PL 217193 B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 217193 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 401911 (51) Int.Cl. A61K 35/54 (2006.01) A61P 25/28 (2006.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: 05.12.2012 (54) Zastosowanie preparatu o właściwościach immunoregulatorowych (73) Uprawniony z patentu: UNIWERSYTET PRZYRODNICZY WE WROCŁAWIU, Wrocław, PL (43) Zgłoszenie ogłoszono: 19.08.2013 BUP 17/13 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 30.06.2014 WUP 06/14 (72) Twórca(y) wynalazku: MARTA JAKUBIK, Wałbrzych, PL JOANNA RYMASZEWSKA, Wrocław, PL ANTONI POLANOWSKI, Wrocław, PL TADEUSZ TRZISZKA, Trzebnica, PL BARTŁOMIEJ STAŃCZYKIEWICZ, Wrocław, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Anna Olszewska
2 PL 217 193 B1 Opis wynalazku Przedmiotem zgłoszenia patentowego jest zastosowanie preparatu o właściwościach immunoregulatorowych. Procesy poznawcze są to procesy przetwarzania informacji, które zachodzą w układzie nerwowym i polegają na odbieraniu informacji z otoczenia, ich przechowywaniu i przekształcaniu. Funkcje poznawcze dzielą się na percepcję, uwagę, myślenie, pamięć, uczenie się oraz funkcje decyzyjne. Wszystkie funkcje poznawcze mają podłoże molekularne. Procesy molekularne na poziomie neurofizjologicznym wpływają na behawior. Oznacza to, że zmiany na poziomie molekularnym wpływają na przebieg procesu poznawczego co skutkuje odpowiednią reakcją na bodziec i może przejawiać się zmianą w zachowaniu. Badania biologii komórkowej i immunologii udowodniły że układ nerwowy i odpornościowy są ściśle ze sobą powiązane. Interakcje zachodzą na wielu poziomach od poziomu anatomicznego po molekularny. Oba systemy mają zdolność pamięci, a ich komórki wiele wspólnych receptorów i substancji powierzchniowo czynnych. Również część przekaźników pierwszego i drugiego rzędu jest dla obu układów wspólna (red. Górska T., Mózg a zachowanie. PWN 2005 Warszawa). Cytokiny mają zdolność penetracji bariery krew-mózg wpływając na procesy w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN). W układzie odpornościowym zasadniczymi producentami cytokin są aktywowane limfocyty T oraz makrofagi. IL-1, IL-1, IL-6, TNF są to głównie cytokiny włączone w procesy zwalczania procesów zapalnych, wywołujące bezpośredni efekt cytotoksyczny. Jednym z głównych szlaków sygnałowych łączących układ nerwowy i immunologiczny jest dziesiąty nerw czaszkowy - nerw błędny. Uszkodzenie nerwu błędnego hamuje powstanie typowej mózgowej odpowiedzi na obwodowe wstrzykiwanie IL-1 bądź niewielkich dawek Iipopolisacharydu (LPS). W normalnych warunkach wstrzykiwanie LPS stanowi modelowy przykład reakcji OUN na zmianę aktywności układu odpornościowego (red. Górska T., Mózg a zachowanie. PWN 2005 Warszawa). Astrocyty, duże komórki glejowe tworzą między innymi barierę krew - mózg, mają zdolność do syntezy czynników troficznych i cytokin. Wzrost stężenia cytokin w krwiobiegu powoduje, że astrocyty zaczynają wzmożoną produkcję IL-1, IL-6 TNF. Jest to drugi sposób komunikacji układu immunologicznego z OUN. Cytokiny to podgrupa czynników wzrostowych, których funkcją jest przede wszystkim immunomodulacja (red. Górska T., Mózg a zachowanie. PWN 2005 Warszawa). Podawanie domózgowe lub dordzeniowe czynników troficznych (neurotrofin) zapobiega wywoływanej eksperymentalnie degeneracji komórek nerwowych lub wspomaga procesy kompensacji biochemicznej i morfologicznej. Próby wszczepienia astrocytów pochodzących z obszarów przyrannych zwierzętom z zaburzeniami zachowania, wykazały poprawę wykonywania testów behawioralnych. Sugeruje to, że czynniki pochodzenia glejowego wytwarzane przez astrocyty, mogą w pewnych warunkach zapobiegać śmierci neuronów i wspomagać procesy kompensacji. Astrocyty reagują na różne bodźce traumatyzujące w sposób, który stwarza możliwość przywrócenia homeostazy w środowisku pozakomórkowym i dostarcza czynników troficznych komórkom nerwowym i glejowym (red. Górska T., Mózg a zachowanie. PWN 2005 Warszawa). Osoby, którym podawano bardzo niskie dawki LPS, nie odczuły subiektywnie stanu chorobowego, obniżyły się wyniki ich testów pamięci deklaratywnej natomiast odnotowana została zwiększona wydajność pamięci roboczej (Cohen et al., 2003 Endotoxin-induced changes in human working and declarative memory associate with cleavage of plasma readthrough acetylcholinesterase. J Mol Neurosci 21:199-212). Poczyniony w ostatnich latach znaczący postęp w wyjaśnieniu molekularnych podstaw procesów poznawczych, zwrócił uwagę badaczy na nową grupę substancji białkowych, charakteryzujących się właściwościami regulacyjnymi wobec komórek układu immunologicznego i centralnego systemu nerwowego. Wspomniana grupa substancji białkowych może mieć właściwości wspomagające procesy poznawcze, dzięki swoim właściwościom immunoregulatorowym. Peptydy o właściwościach immunoregulatorowych, mogą występować w stanie wolnym, skompleksowanym z innymi substancjami lub stanowić strukturalny element większych białek, z których wycinane są na drodze proteolizy. W badaniu in vitro pełnego pierwszego mleka (siary) stwierdzono wywołanie wytwarzania cytokin przez ludzkie jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (Shing C.M., at all. Bovine colostrum modulates cytokine production in human peripheral blood mononuclear cells stimulated with Iipopolysaccharide and phytohemagglutinin. J. Interferon Cytokine Res.. 2008. Nov 17. [Epubahead of
PL 217 193 B1 3 print]). Wskazuje to na możliwość zastosowania preparatów zawierających składowe siary do kontrolowania procesu zapalnego. Typowym przykładem białek immunoregulatorowych jest kompleks peptydów po raz pierwszy wyizolowany z siary owczej (Janusz M., Lisowski J., Franek F., 1974. Isolation and characterisation of a proline-rich polypeptide from ovine colostrum. FEBS Letters 49, 276-279). Kompleks ten, nazwany później kolostryniną (Colostrinin ), występuje w siarze w formie związanej z frakcją immunoglobulin lgg2, wskazując na jego immunoregulatorowe właściwości. Kolostryniną ma zdolność stymulowania odpowiedzi humoralnej i nasila przepuszczalność naczyń krwionośnych (Wieczorek Z., Zimecki M., Janusz M., Staroscik K., Lisowski J.: Prolinerich polipeptide from ovine colostrum: its effects on skin permeability and on the immune response. Immunology, 1997, 36, 875-881). Zwiększa napływanie supresorowych limfocytów T i powoduje działanie immunosupresyjne (Zimecki M.: A proline-rich polypeptide from ovine colostrum: colostrinin with immunomodulatory activity. Adv. Exp. Med. Biol., 2008, 606, 241-250). Kolostrynina promuje dojrzewanie tymocytów i indukuje proliferację komórek w węzłach chłonnych (Staroscik K., Janusz M., Zimecki M., Wieczorek Z., Lisowski J.: Immunologically active nonapeptide fragment of a proline-rich polpeptide from ovine colostrum: amino acid sequence and immunoregulatory properties. Mol. Immunol., 1983, 20, 1277-1282). Indukuje wydzielanie cytokin, w tym interferonu (IFN), czynnika martwicy guza (TNF- ) oraz IL-6 i IL-10 (Zabłocka A., Janusz M., Rybka K., Wirkus-Romanowska I., Kupryszewski G., Lisowski J.: Cytokine-inducing activity of a proline-rich polipeptide complex (PRP) from ovine colostrum and its active nonapeptide fragment analogs. Eur. Cytokine Netw., 2001, 12, 462-467. Płusa T., Immunomodulacyjne białka zawarte w siarze Pol. Merk. Lek., 2009, XXVI, 153, 234). Zarejestrowana w indeksie leków (N07X) cerebrolizyna jest mieszaniną peptydów uzyskiwaną z kolei z białek strukturalnych mózgu świni. Pobudza ona różnicowanie komórek, wspomaga czynność komórek nerwowych, działa ochronnie i pobudza procesy naprawcze. W badaniach na zwierzętach cerebrolizyna wpływa na plastyczność neuronów i synaps oraz ułatwia proces uczenia się. (http://indeks.mp.pl/desc.php?id=1314). Doświadczenia in vitro oraz ex vivo przeprowadzone w celu porównania immunoregulatorowej aktywności kompleksu białkowego będącego przedmiotem zgłoszenia patentowego P.396027, wykazały, że preparat immunoregulatorowy z żółtka jaja, wpływa na wydzielanie przez komórki interleukin IL-1 oraz IL-6. Obie interleukiny należą do cytokin prozapalnych (tzw. typ Th1), odpowiedzialnych za aktywację odpowiedzi immunologicznej. Zdolność indukcji cytokin in vitro przez białka tego kompleksu przewyższa preparat referencyjny (kolostryninę). Stężenie indukowanych cytokin IL-1 i IL-6 jest maksymalne już przy najniższej dawce preparatu. Niespodziewanie okazało się, że preparat immunoregulatorowy pozyskany z żółtka jaja wykazuje działanie poprawiające funkcje poznawcze. Wynalazek ma charakter innowacyjny ze względu na brak opisanego w literaturze wpływu preparatu immunoregulatorowego z jaja na poprawę tych funkcji. Badania prowadzono w ramach projektu finansowanego przez Unię Europejską z Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego, Grant Nr POIG. 01.03.01-00-158/09. Istotą wynalazku jest zastosowanie preparatu o właściwościach immunoregulatorowych, zwanego Yolkiną, a będącego przedmiotem zgłoszenia patentowego zarejestrowanego pod numerem P. 396027, jako surowca farmaceutycznego do wytwarzania leków stosowanych przy zaburzeniach degeneracyjnych centralnego układu nerwowego, zwłaszcza u osób z niezadowalającą odpowiedzią na konwencjonalną terapię. Dodatkowo, istotą jest zastosowanie tego preparatu jako suplementu diety lub jako składnik suplementu diety, wspomagającego i/lub poprawiającego funkcje poznawcze, stosowanego w profilaktyce zaburzeń tych funkcji o różnym podłożu i/lub wspomagająco w terapii tych zaburzeń. Doświadczenia in vivo przeprowadzone z użyciem preparatu immunoregulatorowego oraz testu behawioralnego oceniającego funkcje poznawcze, m.in. zdolność uczenia się i pamięć, przyniosły rezultaty świadczące o istotnej poprawie w zakresie funkcjonowania poznawczego. Myszy otrzymujące preparat immunoregulatorowy statystycznie lepiej wypadły w teście behawioralnym w porównaniu do myszy otrzymujących placebo. Świadczy to o wpływie jaki wywarł preparat na poziomie molekularnym w mózgu myszy, co przełożyło się na poprawę procesów poznawczych, zwłaszcza uczenia się i pamięci. Pozytywny wpływ preparatu immunoregulatorowego na funkcje poznawcze myszy przedstawiono w poniższych przykładach.
4 PL 217 193 B1 Opis grup biorących udział w eksperymencie: Do oceny wpływu preparatu użyto myszy B6C3-Tg (APPswe,PSEN1dE9)85Dbo/Mmjax NCAR). Myszy (samce) zakupiono od firmy The Jackson Laboratories (USA). Przeprowadzono dwa niezależne eksperymenty przy użyciu innych osobników, różniące się drogą podania preparatu równolegle z placebo oraz wiekiem zwierząt. Myszy biorące udział w obu eksperymentach niezależnie, podzielono na grupę badaną i kontrolną. Grupa badana otrzymywała preparat immunoregulatorowy. Grupa kontrolna otrzymywała placebo. Charakterystykę każdej z badanych grup przedstawiono w tabeli 1. Droga podania T a b e l a 1. Charakterystyka gryp w ramach przeprowadzonych eksperymentów Czas podawania preparatu/placebo Średnia waga w zależności od wieku Wiek myszy na początku podawania preparatu/placebo Wiek badanych myszy Liczebność grupy badanej Liczebność grupy kontrolnej Dootrzewnowa 4 tyg. pon-pt. 28 g-29 g 8. mż 9. mż. n=9 n=10 Doustna 24 tyg. pon-nd 25 g-30 g 4. mż. 10. mż. n=7 n=10 Opis metody badawczej: Basen Wodny Morrisa jest testem behawioralnym oceniającym zdolność uczenia się i pamięci. Zwierzę umieszcza się w okrągłym basenie wodnym (Ø122 cm), z platformą, która znajduje się w stałym miejscu. Mysz, aby wydostać się z wody powinna odnaleźć ukrytą platformę. Na ścianach pomieszczenia widnieją charakterystyczne obiekty, (tzw. flagi), które umożliwiają orientację w przestrzeni. Eksperyment poprzedzony jest serią treningów (5 sesji). W czasie treningu tj. od 1-go do 5-go dnia mysz uczy się, gdzie umiejscowiono platformę, rozpoczynając każdą sesję z innej pozycji startowej (N,S,W,E) zgodnie z Tabelą 2. Pierwszego dnia treningu platformę umieszcza się nad powierzchnią wody. Od 2-go do 5-go dnia pod powierzchnią wody. W dniu szóstym sprawdza się w jakim stopniu mysz zapamiętała położenie platformy. Za pomocą kamery wideo rejestrowany jest czas pobytu myszy w czterech strefach labiryntu wodnego Morrisa (NE, NW, SE, SW) oraz w dniu testu (dzień 6.) w miejscu położenia platformy w czasie treningu. Schemat doświadczenia prezentuje tabela 2. Dane analizowano przy użyciu oprogramowania SMART ver. 2,5 (PanLab, Hiszpania). Parametrem mierzonym w teście jest odsetek czasu przebywania (PT%) oraz odsetek dystansu (D%) przebytego w rejonie usuniętej platformy. Wynik parametrów D% i PT% dotyczący strefy gdzie znajdowała się platforma świadczy o poszukiwaniu platformy przez mysz w odpowiednim miejscu. Labirynt wodny Morrisa pozwala na ocenę pracy hipokampu, czego obrazem jest zdolność zwierzęcia do orientacji w przestrzeni oraz umiejętność uczenia się i zapamiętywania. T a b e l a 2. Schemat doświadczenia. (N-północ, W-zachód, E-wschód, S-południe, SW-południowy-zachód; NW-północny-zachód, NE-północny-wschód, SE-południowy-wschód) (Bromley-Brits K. et al.: Morris Water Maze Test for Learning and Memory Deficits in Alzheimer's Disease Model Mice. J. Vis. Exp. (53), e2920, DOI : 10.3791/2920, 2011). Położenie platformy Dzień 1 Dzień 2 Dzień 3 Dzień 4 Dzień 5 Dzień 6 Pozycja startowa Położenie platformy SW. Pozycja startowa jak poniżej: Brak platformy Sesja 1 SW S W N N E N Sesja 2 NW N S W E S - Sesja 3 NE S N E W W - Sesja 4 CENTER E E W S E - Sesja 5 SE W S S N N - P r z y k ł a d 1. Myszom w trakcie ich ósmego miesiąca życia podawano drogą iniekcji dootrzewnowej preparat zachowując podział na grupę badaną i grupę kontrolną (Tabela 3 i 4). Grupie badanej podawano preparat immunoregulatorowy z żółtka jaja dootrzewnowo w dawce 100 g/mysz (średnio 3,5 mg/kg) przez 5 tygodni od poniedziałku do piątku. Grupie kontrolnej podawano placebo
PL 217 193 B1 5 dootrzewnowo przez 5 tygodni od poniedziałku do piątku (tabela 3 i 4). W trakcie trwania dziewiątego miesiąca życia, myszy zbadano testem Basenu Wodnego Morrisa. Wyniki zaprezentowano na Wykresie 1. T a b e l a 3. Schemat podawanych dawek drogą dootrzewnową. Czas podawania = 5 tyg. pon - pt. Dawka Grupa badana [n=9] 100 g/mysz w 0,9% NaCI Οbjętość=100 l Grupa kontrolna [n=10] 0,9% NaCI Objętość=100 l T a b e l a 4. Schemat podawania preparatu/placebo oraz badania testem Basenu Wodnego Morrisa. X- dni podawania preparatu, 1-6- dni testu Basenu Wodnego Morrisa. Tyg. Wiek [mż] Pon. Wt. Śr. Czw. Pt. Sob. Nd. 1. 8. x x x x x - - 2. 8. x x x x x - - 3. 8. x x x x x - - 4. 8. x x x x x - - x x x x x - 5. 9. - 1 2 3 4 5 6 Analiza statystyczna wyników przy użyciu testu t- studenta pokazała, że zachodzą różnice na poziomie tendencji statystycznej pomiędzy grupą badaną i kontrolną. Myszy z grupy badanej uzyskały lepsze wyniki pod względem parametru D% i PD%. Wartość poziomu istotności statystycznej p dla parametru D% wynosiła 0,06. Wartość p dla parametru PT% wynosiła 0,07. Wartości p dla grup badanej i kontrolnej zbliżyły się do istotnie statystycznej różnicy (p<0,05). Wyniki badanych parametrów D% i PT% przedstawiono na powyższym wykresie.
6 PL 217 193 B1 P r z y k ł a d 2. Grupie badanej do czwartego miesiąca życia podawano 20 g/mysz preparatu immunoregulatorowego do picia w wodnym 0,1% roztworze albuminy wołowej przez 24 tygodnie (średnio 0,7 mg/kg). Grupie kontrolnej od czwartego miesiąca życia podawano do picia 0,1% wodny roztwór albuminy wołowej (placebo) przez okres 24 tygodnie (tabela 5.). W trakcie trwania dziesiątego miesiąca życia myszy zbadano testem Basenu Wodnego Morrisa. T a b e l a 5. Schemat podawanych dawek drogą doustną. Czas podawania = 24 tyg. pon - nd. Grupa badana [n=7] Grupa kontrolna [n=10] Wiek [mż] Dawka 20 g preparatu immunoregulatorowego w 0,1% wodnym roztworze albuminy wołowej Badanie testem behawioralnym Basen Wodny Morrisa 0,1% wodny roztwór albuminy wołowej 4.-10. 10. Opis procedury przygotowywania i doustnego podawania myszom preparatu immunoregulatorowego z żółtka jaja. Sporządzono 0,1% roztwór albuminy wołowej. Użyto wody pitnej (niemineralizowanej). W celu zabezpieczenie preparatu rozpuszczono go w 0,1% roztworze albuminy wołowej, tak aby uzyskać stężenie 0,5 g/ml. Każda mysz otrzymywała objętość 4ml roztworu preparatu immunoregulatorowego na dobę w 0,1% roztworze albuminy wołowej. Każda mysz otrzymywała w ten sposób 20 g preparatu immunoregulatorowego z żółtka jaja (średnio 0,7mg/kg). Tak przygotowany roztwór był podawany myszom w szklanych poidełkach. Gdy roztwór z szklanego poidełka został wypity, szklane poidełko było zastępowane standardowym poidełkiem z wodą. W dziesiątym miesiącu życia myszy poddano opisanemu wyżej testowi Basenu Wodnego Morrisa. Wyniki zaprezentowano na Wykresie 2. Analiza statystyczna przy użyciu testu t- studenta pokazała, że zachodzi istotna różnica pod względem parametru D% i PT% pomiędzy w grupą badaną i kontrolną. Wartość p dla parametru D% wynosi 0,014. Wartość p dla parametru PT% wynosi 0,013. Wyniki świadczą, że statystycznie istotnie lepsze rezultaty w teście Basenu Wodnego Morrisa osiągnęły myszy z grupy badanej w porównaniu z grupą kontrolną w badanych parametrach. Podsumowanie analizy statystycznej przykładu 1 i przykładu 2 zamieszczono w tabeli 6.
PL 217 193 B1 7 T a b e l a 6. Podsumowanie analizy statystycznej myszy otrzymując preparat/placebo za pomocą iniekcji dootrzewnowej oraz myszy otrzymując preparat/placebo w wodzie do picia, SD - odchylenie standardowe Droga podania preparatu Parametr Średnia grupy badanej SD Średnia grupy kontrolnej SD Wartość p Dootrzewnowa D% 43,64 14,22 32,07 9,44 0,06 PT% 43,48 13,99 32,78 9,00 0,07 Doustna D% 60,08 13,40 45,46 8,39 0,014 PT% 59,57 12,45 44,77 9,21 0,013 Zastrzeżenia patentowe 1. Zastosowanie preparatu o właściwościach immunoregulatorowych, zwanego Yolkiną, a będącego przedmiotem zgłoszenia patentowego zarejestrowanego pod numerem P.396027, jako surowca farmaceutycznego do wytwarzania leków stosowanych przy zaburzeniach degeneracyjnych centralnego układu nerwowego, zwłaszcza u osób z niezadowalającą odpowiedzią na konwencjonalną terapię. 2. Zastosowanie preparatu o właściwościach immunoregulatorowych, zwanego Yolkiną, a będącego przedmiotem zgłoszenia patentowego zarejestrowanego pod numerem P.396027, jako suplementu diety lub jako składnika suplementu diety, wspomagającego i/lub poprawiającego funkcje poznawcze, stosowanego w profilaktyce zaburzeń tych funkcji o różnym podłożu i/lub wspomagająco w terapii tych zaburzeń.
8 PL 217 193 B1 Departament Wydawnictw UPRP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)