1 S t r o n a U W A G A!!!!!! Badanie aktywności enzymów z klasy oksydoreduktaz. Oznaczenie witaminy C A. Badanie aktywności enzymów z klasy oksydoreduktaz. Odczynniki : - 3% roztwór H 2 O 2, - roztwór KCN, - roztwór benzydyny w kwasie octowym, - roztwór fenolu - roztwór pirogallolu - odczynnik NADI (przygotować bezpośrednio przed Użyciem, mieszając p-fenyleno-diaminę z -naftolem w stosunku 1 : 1 (1 ml + 1 ml), - bufor fosforanowy o ph 7,4, - roztwór pirokatechiny UWAGA!!! KCN jest silna trucizną!!!!!!wylewać tylko do specjalnie oznaczonego pojemnika!!! SPORZĄDZANIE WYCIĄGU ZIEMNIACZANEGO Umyty i obrany ziemniak utrzeć na tarce. Miazgę włożyć do złożonej potrójnie gazy i zanurzyć w zlewce zawierającej 200 cm 3 wody destylowanej. Zawartość zlewki łagodnie mieszać przez kilka minut. Otrzymuje się wodny wyciąg z ziemniaka, zawierający enzymy oraz wypłukana skrobię. Część wyciągu zagotować. 1. WYKRYWANIE AKTYWNOŚCI KATALAZY Katalazy, obecne we wszystkich organizmach tlenowych, są metaloproteinami zawierającymi w swojej cząsteczce żelazo. Katalizują rozkład H 2 O 2 do wody i tlenu cząsteczkowego. Jest to szczególny przypadek reakcji hydroperoksydazowej, w której H 2 O 2 jest jednocześnie donorem i akceptorem wodoru. Zasada wykrywania katalazy 2H 2 O 2 2H 2 O + O 2 Tlen uwolniony w reakcji dysproporcjowania H2O2 katalizowanej przez katalazę wydzielając się z roztworu powoduje jego silne pienienie. Do trzech probówek napipetować po około 2 ml : a - ekstraktu z ziemniaka, b - zagotowanego ekstraktu z ziemniaka c - ekstraktu z ziemniaka z dwoma kroplami roztworu KCN. Do każdej z prób dodać 5 kropli 3% nadtlenku wodoru. Gwałtownie wydzielające się pęcherzyki tlenu są świadectwem prawidłowo przebiegającej reakcji.
2 S t r o n a U W A G A!!!!!! 2. WYKRYWANIE AKTYWNOŚCI PEROKSYDAZ Peroksydazy katalizują reakcję utleniania niektórych związków organicznych np. fenoli z równoczesną redukcją nadtlenku wodoru H 2 O 2 + fenole 2H 2 O + chinony Enzymy tej grupy są odporne na temperaturę. Nie denaturują w temperaturze 70 C, inaktywują się dopiero po ogrzaniu we wrzącej łaźni wodnej. Bogatym ich źródłem jest sok chrzanowy, a w tkankach zwierzęcych wątroba i leukocyty. Zasada wykrywania peroksydazy Benzydyna w obecności H 2 O 2 ulega utlenieniu przez peroksydazę do błękitu benzydynowego, zgodnie z poniższym równaniem reakcji Do 5 probówek odmierzyć podaną w tabeli objętość ekstraktu z ziemniaka, benzydyny, H 2 O 2, KCN i H 2 O. Do probówki nr 4 dodać zagotowany ekstrakt. Zawartość probówek wymieszać i postawić na 20 min w temperaturze pokojowej. Obserwować zachodzące zmiany i zanotować wyniki. Próba Wyciąg Woda Benzydyna KCN H 2 O 2 nr 1 2,5 0 0,1 0 0,1 2 2,5 0,1 0 0 0,1 3 2,5 0 0,1 2 krople 0,1 4 2,5 0 0,1 0 0,1 5 2,5 0,1 0,1 0 0 3. WYKRYWANIE AKTYWNOŚCI OKSYDAZY CYTOCHROMOWEJ Oksydaza cytochromowa jest enzymem występującym w wewnętrznej błonie mitochondrialnej, stanowi końcowy element łańcucha oddechowego w komórce. Jej podstawowym zadaniem jest przeniesienie elektronów na tlen w celu jego aktywacji. Enzym ten jest hemoproteiną zawierającą również atomy miedzi.
3 S t r o n a U W A G A!!!!!! Zasada wykrywania aktywności oksydazy cytochromowej Obecność oksydazy cytochromowej w ekstrakcie tkankowym można wykazać w reakcji, w której wykorzystywany jest odczynnik NADI. W skład odczynnika wchodzą: -naftol i p-fenylenodiamina zmieszane w stosunku 1:1. W wyniku nieenzymatycznej redukcji zawartego w mitochondriach cytochromu c przez p-fenylenodiaminę powstaje p-fenylenodiimina, która w obecności -naftolu przechodzi w barwny, niebieski kompleks. Do 4 probówek odmierzyć podane w tabeli objętości poszczególnych roztworów; do probówki nr 4 dodać zagotowany wyciąg. Próby starannie wymieszać i pozostawić na 30 min w temperaturze pokojowej. Obserwować powstanie niebieskiej barwy. Wyniki zapisać w tabeli. Próba Wyciąg Woda Bufor ph 7,4 KCN NADI nr 1 1 0 1 0 0,1 2 1 0 1 1 kropla 0,1 3 1 0,1 1 0 0 4 1 0 1 0 0,1 4. WYKRYWANIE AKTYWNOŚCI OKSYDAZY POLIFENOLOWEJ Oksydazy katalizują odrywanie się elektronów od utlenianego substratu i dwu- lub czteroelektronową redukcję cząsteczki tlenu. Produktami reakcji katalizowanych przez te enzymy jest woda lub nadtlenek wodoru. Substratem w reakcjach utleniania mogą być m.in. o- i p-difenole. Powstają chinony, a w wyniku ich kondensacji tworzą się barwne pochodne. Oksydaza fenolowa, zwana również oksydazą polifenolową, tyrozynazą lub katecholazą, jest metaloproteiną i zawiera miedź, która przyjmuje elektrony od difenoli i przekazuje na tlen cząsteczkowy. Zasada wykrywania oksydazy polifenolowej Oksydaza polifenolowa utlenia pirokatechinę do chinonów, które kondensując dają ciemnobrunatne zabarwienie.
4 S t r o n a U W A G A!!!!!! Do 5 probówek odmierzyć podane w tabeli objętości ekstraktu z ziemniaka, wody, buforu, pirokatechiny i 4% roztworu KCN. Do probówki nr 4 dodać ekstrakt zawierający termicznie zdenaturowane białka. Zawartość wszystkich probówek starannie wymieszać, zanotować czas i pozostawić w temperaturze pokojowej. W celu lepszego dostępu tlenu, próby od 1-4 co pewien czas wstrząsnąć. Po 20 min zanotować wyniki reakcji. Próba nr Wyciąg Woda Bufor ph 7,4 KCN 1 1 0 1 0 0,1 2 1 0,1 1 0 0 3 1 0 1 2 krople 0,1 4 1 0 1 0 0,1 5 1 0 1 0 0,1 Pirokatechina Do 4 probówek wlać po 5 cm 3 wyciągu ziemniaczanego (do 2 zagotowany, do 2 niezagotowany). Następnie do probówek wprowadzić kolejno: 10 kropli 1% roztworu fenolu, 10 kropli 1% roztworu pirogallolu. Zawartość probówek zmieszać i obserwować zmianę zabarwienia. UWAGA: Podobny efekt obserwuje się bez powyższych odczynników, np. na obranym ziemniaku, który po pewnym czasie sinieje, ponieważ obecne w nim związki typu o-difenoli ulegają utlenieniu. B. Oznaczanie witaminy C 1. Utlenianie witaminy C za pomocą heksacyjanożelazianu potasu Zasada oznaczenia W środowisku zasadowym kwas askorbinowy redukuje heksacyjanożelazian III potasu do heksacyjanożelazianu II potasu. Ten ostatni wykrywa się dodając HCl i FeCl 3 w środowisku kwaśnym powstaje błękit pruski. Przygotować dwie próbówki. Do pierwszej dodać 5 kropli 1% r-ru witaminy C, a do drugiej 5 kropli wody. Następnie do obydwu próbówek dodać 1 kroplę 10% NaOH i 1 kroplę 1% żelazicyjanku potasu. Zawartość probówki wymieszać, a następnie dodać 3 krople 10% HCl i 1 kroplę 1% FeCl 3. Obserwacje zanotować w zeszycie.
5 S t r o n a U W A G A!!!!!! 2. Oznaczanie witaminy C metodą Folina Zasada oznaczenia W obecności kwasu askorbinowego kwas fosfomolibdenowy (VII) ulega redukcji do mieszaniny niższych tlenków molibdenu błękitu molibdenowego. Odczynnik ten jest również specyficznie redukowany przez kwas askorbinowy w ph 1-7. W tym zakresie ph poza witaminą C inne reduktory obecne w płynach ustrojowych i tkankach nie redukują tego odczynnika. Ćwiczenie wykonuje się w suchych próbówkach jednocześnie wykonując krzywą wzorcową oraz roztwory badane: sok z cytyny stojący na powietrzu i w świetle [1] oraz z lodówki [2], sok z... [3], sok z... [4] oraz roztwory A [5] i B [6]. -Do próbówek wprowadzić kwas trichlorooctowy wg tabeli poniżej. -Następnie należy odwirować po 1 ml soków w próbówkach o pojemności 1,5 ml (10000G, 5 min, temp. pokojowa). -Do krzywej wzorcowej wprowadzić roztwór kwasu askorbinowego o stężeniu 0,1 mg/ml, natomiast do pozostałych próbówek po 0,5 ml soków oraz roztworów A i B. Stężenie kwasu askorbinowego R-r wzorcowy [ml] 0 g/ml 2,5 g/ml 5 g/ml 12,5 g/ml 25 g/ml 35 g/ml Próby badane (od 1 do 6 0 0,05 0,1 0,25 0,5 0,7 0 R-r badany 0 0 0 0 0 0 0,5 10% TCA [ml] 2,0 1,95 1,9 1,75 1,5 1,3 1,5 -Do przygotowanych prób dodać po 0,2 ml odczynnika Folina i natychmiast po dodaniu energicznie zamieszać. Po 10 min mierzyć absorbancję przy długości fali 750 nm względem próby zerowej. -Następnie należy wykreślić krzywą wzorcową na papierze milimetrowym i odczytać stężenia badanych w badanych roztworach i sokach uwzględniając rozcieńczenia. Porównać stężenia witaminy C w poszczególnych owocach i wpływ na jej zawartość warunków przechowywania. Zagadnienia do ćwiczeń 1. Podstawowe wiadomości o enzymach. 2. Klasyfikacja enzymów. 3. Charakterystyka i podział oksydoreduktaz. 4. Mechanizm ciemnienia enzymatycznego. 5. Kwas askorbinowy budowa i funkcje w organizmie człowieka. 6. Źródła występowania kwasu askorbinowego. 7. Objawy nadmiaru i niedoboru witaminy C. 8. Rola kwasu askorbinowego jako kofaktora reakcji enzymatycznych wraz z przykładami.