składania jest mutacją w donorowym miejscu składania. 13. Wektor według zastrz. 10, znamienny tym, że mutacja w miejscu składania jest mutacją w akceptorowym miejscu składania. 14. Wektor według zastrz. 13, znamienny tym, że sekwencja kodująca białko EBV gp350 albo skróconą wersję białka EBV gp350 zawiera sekwencję nukleotydową, w której został zmieniony co najmniej jeden nukleotyd kodonu 501 kodującego serynę z SEQ ID No 18
181 881 3 oraz w której został zmieniony co najmniej jeden nukleotyd kodonu 698 kodującego glicynę z SEQ ID No 18. 15. Wektor według zastrz. 10, znamienny tym, że sekwencja kodująca białko EBV gp350 albo skróconą wersję białka EBV gp350 koduje sekwencję a m in o k w a s o w ą kodowaną przez sekwencję wybraną z grupy obejmującej: a) kodony od 19 do 862 z SEQ ID No 18; b) kodony od 1 do 862 z SEQ ID No 18; c) kodony od 19 do 862 i od 882 z SEQ ID No 18; oraz d) kodony od 1 do 862 i od 882 z SEQ ID No 18. 16. Wektor według zastrz. 10, znamienny tym, że mutacja w miejscu składania jest mutacją synonimową. 17. Wektor według zastrz. 10, znamienny tym, że mutacja w miejscu składania jest mutacją zmiany sensu. 18. Wektor według zastrz. 7, znamienny tym, że zmiana w sekwencji aminokwasowej jest zmianą konserwatywną. 19. Komórka gospodarza transformowana sekwencją DNA pozostającą w operacyjnym połączeniu z sekwencją zdolną do kierowania jej replikacją i ekspresją, znamienna tym, że sekwencja kodująca zawiera sekwencję nukleotydową przedstawioną na figurze 1 lub jej fragmenty, kodującą białko EBV gp350 albo skróconą wersję białka EBV gp350, przy czym skrócona wersja posiada: delecję w regionie błonowym, delecję w części lub całości regionu błonowego i pozostawiającą C-koniec i/lub delecję części lub całości sekwencji sygnałowej, przy czym sekwencja DNA posiada mutację w jednym lub więcej miejscu składania. 20. Komórka według zastrz. 19, znamienna tym, że sekwencja koduje sekrecyjną skróconą wersję EBV gp350 posiadającą delecję przynajmniej 8 aminokwasów w regionie błonowym, korzystnie od Met 861 do 881 zgodnie z SEQ ID No 18. 21. Komórka według zastrz. 19, znamienna tym, że mutacja w miejscu składania jest mutacją w donorowym miejscu składania. 22. Komórka według zastrz. 19, znamienna tym, że mutacja w miejscu składania jest mutacją w akceptorowym miejscu składania. 23. Komórka według zastrz. 22, znamienna tym, że sekwencja kodująca zawiera sekwencję nukleotydową, w której został zmieniony co najmniej jeden nukleotyd kodonu 501 kodującego serynę z SEQ ID No 18 oraz w której został zmieniony co najmniej jeden nukleotyd kodonu 698 kodującego glicynę z SEQ ID No 18. 24. Komórka według zastrz. 19, znamienna tym, że rzeczona sekwencja koduje sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję wybraną z grupy obejmującej: a) kodony od 19 do 862 z SEQ ID No 18; b) kodony od 1 do 862 z SEQ ID No 18; c) kodony od 19 do 862 i od 882 z SEQ ID No 18; oraz d) kodony od 1 do 862 i od 882 z SEQ ID No 18. 25. Komórka według zastrz. 19, znamienna tym, że mutacja w miejscu składania jest mutacją synonimową. 26. Komórka według zastrz. 19, znamienna tym, że mutacja w miejscu składania jest mutacją zmiany sensu. 27. Komórka według zastrz. 26, znamienna tym, że zmiana w sekwencji aminokwasowej jest zmianą konserwatywną. 28. Sposób wytwarzania białka gp350, znamienny tym, że hoduje się komórkę gospodarza i wydziela się białko gp350 z tej komórki, przy czym stosuje się komórkę gospodarza transformowaną kodującą sekwencją DNA pozostającą w operacyjnym połączeniu z sekwencją zdolną do kierowania jej replikacją i ekspresją, a sekwencja kodująca zawiera sekwencję nukleotydową przedstawioną na figurze 1 lub jej fragmenty, kodującą białko EBV gp350 albo skróconą wersję białka EBV gp350, przy czym skrócona wersja posiada: delecję w regionie błonowym, delecję w części lub całości regionu błonowego i pozostawiającą C-koniec i/lub delecję części lub całości sekwencji sygnałowej, przy czym sekwencja DNA posiada mutację w jednym lub więcej miejscu składania.
4 181 881 29. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, że sekwencja koduje sekrecyjną skróconą wersję EBV gp350 posiadającą delecję przynajmniej 8 aminokwasów w regionie błonowym, korzystnie od Met 861 do 881 zgodnie z SEQ ID No 18. 30. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, ze mutacja w miejscu składania jest mutacją w donorowym miejscu składania. 31. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, ze mutacja w miejscu składania jest mutacją w akceptorowym miejscu składania. 32. Sposób według zastrz. 31, znamienny tym, że sekwencja kodująca zawiera sekwencję nukleotydową, w której został zmieniony co najmniej jeden nukleotyd kodonu 501 kodującego serynę z SEQ ID No 18 oraz w której został zmieniony co najmniej jeden nukleotyd kodonu 698 kodującego glicynę z SEQ ID No 18. 33. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, ze sekwencja koduje sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję wybraną z grupy obejmującej: a) kodony od 19 do 862 z SEQ ID No 18; b) kodony od 1 do 862 z SEQ ID No 18; c) kodony od 19 do 862 i od 882 z SEQ ID No 18; oraz d) kodony od 1 do 862 i od 882 z SEQ ID No 18. 34. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, że mutacja w miejscu składania jest mutacją synonimową. 35. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, ze mutacja w miejscu składania jest mutacją zmiany sensu. 36. Sposób według zastrz. 35, znamienny tym, ze zmiana w sekwencji aminokwasowej jest zmianą konserwatywną. 37. Homogeniczne białko gp350 będące białkiem EBV gp350 albo skróconą wersją białka EBV gp350, zawierające sekwencję aminokwasową przedstawioną na figurze 1 lub jej fragment, przy czym skrócona wersja posiada: delecję w regionie błonowym, delecję w części lub całości regionu błonowego i pozostawiającą C-koniec i/lub delecję części lub całości sekwencji sygnałowej, natomiast kodująca to białko sekwencja DNA posiada mutację w jednym lub więcej miejscu składania, która korzystnie jest mutacją zmiany sensu, przy czym zmiana w sekwencji aminokwasowej jest zmianą konserwatywną. 38. Środek farmaceutyczny przydatny w zapobiegawczym leczeniu choroby lub stanu związanego z EBV, zawierający czynnik aktywny i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienny tym, że jako czynnik aktywny zawiera homogeniczne białko gp350 będące białkiem EBV gp350 albo skróconą wersją białka EBV gp350, zawierające sekwencję aminokwasową przedstawioną na figurze 1 lub jej fragment, przy czym skrócona wersja posiada: delecję w regionie błonowym, delecję w części lub całości regionu błonowego i pozostawiającą C-koniec i/lub delecję części lub całości sekwencji sygnałowej, natomiast kodująca to białko sekwencja DNA posiada mutację w jednym lub więcej miejscu składania, która korzystnie jest mutacją zmiany sensu, przy czym zmiana w sekwencji aminokwasowej jest zmianą konserwatywną. 39. Środek farmaceutyczny według zastrz. 38, znamienny tym, że białko gp350 posiada delecję zarówno sekwencji membranowej jak i części cytoplazmatycznej. 40. Kompozycja immunogenna, znamienna tym, ze zawiera homogeniczne białko gp350 oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, przy czym homogeniczne białko gp350 posiada delecję aminokwasów od 863 do 907 w pełnej długości białka EBV gp350. 41. Kompozycja immunogenna według zastrz. 40, znamienna tym, że zawiera homogeniczne białko gp350 posiadające sekwencję aminokwasową od 1 do 862 aminokwasu sekwencji aminokwasowej EBV gp350 przedstawionej na fig. 1. * * * Wirus Epsteina-Barra (EBV) należący do rodziny wirusów opryszczkowych powoduje zakaźną mononuklozę u ludzi. Choroba ta dotyka ponad 90% populacji. Analitycy w dziedzi-
181 881 5 nie ochrony zdrowia oceniają roczne koszty choroby w Stanach Zjednoczonych na 100 milionów dolarów. Wirus rozprzestrzenia się przede wszystkim przez wymianę śliny z osobnikami wydalającymi wirusy. U dzieci zainfekowanych przez EBV objawy nie występują lub są bardzo łagodne, natomiast u zainfekowanej młodzieży i ludzi dorosłych rozwija się typowa mononukleoza zakaźna charakteryzująca się gorączką, zapaleniem gardła i adenopatią. Osoby zainfekowane zatrzymują przeciwciała przeciw-ebv przez resztę życia i w związku z tym są uodpornieni na dalsze infekcje. Obecnie brak jest dostępnej w handlu szczepionki przeciw EBV. Stwierdzono, że oprócz działania infekcyjnego EBV przekształca limfocyty w szybko dzielące się komórki i z tego względu odgrywa rolę w przypadku szeregu różnych chłoniaków, takich jak chłoniak Burkitta oraz kosmata leukoplakia jamy ustnej. EBV wykryto także w próbkach tkanek z nowotworów nosowo-gardłowych. Ocenia się, ze w świecie występuje 80000 przypadków nowotworu nosowo-gardłowego, przeważająco u populacji wywodzących się z Chin. Opracowanie żywej, osłabionej szczepionki przeciw EBV było i jest problematyczne. Z uwagi na potencjalny charakter onkogenny związany z EBV badacze niechętnie wykorzystywali rozwiązanie z uwzględnieniem szczepionki zawierającej atenuowane drobnoustroje. Wynalazek eliminuje problem związany ze szczepionką zawierającą atenuowane drobnoustroje poprzez stworzenie sposobów i kompozycji podjednostkowej szczepionki, co nie wymaga stosowania potencjalnie onkogennych żywych wirusów. W szczepionce podjednostkowej wykorzystuje się jedno lub więcej białek antygenowych z wirusa, które będą wywoływać reakcję odpornościową i nadawać odporność. Do dwóch spośród ważniejszych antygenowych białek EBV należą glikoproteiny gp350/300 i gp220/200, które tworzą część koperty błony wirusowej i umożliwiają wiązanie się cząstek wirusa z docelowymi komórkami ludzkimi i wchodzenie do nich w wyniku oddziaływania z białkiem błony komórkowej CD21. Patrz Nemerow, J. Virology 61: 1416 (1987). Od dawna zostały one wybrane jako potencjalne szczepionki podjednostkowe, jednak trudności w uzyskaniu antygenowo aktywnego białka oczyszczonego od źródeł rodzimych oraz niskie wydajności ze źródeł otrzymanych na drodze rekombinacji zniechęciły badaczy i opracowujących szczepionki. W literaturze białka te określa się podając różne zakresy ciężarów cząsteczkowych (350 lub 300 kilodaltonów (kd) dla jednego białka i 200 lub 220 kd dla drugiego białka). Białko gp350 lub 300 określa się w opisie jako białko gp350, a białko gp220 lub 200 określa się jako białko gp220. Łącznie obydwa białka określa się jako białko (białka) gp3 50/220. Wariantowo rozszczepiony pojedynczy gen koduje białka gp350/220, tak ze powstają transkrypty mrna gp350 i gp220; nie są znane naturalne warianty w miejscach składania genu gp350/220. Gen wytwarza dwa produkty ekspresji, białka gp350 i gp220. Otwarta ramka odczytu dla sekwencji DNA gp350/220 zawiera 2721 par zasad (bp). Pełna ramka odczytu koduje 907 aminokwasów gp350. Patrz patent USA 4 707 358, Kieff (1987). Złożona wersja ramki odczytu pokrywa 2130 zasad i translatuje się na białko gp220, sekwencję o 710 aminokwasach. Teoretyczne ciężary cząsteczkowe białka gp350 i gp220 wynoszą odpowiednio 95 kd i 70 kd. Zmierzone ciężary cząsteczkowe wytworzonego w wyniku ekspresji białka gp350 i białka gp220 zmieniają się, ale wynoszą odpowiednio około 350 i 220 kd. Wyczerpujące glikozylowanie białek jest odpowiedzialne za różnicę między przewidywanymi i rzeczywistymi ciężarami cząsteczkowymi. W każdej komórce produkowane są obydwa białka, gp350 i gp220 w stosunku molowym w zakresie od 6/1 do 1/1. Tak np. w komórce B.95-8 trwale zainfekowanej EBV okazuje się, ze stosunek ten zmienia się, ale czasami dochodzi do 6:1. Patrz Miller, c. Natl. Acad. Sei. 69: 383 (1972). Również przy wytwarzaniu na drodze rekombinacji tych glikoprotein dotychczas uzyskiwano zazwyczaj mieszaninę gp350 i gp220, przy czym białka gp350/220 wytworzone zostały w wyniku ekspresji w przysadce szczura, jajnikach chomika chińskiego, komórkach VERO (nerki zielonej małpy afrykańskiej) oraz w komórkach drożdżowych. Patrz Whang, J. Virol. 61: 1796 (1982), Motz, Gene 44: 353 (1986) oraz Emini, Virology 166: 387 (1988). Układ ekspresji wirusa brodawki bydlęcej również zastosowano do wytwarzania białek
6 181 881 gp350/220 w komórkach fibroblastów myszy. Patrz Madej, Vaccine 10: 777 (1992). Laboratoryjne i szczepionkowe szczepy wirusa krowianki również wykorzystano do ekspresji białek gp350/220. Zmodyfikowane zrekombinowane wersje DNA i białka gp350/220 z EBV są znane. W szczególności wykonano zrekombinowane, skrócone konstrukty genu gp350/220 nie zawierające sekwencji przenikającej przez błonę. Takie konstrukty w dalszym ciągu wytwarzają mieszaninę gp350 i gp220, z tym, że delecja obszaru przenikającego przez błonę umożliwia wydzielenie białek. Patrz Finerty, J. Gen. Virology 74: 449 (1992) oraz Madej, Vaccine 10: 777 (1992). Otrzymano także różne wytworzone na drodze rekombinacji fragmenty restrykcyjne i białka fuzyjne zawierające różne sekwencje gp350/220, przeprowadzając ich ekspresję w E. coli. Patrz publikacja patentowa EP 0 173 254 z 25 lipca 1991. W związku z tym dotychczasowe badania EBV dotyczące gp350/220 skupiały się na osiągnięciu wydajnej ekspresji natywnej sekwencji gp350/220 lub zmodyfikowanej sekwencji nie zawierającej domeny przezbłonowej, w wyniku czego uzyskiwano mieszaninę dwóch przemiennie złożonych wersji rodzimego lub pozbawionego domeny przezbłonowej białka, albo na wytwarzaniu sekwencji fragmentów epitopowych w ß-galaktozydazowych białkach fuzyjnych. Częściowo oczyszczone preparaty gp350/220 są znane. Patrz Finerty, J. Gen. Virology 73: 449 (1992) (otrzymane na drodze rekombinacji, częściowo oczyszczone). W odniesieniu do rodzimego białka gp350/220 w większości przypadków procedury oczyszczania powodowały dezaktywację antygenowości białka, co powodowało, że były one nieprzydatne w szczepionce podjednostkowej. Jednakże w literaturze naukowej doniesiono o otrzymaniu wysoce oczyszczonych preparatów antygenowo aktywnego białka gp350 z rodzimych (czyli nie zrekombinowanych źródeł). Patrz David, J. Immunol. Methods 108: 231 (1988). Ponadto zrekombinowany wirus krowianki, w którym zachodzi ekspresja białka gp350/220, zastosowano do szczepienia długołuszki bawełnicowej przed chłoniakiem powodowanym przez EBV. Patrz Morgan, J. Med. Virology 25: 189 (1988), Mackett, EMBO J. 4: 3229 (1985) oraz Mackett, VINES 86, str. 293 (Lemer RA, Chanock RM, Brown F, red., 1986, Cold Spring Harbor Laboratory). Jednakże jak dotychczas wirusowej sekwencji DNA gp350/220 nie zmodyfikowano tak, aby możliwa była ekspresja wyłącznie jednej z przemiennie składanych wersji genu, co umożliwiłoby i zapewniło wytworzenie czystego białka gp350 lub gp220. Nie otrzymano także zrekombinowanego lub mutantowego wirusa, w którym zachodziłaby ekspresja jednego z białek, gp350 lub gp220. Zazwyczaj miejsca składania ułatwiają przetwarzanie cząsteczek w mrna. W przypadku wirusa poliomy miejsca składania są niezbędne do wydajnego nagromadzenia późnego mrna. Zamiana miejsca składania 3' i 5' w transkryptach wirusa poliomy osłabia lub całkowicie blokuje nagromadzanie mrna. Patrz Treisman, Nature 292: 595 (1981). W przypadku wirusa SV40 dające się wycinać interweniujące sekwencje ułatwiają transport mrna poza jądro i stabilizację mrna w jądrze, a w związku z tym, że takie sekwencje połączeń intron/egzon ułatwiają wiązanie małych jądrowych cząsteczek RNP, uważa się, ze wstępnie złozone mrna mogą nie ulegać prawidłowej asocjacji na przeprowadzanej drodze przemian. Wykazano, ze punktowe mutacje w miejscach złożenia egzon/intron osłabiają rozszczepienie egzon/intron i mogą zdezintegrować obróbkę pre-mrna, transport jądrowy i stabilność. Patrz Ryu, J. Virology 63: 4386 (1989) oraz Gross, Nature 286: 634 (1980). Z tego względu przed dokonaniem niniejszego wynalazku wpływ modyfikacji miejsca składania na funkcyjną ekspresję i aktywność antygenową białek kodowanych przez sekwencję gp350/220 EBV był co najmniej nieznany i nie dawał się przewidzieć. Dodatkowe dane literaturowe obejmują następujące pozycje. Przegląd biologii EBV i związanych z nim chorób opublikował Strauss, Annal of Inst. Med. 118: 45 (1993). Opis otwartej ramki odczytu EBV BLLFI opublikował Baer, Nature 310: 207 (1984). Opisy DNA gp350/220 wirusa Epsteina-Barra oraz sekwencji aminokwasów znaleźć można w artykułach Beisela, J. Virology 54: 665 (1985) oraz Biggina, EMBO J. 3: 1083 (1984), a także w patencie USA nr 4 707 358, Kieff i inni (1987). Porównanie sekwencji DNA kodujących gp350/220 w wirusach Epsteina-Barra typu A i B podał Less, Virology 195: 578 (1993). Monoklonalne przeciwciała wykazujące działanie zobojętniające na glikoproteinę gp350/220
181 881 7 EBV opisał Thorley-Lawson, c. Natl. Acad. Sci. 77: 5307 (1980). Ponadto sekwencje konsensusu miejsca złączenia dla donorowych i akceptorowych miejsc złączenia przedstawił Mount, Nucleic Acids Res. 10: 459 (1982). W jednym wykonaniu wynalazek ujawnia nie ulegające składaniu warianty sekwencji DNA gp350/220 EBV. Sekwencje DNA ujawnione w wynalazku mogą obejmować wydzieloną sekwencję DNA, która koduje ekspresję homogenicznego białka gp350. Sekwencja DNA kodująca białko gp350 charakteryzuje się tym, że zawiera taką samą lub zasadniczo taką samą sekwencję nukleotydów, którą przedstawiono na figurze 1, w której rodzime nukleotydy w donorowych i akceptorowych miejscach składania zastąpione są nie-rodzimymi nukleotydami, albo jej fragmenty. Taka sekwencja DNA może obejmować 5' i 3' nie kodujące sekwencje flankujące sekwencję kodującą, a ponadto obejmuje sekwencję sygnałową końca aminowego. Na fig. 1 przedstawiono nie kodujące sekwencje oraz zaznaczono gwiazdką koniec przypuszczalnej sekwencji sygnałowej. Należy jednak zdawać sobie sprawę, że z sekwencji DNA ujawnionej w wynalazku mogą być wyłączone pewne lub wszystkie takie sekwencje flankujące lub sygnałowe. Sekwencje wariantu DNA nie ulegającego składaniu według wynalazku wytwarza się wprowadzając mutacje do sekwencji DNA z fig. 1 w donorowych i akceptorowych miejscach składania genu kodującego gp350/220. Eliminuje to wytwarzanie białka gp220, tak że uzyskuje się jedynie białko gp350. W związku z tym w innym wykonaniu ujawnionym przedmiotem są homogeniczne białka gp350 oraz sposoby wytwarzania takich białek na drodze ekspresji nie ulegającego składaniu wariantu sekwencji DNA gp350/220 EBV w odpowiednich prokariotycznych lub eukariotycznych komórkach gospodarza pod kontrolą odpowiedniej sekwencji regulującej ekspresję. W opisie w odniesieniu do białka gp350 określenie homogeniczne oznacza wolne lub zasadniczo wolne od białka gp220. Należy podkreślić, że zgodnie z dostępną wiedzą w odniesieniu do homogenicznego białka gp350, wytworzonego na drodze rekombinacji w komórkach ssaków lub owadów brak jest jakichkolwiek doniesień w literaturze naukowej. W jeszcze innym wykonaniu przedmiotem ujawnienia są homogeniczne białka gp350 zawierające dodatkowo delecje uzyskane w wydzielonym produkcie. Takie delecje obejmują usunięcie obszaru przezbłonowego albo usunięcie obszaru przezbłonowego i reszty końca C gp350. Takie dodatkowo zmodyfikowane sekwencje DNA i kodowane przez nie białka stanowią kolejne rozwiązanie ujawnione w wynalazku. Przedmiotem ujawnienia jest także zrekombinowana cząsteczka DNA obejmująca DNA wektora i sekwencję DNA kodującą homogeniczne białko gp350. Cząsteczka DNA zawiera sekwencję gp350 w operacyjnym połączeniu z odpowiednią sekwencją regulującą zdolną do kierowania replikacją i ekspresją homogenicznego gp350 w wybranych komórkach gospodarzach. Komórki gospodarze transformowane takimi cząsteczkami DNA do stosowania w ekspresji zrekombinowanego homogenicznego gp350 są także objęte zakresem ujawnienia. Cząsteczki DNA i transformowane komórki gospodarze ujawnione w wynalazku wykorzystuje się zgodnie z innym wykonaniem wynalazku, nowym sposobem wytwarzania zrekombinowanego homogenicznego białka gp350 lub jego fragmentów. W takim procesie linię komórek transformowanych sekwencją DNA kodującą homogeniczne białko gp350 lub jego fragment (albo zrekombinowaną cząsteczkę DNA, jak to opisano powyżej) w operacyjnym połączeniu z odpowiednią sekwencją regulującą lub kontrolującą ekspresję, zdolną do regulowania ekspresji białka, hoduje się w odpowiednich warunkach umożliwiających ekspresję zrekombinowanego DNA. Uzyskane w wyniku ekspresji białko zbiera się z komórek gospodarza lub ośrodka hodowli odpowiednimi znanymi sposobami. W procesie można wykorzystywać szereg znanych komórek jako komórki gospodarze; obecnie korzystnie stosuje się komórki ssaków i komórki owadów. Sekwencje DNA i białka ujawnione w wynalazku są przydatne do wytwarzania związków terapeutycznych i immunogenicznych zawierających antygenowe determinanty EBV. Związki takie znajdują zastosowanie w szczepionkach podjednostkowych stosowanych do profilaktycznego leczenia oraz w zapobieganiu chorobom związanym z EBV, takim jak mononukleoza, chłoniak Burkitta i nowotwór nosowo-gardłowy. W związku z tym kolejnym przedmiotem ujawnienia są takie farmaceutyczne kompozycje terapeutyczne i/lub immuno-
8 181 881 geniczne do zapobiegania i leczenia związanych z EBV stanów i chorób u ludzi, takich jak mononukleoza zakaźna, chłoniak Burkitta i nowotwór nosowo-gardłowy. Takie farmaceutyczne kompozycje terapeutyczne i/lub immunogeniczne zawierają skutecznie wywołującą immunogeniczność ilość jednego lub więcej homogenicznych białek gp350 według wynalazku w mieszaninie ze znanym farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem takim jak wodorotlenek glinu, roztwór soli i roztwór soli buforowany fosforanem. Określenie ilość wywołująca immunogeniczność oznacza ilość wystarczającą do pobudzania wytwarzania przeciwciał EBV u ssaka. Substancja czynna może być również podawana w postaci agregatu zawierającego liposom. W celach profilaktycznych takie kompozycje farmaceutyczne można przyrządzać jako szczepionki podjednostkowe do podawania ludziom. Pacjentów można szczepić dawką wystarczającą do pobudzenia wytwarzania przeciwciał oraz ponownie szczepić po upływie 6 miesięcy lub po roku. Wynalazek ujawnia także sposób leczenia chorób i stanów związanych z EBV poprzez podawanie pacjentowi, zwłaszcza człowiekowi, wywołującej immunogeniczność, terapeutycznie skutecznej ilości homogenicznego białka gp350 w odpowiednim farmaceutycznym nośniku. W jeszcze innym wykonaniu wynalazku przedmiotem ujawnienia jest sposób pobudzania reakcji odpornościowej na EBV poprzez podawanie pacjentowi skutecznie wywołującej immunogeniczność ilości homogenicznego białka gp350 w odpowiednim farmaceutycznym nośniku. Przedmiotem wynalazku jest wydzielona sekwencja DNA zawierająca sekwencję nukleotydową przedstawioną na figurze 1 lub jej fragment, kodująca białko EBV gp350 albo skróconą wersję białka EBV gp350, przy czym skrócona wersja posiada: delecję w regionie błonowym, delecję w części lub całości regionu błonowego i pozostawiającą C-koniec i/lub delecję części lub całości sekwencji sygnałowej, przy czym sekwencja DNA posiada mutację w jednym lub więcej miejscu składania. Korzystnie sekwencja DNA według wynalazku charakteryzuje się tym, że koduje sekrecyjną skróconą wersję EBV gp350 posiadającą delecję przynajmniej 8 aminokwasów w regionie błonowym, korzystnie od Met 861 do 881 zgodnie z SEQ ID No 18. Korzystnie sekwencja DNA według wynalazku charakteryzuje się tym, że mutacja w miejscu składania jest mutacją w donorowym miejscu składania. Korzystnie sekwencja DNA według wynalazku charakteryzuje się tym, że mutacja w miejscu składania jest mutacją w akceptorowym miejscu składania. Korzystnie sekwencja DNA według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera sekwencję nukleotydową, w której został zmieniony co najmniej jeden nukleotyd kodonu 501 kodującego serynę z SEQ ID No 18 oraz w której został zmieniony co najmniej jeden nukleotyd kodonu 698 kodującego glicynę z SEQ ID No 18. Korzystnie sekwencja DNA według wynalazku charakteryzuje się tym, ze koduje sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję wybraną z grupy obejmującej: a) kodony od 19 do 862 z SEQ ID No 18; b) kodony od 1 do 862 z SEQ ID No 18; c) kodony od 19 do 862 i od 882 z SEQ ID No 18; oraz d) kodony od 1 do 862 i od 882 z SEQ ID No 18. Korzystnie sekwencja DNA według wynalazku charakteryzuje się tym, ze mutacja w miejscu składania jest mutacją synonimową. Korzystnie sekwencja DNA według wynalazku charakteryzuje się tym, ze mutacja w miejscu składania jest mutacją zmiany sensu. Korzystnie sekwencja DNA według wynalazku charakteryzuje się tym, ze zmiana w sekwencji aminokwasowej jest zmianą konserwatywną. Przedmiotem wynalazku jest także wektor zawierający sekwencję DNA zawierającą sekwencję nukleotydową przedstawioną na figurze 1 lub jej fragment, kodująca białko EBV gp350 albo skróconą wersję białka EBV gp350, przy czym skrócona wersja posiada: delecję w regionie błonowym, delecję w części lub całości regionu błonowego i pozostawiającą C-koniec i/lub delecję części lub całości sekwencji sygnałowej, przy czym sekwencja DNA posiada mutację w jednym lub więcej miejscu składania.
181 881 9 Korzystnie wektor według wynalazku charakteryzuje się tym, że koduje sekrecyjną skróconą wersję EBV gp350 posiadającą delecję przynajmniej 8 aminokwasów w regionie błonowym, korzystnie od Met 861 do 881 zgodnie z SEQ ID No 18. Korzystnie wektor według wynalazku charakteryzuje się tym, że mutacja w miejscu składania jest mutacją w donorowym miejscu składania. Korzystnie wektor według wynalazku charakteryzuje się tym, że mutacja w miejscu składania jest mutacją w akceptorowym miejscu składania. Korzystnie wektor według wynalazku charakteryzuje się tym, ze sekwencja kodująca białko EBV gp350 albo skróconą wersję białka EBV gp350 zawiera sekwencję nukleotydow ą w której został zmieniony co najmniej jeden nukleotyd kodonu 501 kodującego serynę z SEQ ID No 18 oraz w której został zmieniony co najmniej jeden nukleotyd kodonu 698 kodującego glicynę z SEQ ID No 18. Korzystnie wektor według wynalazku charakteryzuje się tym, że sekwencja kodująca białko EBV gp350 albo skróconą wersję białka EBV gp350 koduje sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję wybraną z grupy obejmującej: a) kodony od 19 do 862 z SEQ ID No 18; b) kodony od 1 do 862 z SEQ ID No 18; c) kodony od 19 do 862 i od 882 z SEQ ID No 18; oraz d) kodony od 1 do 862 i od 882 z SEQ ID No 18. Korzystnie wektor według wynalazku charakteryzuje się tym, że mutacja w miejscu składania jest mutacją synonimową. Korzystnie wektor według wynalazku charakteryzuje się tym, że mutacja w miejscu składania jest mutacją zmiany sensu. Korzystnie wektor według wynalazku charakteryzuje się tym, że zmiana w sekwencji aminokwasowej jest zmianą konserwatywną. Przedmiotem wynalazku jest także komórka gospodarza transformowana sekwencją DNA pozostającą w operacyjnym połączeniu z sekwencją zdolną do kierowania jej replikacją i ekspresją charakteryzująca się tym, ze sekwencja kodująca zawiera sekwencję nukleotydową przedstawioną na figurze 1 lub jej fragmenty, kodującą białko EBV gp350 albo skróconą wersję białka EBV gp350, przy czym skrócona wersja posiada: delecję w regionie błonowym, delecję w części lub całości regionu błonowego i pozostawiającą C-koniec i/lub delecję części lub całości sekwencji sygnałowej, przy czym sekwencja DNA posiada mutację w jednym lub więcej miejscu składania. Korzystnie komórka według wynalazku charakteryzuje się tym, że sekwencja koduje sekrecyjną skróconą wersję EBV gp350 posiadającą delecję przynajmniej 8 aminokwasów w regionie błonowym, korzystnie od Met 861 do 881 zgodnie z SEQ ID No 18. Korzystnie komórka według wynalazku charakteryzuje się tym, ze mutacja w miejscu składania jest mutacją w donorowym miejscu składania. Korzystnie komórka według wynalazku charakteryzuje się tym, że mutacja w miejscu składania jest mutacją w akceptorowym miejscu składania. Korzystnie komórka według wynalazku charakteryzuje się tym, ze sekwencja kodująca zawiera sekwencję nukleotydową, w której został zmieniony co najmniej jeden nukleotyd kodonu 501 kodującego serynę z SEQ ID No 18 oraz w której został zmieniony co najmniej jeden nukleotyd kodonu 698 kodującego glicynę z SEQ ID No 18. Korzystnie komórka według wynalazku charakteryzuje się tym, ze rzeczona sekwencja koduje sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję wybraną z grupy obejmującej: a) kodony od 19 do 862 z SEQ ID No 18; b) kodony od 1 do 862 z SEQ ID No 18; c) kodony od 19 do 862 i od 882 z SEQ ID No 18; oraz d) kodony od 1 do 862 i od 882 z SEQ ID No 18. Korzystnie komórka według wynalazku charakteryzuje się tym, że mutacja w miejscu składania jest mutacją synonimową. Korzystnie komórka według wynalazku charakteryzuje się tym, że mutacja w miejscu składania jest mutacją zmiany sensu.
10 181 881 Korzystnie komórka według wynalazku charakteryzuje się tym, że zmiana w sekwencji aminokwasowej jest zmianą konserwatywną. Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania białka gp350, charakteryzujący się tym, że hoduje się komórkę gospodarza i wydziela się białko gp350 z tej komórki, przy czym stosuje się komórkę gospodarza transformowaną kodującą sekwencją DNA pozostającą w operacyjnym połączeniu z sekwencją zdolną do kierowania jej aplikacją i ekspresją, a sekwencja kodująca zawiera sekwencję nukleotydową przedstawioną na figurze 1 lub jej fragmenty, kodującą białko EBV gp350 albo skłóconą wersję białka EBV gp350, przy czym skrócona wersja posiada: delecję w regionie błonowym, delecję w części lub całości regionu błonowego i pozostawiającą C-koniec i/lub delecję części lub całości sekwencji sygnałowej, przy czym sekwencja DNA posiada mutację w jednym lub więcej miejscu składania. Korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, ze sekwencja koduje sekrecyjną skróconą wersję EBV gp350 posiadającą delecję przynajmniej 8 aminokwasów w regionie błonowym, korzystnie od Met 861 do 881 zgodnie z SEQ ID No 18. Korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że mutacja w miejscu składania jest mutacją w donorowym miejscu składania. Korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że mutacja w miejscu składania jest mutacją w akceptorowym miejscu składania. Korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że sekwencja kodująca zawiera sekwencję nukleotydową, w której został zmieniony co najmniej jeden nukleotyd kodonu 501 kodującego serynę z SEQ ID No 18 oraz w której został zmieniony co najmniej jeden nukleotyd kodonu 698 kodującego glicynę z SEQ ID No 18. Korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że sekwencja koduje sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję wybraną z grupy obejmującej: a) kodony od 19 do 862 z SEQ ID No 18; b) kodony od 1 do 862 z SEQ ID No 18; c) kodony od 19 do 862 i od 882 z SEQ ID No 18; oraz d) kodony od 1 do 862 i od 882 z SEQ ID No 18. Korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że mutacja w miejscu składania jest mutacją synonimową. Korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, ze mutacja w miejscu składania jest mutacją zmiany sensu. Korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, ze zmiana w sekwencji aminokwasowej jest zmianą konserwatywną. Przedmiotem wynalazku jest także homogeniczne białko gp350 będące białkiem EBV gp350 albo skróconą wersją białka EBV gp350, zawierające sekwencję aminokwasową przedstawioną na figurze 1 lub jej fragment, przy czym skrócona wersja posiada: delecję w regionie błonowym, delecję w części lub całości regionu błonowego i pozostawiającą C-koniec i/lub delecję części lub całości sekwencji sygnałowej, natomiast kodująca to białko sekwencja DNA posiada mutację w jednym lub więcej miejscu składania, która korzystnie jest mutacją zmiany sensu, przy czym zmiana w sekwencji aminokwasowej jest zmianą konserwatywną. Przedmiotem wynalazku jest także środek farmaceutyczny przydatny w zapobiegawczym leczeniu choroby lub stanu związanego z EBV, zawierający czynnik aktywny i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, charakteryzujący się tym, ze jako czynnik aktywny zawiera białko gp350 będące białkiem EBV gp350 albo skróconą wersję białka EBV gp350, zawierające sekwencję aminokwasową przedstawioną na figurze 1 lub jej fragment, przy czym skrócona wersja posiada: delecję w regionie błonowym, delecję w części lub całości regionu błonowego i pozostawiającą C-koniec i/lub delecję części lub całości sekwencji sygnałowej, natomiast kodująca to białko sekwencja DNA posiada mutację w jednym lub więcej miejscu składania, która korzystnie jest mutacją zmiany sensu, przy czym zmiana w sekwencji aminokwasowej jest zmianą konserwatywną. Korzystnie środek farmaceutyczny według wynalazku charakteryzuje się tym, że białko gp350 posiada delecję zarówno sekwencji membranowej jak i części cytoplazmatycznej.
181 881 1 1 Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja immunogenna charakteryzująca się tym, ze zawiera homogeniczne białko gp350 oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, przy czym homogeniczne białko gp350 posiada delecję aminokwasów od 863 do 907 w pełnej długości białka EBV gp350. Korzystnie kompozycja immunogenna według wynalazku charakteryzuje się tym, ze zawiera homogeniczne białko gp350 posiadające sekwencję aminokwasową od 1 do 862 aminokwasu sekwencji aminokwasowej EBV gp350 przedstawionej na fig. 1. Na figurze 1 zilustrowano sekwencję DNA i aminokwasów gp3 50/220 (z Beisel, J. Virology 54: 665 (1985)). Zaznaczono donorowe i akceptorowe miejsca składania. Obszar przezbłonowy zaznaczono poziomymi strzałkami, a gwiazdkami (*) zaznaczono koniec domniemanej sekwencji sygnałowej. Numery nukleotydów podano z lewej strony, a numery aminokwasów z prawej strony. Na figurze 2 zilustrowano konstrukcję delecji gp350 i miejscowych mutantów. Mapy plazmidów oznaczonych jako pmdtm i pmstop stanowią przykłady nie składanych wariantów gp350/220 według wynalazku. W sekcji (A) liniowy model białka gp350 przedstawiono w przybliżeniu w takiej samej skali jak pokazany pod spodem kodujący klon, BLLF1. N-końcową sekwencję sygnałową (SS) i domeny przezbłonowe (TM) zaznaczono na białku, a istotne miejsca restrykcji zaznaczono na diagramie genu. Gen gp350 sklonowano w 2 segmentach, fragment BLSH1 Hindlll/Bfal i fragment BLSH2 Banl/Hindlll. SCYT stworzono przeprowadzając polimerazową reakcję łańcuchową z obszaru zaznaczonego jako BLLF1. W (B) zilustrowano schemat klonowania pdtm, pstop, pmdtm i pmstop (plazmidy nie są w tej samej skali). Szczegóły klonowania podano w przykładach 1 i 2. Na mapach plazmidów zaznaczono odpowiednie miejsca restrykcyjne, zastosowane wektory klonowania i fragmenty genu gp350. Mutacje z miejscowym złączeniem w pmdtm i pmstop zaznaczono gwiazdkami. Na figurze 3 zilustrowano wyniki immunostrącania homogenicznego białka gp350 z klonów pmdtm, na podstawie analizy SDS-PAGE. Dodatnie komórki kontrolne (GH3Δ19) wydzielające skróconą postać białek gp350/220, ujemne komórki kontrolne (pee14) oraz szereg klonów pmdtm zaznaczono metabolicznie 35S-metioniną przez 5,5 godziny; z uzyskanego supematantu hodowli tkankowej wydzielono metodą immunostrącania homogeniczne białko gp350. Dla każdego typu komórek próbki znaczonych supematantów z hodowli tkankowej (S) i wytrącone białka gp350/220 (Ip) poddawano elektroforezie na 5% SDS- PAGE (elektroforeza na żelu poliakrylamidowym). Położenia markerów ciężaru cząsteczkowego zaznaczono z lewej strony. Na figurze 4 zilustrowano wyniki analizy metodą blottingu Northema białka z klonów pmdtm uzyskanego w wyniku ekspresji w komórkach CHO, jak to opisano w przykładach 3 i 4. Ujawniono kompozycje i sposoby obejmujące klonowane sekwencje DNA EBV, kodujące nie ulegające składaniu warianty gp350. Jak to zaznaczono, takie nie ulegające składaniu warianty określa się jako homogeniczne białka gp350. Zazwyczaj w wyniku ekspresji genu gp350/220 w komórkach ssaków powstają 2 produkty genowe, gp350 i gp220, z uwagi na złozenie RNA genu. Wynalazek umożliwia wytwarzanie tylko jednego produktu genowego, gp350. Wynalazek obejmuje usuwanie części lub całości sygnałów miejsc składania RNA w genie gp350 i ekspresję genu w odpowiednich komórkach gospodarzach. Mutacje w genie gp350/220 wprowadzono, aby zapobiec wytwarzaniu wersji białka o 220 kd, gdy następuje ekspresja genu gp350/220 w komórkach ssaków. W efekcie powstają transkrypty mrna kodujące tylko gp350. Eliminacja ekspresji gp220 poprzez zastosowanie nie ulegającego składaniu wariantu genu gp350/220 powoduje wzrost ilości wytwarzanego gp350 w stosunku do gp220. Wytwarzanie gp220 nie ma decydującego znaczenia dla uzyskania skutecznej szczepionki przeciw EBV, gdyż gp350 zawiera wszystkie potencjalne antygenowe m iejsca występujące w gp220. Z tego względu w jednym wykonaniu przedmiotem wynalazku jest sekwencja DNA kodująca sekwencję polipeptydową zasadniczo taką samą jak gp350, z wyjątkiem tego, że kodon miejsca złączenia donora kodujący aminokwas 501 oraz kodon miejsca złączenia akceptora kodujący aminokwas 698, zostały zmodyfikowane przez zastąpienie rodzimych nu-
12 181 881 kleotydów nukleotydami nie-rodzimymi. Korzystnie rodzime nukleotydy zastępuje się tak nie-rodzimymi nukleotydami, ze sekwencja aminokwasów pozostaje taka sama. W szczególności w przykładzie rodzime nukleotydy AAGT w miejscu złączenia donora (nukleotydy od 1500 do 1504) oraz rodzime nukleotydy A i T flankujące miejsce złączenia akceptora GG (nukleotydy 2091 do 2094) zastępuje się odpowiednio nukleotydami GTCA oraz T i A. W efekcie w wyniku podstawienia w miejscu donora pozostaje glutamina w pozycji aminokwasu 500 i seryna w pozycji aminokwasu 501. Również w wyniku modyfikacji w miejscu akceptora pozostaje treonina w pozycji aminokwasu 697 i glicyna w pozycji 698. Specjalista może w analogiczny sposób wykonać podstawienia inne niż przykładowo podane powyżej, jak to zostanie opisane poniżej. W związku z tym w jednym wykonaniu przedmiotem wynalazku jest homogeniczne białko gp350. Homogeniczne białko gp350 charakteryzuje się ponadto tym, że zawiera sekwencję aminokwasów zasadniczo taką sam ą jak sekwencja przedstawiona na fig. 1, od aminokwasu 1 do 907, od aminokwasu 1 do 862 lub od aminokwasu 1 do 907, z wyjątkiem aminokwasów 683 do 881, przy czym każda z nich zawiera lub nie zawiera N-końcową sekwencję sygnałową z 18 aminokwasów. Przedmiotem wynalazku są ponadto analogi homogenicznego białka gp350, w tym mutanty, w których występują warianty w sekwencji aminokwasów przy zachowaniu aktywności antygenowej, a korzystnie wykazujące homologię co najmniej 80%, jeszcze korzystniej 90%, a najkorzystniej 95%, z odpowiednim obszarem homogenicznych białek gp350. Przykładowo wymienić można białka i polipeptydy z niewielkimi wariantami aminokwasów w stosunku do sekwencji aminokwasów na fig. 1; w szczególności z konserwatywnymi zastąpieniami aminokwasów. Zastąpieniami konserwatywnymi są takie zastąpienia, które zachodzą w grupie aminokwasów o podobieństwie łańcuchów bocznych. Genetycznie kodowane aminokwasy ogólnie dzieli się na 4 grupy: (1) kwaśne + asparaginian, glutaminian; (2) zasadowe = lizyna, arginina, histydyna; (3) niepolame = alanina, walina, leucyna, izoleucyna, prolina, fenyloalanina, metionina, tryptofan; oraz (4) nie naładowane polarne = glicynii, asparagina, glutamina, cysteina, seryna, treonina i tyrozyna. Fenyloalaninę, tryptofan i tyrozynę czasami klasyfikuje się łącznie jako aminokwasy aromatyczne. Tak np. rozsądne wydaje się, że izolowane zastąpienie leucyny lub podobne konserwatywne zastąpienie aminokwasu strukturalnie podobnym aminokwasem nie będzie miało wpływu na aktywność antygenową lub funkcyjność. Wynalazek stanowi zaletę w porównaniu z prostszym oczyszczaniem gp350. Z uwagi na to, ze gp350 i gp220 wykazują podobne właściwości biochemiczne, często następuje współoczyszczanie gp220 w preparatach gp350. Ekspresja w komórkach wyłącznie nie ulegającego składaniu wariantu genu gp350/220 upraszcza oczyszczanie białka. Spowoduje to spadek kosztów wytwarzania gp350. Wynalazek zapewnia również łatwiejszą biochemiczną charakteryzację wyjściowego materiału do oczyszczania gp350. Z uwagi na obecność tylko jednego składnika analizę zawartości białka i analizę sekwencji aminokwasów można przeprowadzać bez uwzględniania obecności drugiego składnika. Dodatkową zaletę wynalazku stanowi wzrost wytwarzania gp350. Zapobieganie składaniu genu gp350 spowoduje przesunięcie w komórce z równoczesnego wytwarzania gp350 i gp220 na wytwarzanie wyłącznie gp350. Ocenia się, że w pewnych komórkach stężenie gp220 stanowi 30-100% stężenia gp350. Przy wyeliminowaniu składnika genu nastąpi wzrost wytwarzania gp350 związany z brakiem wytwarzania gp220. Sekwencję DNA genu gp350/220, którą opisali Beisel, J. Virology 54: 665 (1985) i Biggin, EMBO J. 3: 1083 (1984), przedstawiono na fig. 1. Gen stanowi otwartą ramkę odczytu o 2721 parach zasad, kodującą 907 aminokwasów oraz określającą pierwotny produkt translacji o pierwotny produkt translacji o około 95 kd. Różnica między wielkością przewidywaną i rzeczywistą związana jest z wyczerpującym glikozylowaniem białka. 591 zasad (kodujących 197 aminokwasów) odłącza się tworząc gp220. Rzeczywisty ciężar cząsteczkowy produktów genu gp350/220 może również zmieniać się w zależności od typu stosowanego układu pomiarowego, wykorzystania miejsc glikozylowania w różnych typach komórek, różnic w obróbce potranslacyjnej lub selektywnej mutacji genu. Zmierzone wielkości wahają się dla produktu różnych wariantów genu gp350/220 bez miejsca składania, z tym że określenie homogenicz-
181 881 13 ne białko lub białka gp350 obejmuje produkty genowe wariantu nie ulegającego składaniu, ewentualnie zawierające dodatkowe delecje lub mutacje takie jak C-końcowe delecje i/lub modyfikacje obszaru przezbłonowego, według wynalazku. Określenie białko gp220 odnosi się do wariantowo złączonego produktu genowego gp350/220 o cięzarze cząsteczkowym około 220 kd. Miejsca złączenia w genie gp350/220 zidentyfikowano porównując gen gp350/220 z sekwencjami zgodności złączenia donora i akceptora opartymi na innych genach, przede wszystkim z organizmów eukariotycznych. Sekwencje zgodności ustalone przez Mounta, Nucleic Acids Res. 10: 459 (1982) na podstawie badań miejsc złączenia w innych genach, stanowią: Zasady zaznaczone gwiazdkami oznaczają zasady zachowane w 100% we wszystkich miejscach złączenia (zachowane w wysokim stopniu). Pozycje z dwoma zasadami lub z jedną zasadą oznaczają pozycje zachowane (pozycje nie mające decydującego znaczenia). Linia ukośna wskazuje rzeczywiste miejsca złączenia. W genie gp350/220 miejsce złączenia donorowego występuje po nukleotydzie 1501, a złączenie akceptora występuje po nukleotydzie 2092, co wykazało sekwencjonowanie DNA genu gp350/220 (Biggin, EMBO J. 3: 1083 (1984)). (Liczby podane w opisie i na fig. 1 zgodne są z numeracją Biggina). Miejsce złączenia występuje w odpowiednim obszarze genu w szczepie EBV typu B (miejsce złączenia donora po A 1501 oraz miejsce złączenia akceptora po G2029) Wynalazek obejmuje swym zakresem kompozycje uzyskane z wykorzystaniem szczepu A lub B albo miejsca złączenia innego szczepu EBV w celu wytworzenia pojedynczego składnika mrna z genu gp350/220. Sekwencję DNA formy typu A wirusa ze szczepu B95-8 zastosowano w przykładach, z tym, ze z równym powodzeniem zastosować można szczep typu B, gdyż produkty translacji genu ze szczepów typu A i B są identyczne w 98%. Szczep B nie zawiera aminokwasów od 507 do 520 i od 570 do 576. Według wynalazku można także zastosować gp350/220 EBV zawierający sekwencje specyficzne dla szczepu w celu uzyskania specyficznych dla szczepu EBV homogenicznych białek gp350 o właściwościach immunogenicznych specyficznych dla określonego szczepu i z tego względu przydatnych w immunogenicznych i/lub terapeutycznych kompozycjach do zapobiegania lub leczenia specyficznych dla szczepu chorób związanych z EBV. W tabeli 1 podano sekwencje nukleotydów i aminokwasów dzikiego typu miejsc złączenia donora i akceptora. Aby zapobiec złączeniu RNA genu gp350/220 wprowadzono mutacje do sekwencji kwasów nukleinowych genu gp350/220 w celu zastąpienia odpowiednich par zasad miejsca złączenia RNA. Aby spowodować nie funkcjonowanie złączenia korzystnie co najmniej jedną z zasad spośród dwóch wysoce konserwatywnych zasad otaczających miejsce donorowe 1miejsce akceptorowe należy zastąpić zasadą nie konserwatywną; jeszcze korzystniej co najmniej dwie wysoce konserwatywne zasady należy zmutować na zasady nie konserwatywne. Inne konserwatywne zasady, oddalone o więcej niż dwie zasady od miejsca złączenia, można również zastąpić nie konserwatywnymi zasadami z miejsca złączenia, aby jeszcze bardziej osłabić rozpoznawanie miejsca złączenia. W celu zakłócenia mechanizmów złączania zmienić można zarówno miejsce donorowe jak i akceptorowe. Korzystnie zarówno donor jak i akceptor zawierają co najmniej po jednej zmianie w jednej z 4 wysoce konserwatywnych zasad miejsca złączenia, a jeszcze korzystniej co najmniej dwie zmiany w dwóch spośród 4 wysoce konserwatywnych zasad miejsca złączenia. Gdy jedno z miejsc złączenia nie może być mutowane z uwagi na konieczność zachowania sekwencji aminokwasów typu dzikiego, to korzystnie wprowadza się co najmniej dwie mutacje do drugiego miejsca złączenia.