Raport z obecnych postępów: Projekt naukowy: Badanie symetrii dystrybucji inkluzji białkowych i jej wpływu na komórki normalne i nowotworowe 1. Metody 1.1. Hodowla komórek Linie komórkowe HEK 293 i HeLa były hodowane na szalkach 96mm (Greiner) w pożywce DMEM (Gibco) suplementowanej do 10% surowicą bydlęcą (Sigma), 5% L-glutaminą (Sigma), i 5% antybiotykami penicylina/streptomycyna (Gibco). Komórki były trzymane w inkubatorze 37C, 5% CO2. 1.2. Izolacja plazmidów Bakterie E. coli (szczep LKB1) były transformowane otrzymanymi plazmidami za pomocą szoku cieplnego i następnie wysiane na podłożu różnicującym. Otrzymane kolonie były przenoszone do hodowli wytrząsanej w kolbach stożkowych i pozostawione na 24 godziny w 37 stopniach. Plazmidy były izolowane z użyciem kitu Plasmid Midi (A&A Biotechnology), a następnie sprawdzane za pomocą odpowiednich enzymów restrykcyjnych. 1.3. Transfekcja Do komórek wysianych 24 godziny wcześniej na plastikowej szalce 35mm (Greiner) w gęstości 50 tys./ml w 2 ml suplementowanej pożywki dodany został kroplami odczynnik do transfekcji (TransIT [Mirus] + Opti-MEM + plazmid 1ug/ul). Po 5,5 godziny do pożywki dodawany był Hoechst 1:10000. Po 30 pożywka była zmieniana. 1.4. Mikroskopia Zdjęcia były wykonane na mikroskopie fluorescencyjnym Olympus. Zdjęcia timelapse były wykonane na mikroskopie Olympus w 10-minutowych odstępach czasowych przez 24 godziny. 1.5. Testy cytotoksyczności Komórki były wysiewane na szalkach 12-dołkowych po 50 tys./dołek w 1 ml suplementowanego DMEM. 24 godziny od wysiania dodawane były w odpowiednich stężeniach substancje chemiczne nokodazol (Sigma) i MG132 (Sigma). Po kolejnych 24 godzinach pożywka znad komórek była zbierana do Falcona 15ml, komórki odklejane trypsyną (Sigma), następnie liczone na komorze Thoma.
2. Rezultaty Dzięki uprzejmości naukowców z Polski, Europy i Kanady otrzymaliśmy potrzebne nam plazmidy: 1. pcyprp- egfp (Koduje białko prionowe bez kotwicy wiążącej z błoną [GPI anchor]) 2. phtt119q-eyfp (fragment egzonu 1 huntingtiny z dodatkowymi 119 powtórzeniami glutaminy) 3. pecδf-egfp (koduje białk CFTR [cystic fibrosis], z mutacją, która [ΔF508] powoduje mukowiscydozę) 4. pec-egfp (ten sam gen bez mutacji) Wszystkie plazmidy zostały namnożone w bakteriach, efektywnie wyizolowane i sprawdzone poprzez cięcie enzymami restrykcyjnymi. Tranafekcja linii komórkowych HEK i HeLa ujawniła różnorodny fenotyp plazmidów. Htt-119Q-EYFP (dalej nazywane Htt) wykazuje rozproszoną ekspresję w cytoplazmie do około 24 godzin po transfekcji, gdy ilość białko zaczyna gwałtownie agregować w 1 duży agregat o lokalizacji perinuklearnej (Rys. 1 A i B) za równo dla linii HEK jak i HeLa. Obie formy białka CFTR lokują się w błonie komórkowej (Rys 1. C i D) w obu liniach komórkowych natomiast CyPrP tworzy rozproszone, drobne inkluzje białkowe w cytoplazmie a fenotyp różni się w zależności od linii, inkluzje są bardziej rozproszone i drobniejsze dla HeLa (Rys 1. E) i większe oraz w mniejszej ilości dla HEK (Rys 1. F). Po potraktowaniu komórek HEK i HeLa inhibitorem proteasomów MG-132 (2,5uM,4h) fenotyp zmienił się w przypadku Htt z kilku na ponad 70% transfekowanych komórek (Rys. 1 A), gdzie pojawił się wyraźny perinuklearnie zlokalizowany agregat, w miejscu rozproszonej, cytoplazmatycznej ekspresji (Rys.2 B). Podobna zmiana nastąpiła w komórkach HEK z transferowanych dowolną formą CFTR, gdy po potraktowaniu MG132 (1uM, for 2h, 24h pt) pojawiły się perinuklearne agregaty (Rys. 2 B i C). Jedynie komórki HEK wykazały wrażliwość na MG-132(1uM, 2h pt), którą można było zaobserwować gwałtowną zmianą wyglądu i lokalizacji agregatów (Rys. 2 D), która była niewidoczna w komórkach HeLa (Rys. 2 E). Aby sprawdzić czy duże agregaty tworzone przez Htt119Q-EYFP są opisanymi wcześniej agresomami został przeprowadzony test z użyciem nokodazolu. Ponieważ powstawanie
agresomów jest ściśle zależne od transportu mikrotubularnego, nie powinny one powstawać w obecności nokodazolu, który niszczy cytoszkielet mikrotubularny. Po dodaniu zarówno nokodazolu (0,1ug, 4h) jak i MG-132 (2,5uM, 4h) do pożywki komórek HEK zaobserwowano znaczny spadek ilości agresomów (Rys. 3 A i B). Wyniki analiz time-lapse nie zostały jeszcze do końca zanalizowane, jednakże wskazują one na ogromne tempo agregacji Htt w warunkach stresowych, gdy białko z całej komórki lokalizuje się perinuklearnie w jednym, dużym agregacie w ciągu 10 minut, czyli podczas 1 klatki na time-lapse (obserwacja).
Rysunek Fenotyp komórek transfekowanych wektorami ekspresyjnymi. (A) Komórka HeLa 12h po transfekcji phtt119q- EYFP (B) Komórki HeLa 36h po transfekcji phtt119q-eyfp. Fenotyp ekspresji (C) CFTR i (D) CFTRdF 24h po transfekcji komórek HEK. Porównanie komórek (E) HEK i (F) HeLa 24h po transfekcji plazmidem pcyprp-egfp.
Rysunek Zmiany w komórkach transfekowanych plazmidami ekspresyjnymi po ekspozycji na działanie MG132. (A) Ilościowa analiza zmian stosunku komórek z dużym, perinuklearnym agresomem do komórek z rozproszoną ekspresją w komórkach HEK, 12h po transfekcji. (B) Przykładowe zdjęcie przestawiające agregaty w komórkach HEK po dodaniu MG132. (C i D) Agregacja białek CFTR i CFTRdF po dodaniu MG132 w komórkach HEK. Komórki HEK (E) i HeLa (F) po dodaniu MG132.
Rysunek Różnicaw fenotypie agregacji po dodaniu (A) MG132 (B) i MG132 razem z nokodazolem w komórkach HEK, 24h po transfekcji. 3. Dyskusja Według naszej wiedzy dotyczącej podejmowanych badań, po raz pierwszy zostały zaobserwowane: dynamika formowania agresomów oraz zadziwiająca szybkość tego procesu. Tempo tworzenia agresomów może wskazywać na wagę tego procesu dla podtrzymania życia komórki w warunkach stresowych. Odnotowano także znaczącą różnicę w fenotypie agregacji białka prionowego w komórkach prawidłowych i nowotworowych. Jeżeli dane te zostaną potwierdzone dalszymi badaniami, będzie to oznaczało, że komórki nowotworowe są upośledzone w formowaniu agresomów z rozproszonych agregatów. Może to stanowić potencjalny cel dla terapii przeciwnowotworowych. Wstępne dane pokazują także, że produkt białkowy używany w projekcie konstruktu kodującego fragment huntingtyny ma tendencję do gwałtownej agregacji w postaci agresomu po przekroczeniu określonego stężenia lub/i w warunkach stresowych. Z tego, co wiemy, obserwacje te nie zostały opisane w literaturze naukowej i mogą mieć duże znaczenia dla rozwoju biologii i medycyny. 4. Rozbudowa projektu Niedawno (kwiecień 2012) została wykryta i scharakteryzowana subpopulacja komórek w linii HeLa, która wykazuje liczne cechy komórek macierzystych (Zhang, 2012). Komórki w tej subpopulacji cechują się wysoką ekspresją białka powierzchniowego Bcrp1 (Rys. 4 A) i usunięcie ich z hodowli powoduje wymarcie całej linii (Rys. 4 B).
Rysunek (A) Analiza cytometryczna linii HeLa wykazała obecność subpopulacji z wysoką ekspresją Bcrp1. (B) Pomiar przeżywalności komórek w hodowli po usunięciu komórek z najwyższą ekspresją Bcrp1 (z Zhang, 2012). Kupno tego przeciwciała i zastosowanie go w badanej linii umożliwiłoby ustalenie, czy nowotworowe komórki macierzyste występujące w linii HeLa specyficznie pozbywają się agregatów białkowych w porównaniu z resztą populacji. Czy podobna populacja jest możliwa do znalezienia w linii HEK i czy występuje tam podobne zjawisko. Aby dokładnie mierzyć wpływ trucizn takich jak MG132, nokodazol czy paklitaksel na komórki prawidłowe i nowotworowe wymagany jest efektywny test cytotoksyczności. Takim testem jest test MTT, w którym do pożywki komórek dodaje się barwnik MTT, który jest metabolizowany przez mitochondria żywych komórek do fioletowego formazanu, którego absorbancję można mierzyć na dowolnym spektrofotometrze przy długości fali 570nm a następnie analizować ilościowo. Proste liczenie komórek nie daje rzetelnych rezultatów. Aby ustalić czy agregaty białkowe (zwłaszcza Htt i CFTR) są agresorami czy po prostu dużymi agregatami potrzebny jest bardziej specyficzny test niż sprawdzenie skuteczności działania nokodazolu. Jedną z bardziej specyficznych cech charakteryzujących agresomy jest charakterystyczna klatka wimentynowa, która powstaje wokół agresomu. Zakup i użycie przeciwciała na wimentynę umożliwiłoby jednoznaczne potwierdzenie czy dany agregat jest agresomem.