Techniki łączone w analityce chemicznej dr inż. Andrzej Wasik Katedra Chemii Analitycznej Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej Gdańsk, 2004
Program Ograniczenia klasycznej analizy dwuwymiarowej i sposoby ich pokonania. Definicja technik łączonych. Rodzaje technik łączonych Techniki łączone oparte o wykorzystanie: spektrometrii mas - MS spektroskopii w podczerwieni - IR spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego - NMR inne techniki łączone Podsumowanie
Analiza dwuwymiarowa W typowym przypadku analiza chromatograficzna dostarcza nam informacji dwuwymiarowej. Najczęściej jest to zależność między wielkością sygnału z detektora (1 wymiar) od czasu retencji (2 wymiar) GC/FID Intensywność sygnału t ri t ri+1 t ri+2 Czas
Analiza dwuwymiarowa Identyfikacja odbywa się na podstawie czasu retencji. Porównujemy czas retencji analitu z czasem retencji wzorca. Problem 1 W przypadku analizy skomplikowanych mieszanin nie mamy pewności, że dany pik odpowiada pojedynczej substancji. Problem 2 Niemożliwa jest identyfikacja nieznanych substancji.
Analiza dwuwymiarowa Analiza HPLC-UV ekstraktu z Leuzea carthamoides 450000 400000?? 350000 300000 250000????? 200000 150000 100000??? 50000 0 2.5 5 7.5 10
Rozwiązanie Analiza dwuwymiarowa Problem 1 - nakładanie się pików Powtórzyć analizę przy użyciu kolumny z innym typem wypełnienia. Rodzaj oddziaływań pomiędzy analitem a fazą stacjonarną musi być inny niż za pierwszym razem. Zalety: - łatwość wykonania - niski koszt Wady: - wysoka czasochłonność
Analiza dwuwymiarowa Problem 2 - identyfikacja nieznanych substancji Rozwiązanie Zastosować detektor dostarczający informacji o strukturze analitu. Innymi słowy zastosować techniki łączone. Zalety: - możliwość identyfikacji nieznanych związków - informacja o ich masie cząsteczkowej i/lub strukturze Wady: - wysokie koszty inwestycyjne - wysokie wymagania co do kwalifikacji personelu - łatwe wykrywanie faktu nakładania się pików - szybsze uzyskanie wyniku końcowego
Techniki łączone - definicja Kombinacja (zestaw) metod badawczych, umożliwiających rozdzielenie badanej próbki na poszczególne składniki oraz ich jednoznaczną identyfikację. Rozdzielenie GC - MS LC - ICP/MS Struktura Skład pierwiastkowy
Techniki łączone Dzięki wykorzystaniu technik łączonych informacja analityczna zyskuje dodatkowy wymiar (struktura). 8000 intensywność sygnału 6000 4000 2000 800 0 700 600 500 m/z 400 12.5 13 13.5 czas 14 14.5 15 16 15.5 300 12 200 11.5 100 11
Przegląd technik łączonych Tabela 1 Najpopularniejsze techniki łączone GC-MS SFC-MS LC-GC-MS LC-DAD CE-DAD GC-IR SFC-IR LC-GC-IR LC-MS CE-MS GC-IR-MS SFC-GC-MS LC-ICP-MS GC-AES SFC-GC-IR LC-IR GC-ICP-MS LC-NMR GC-GC-MS LC-MS-MS LC-LC-MS
Techniki oparte o wykorzystanie spektrometrii mas (MS)
Podstawy spektrometrii mas Spektrometria mas - metoda określania masy (a ściślej stosunku masy do ładunku m/z) cząstek naładowanych elektrycznie (jonów). Na poruszający się ładunek elektryczny (jon) oddziałuje zarówno pole elektryczne jak i magnetyczne. W spektrometrach mas wykorzystujemy ten fakt aby z mieszaniny jonów wybrać te o konkretnym stosunku m/z i skierować je do detektora, dzięki czemu można określić ich ilość w mieszaninie.
Podstawy spektrometrii mas Wysokorozdzielczy analizator mas z podwójnym ogniskowaniem
Podstawy spektrometrii mas Dwa najważniejsze elementy spektrometru mas to: komora jonizacyjna, czyli miejsce w którym powstają jony, oraz analizator mas wlot próbki Komora jonizacyjna jony Analizator mas
Podstawy spektrometrii mas
Podstawy spektrometrii mas - metody jonizacji analitów Wyróżnić można dwa rodzaje jonizacji: miękka jonizacja, podczas której tworzy się jedynie jon molekularny (cząsteczkowy) bez fragmentacji cząsteczki, twarda jonizacja, podczas której cząsteczka rozpada się na fragmenty Istnieją takie konstrukcje komór jonizacyjnych, które powodują jedynie miękką jonizację analitów. Natomiast podczas jonizacji twardej powstaje zawsze mieszanina jonów cząsteczkowych i fragmentów cząsteczek analitu.
Podstawy spektrometrii mas - metody jonizacji analitów Miękka i twarda jonizacja cząsteczki analitu stabilny kationorodnik M M M M niestabilny kationorodnik fragmenty m i m j
Podstawy spektrometrii mas - metody jonizacji analitów Od sposobu jonizacji zależy ile informacji o strukturze związku można uzyskać. Miękka jonizacja pozwala jedynie określić masę cząsteczkową analitu. Jonizacja twarda dostarcza informacji o masie cząsteczkowej i strukturze związku.
Podstawy spektrometrii mas - metody jonizacji analitów Metody jonizacji Bombardowanie strumieniem cząstek Reakcje chemiczne Pole elektryczne o wysokim natężeniu Wysoka temperatura EI CI ES/IS TS FAB PB FI ICP MALDI FD APCI/PIS brak fragmentacji cząsteczek fragmentacja cząsteczek, możliwość określenia struktury
Podstawy spektrometrii mas Wybrane metody jonizacji próbek ciekłych
Jonizacja metodą elektrorozpylania - Electro Spray Ionization (ESI) N (~80 C) 2 wysokie napięcie dysza analizator mas metalowa kapilara aerozol Ciśnienie atmosferyczne separator stożkowy Próżnia N (~80 C) 2 do pompy próżniowej
Jonizacja metodą elektrorozpylania - Electro Spray Ionization (ESI) N (~80 C) 2 wysokie napięcie dysza analizator mas metalowa kapilara aerozol Ciśnienie atmosferyczne separator stożkowy Próżnia N (~80 C) 2 + + + + + + + + + do pompy + próżniowej + + + ++ ++ + + + + + + + + + + + ++ + + ++ + + + + + ++ + ++ + + + + ++ + + + ++ [M+nH nh] n+ ODPAROWANIE ROZPUSZCZALNIKA POWSTANIE JONÓW WYLOT KAPILARY COULOMBOWSKA EKSPLOZJA KROPLI AEROLOZU
Jonizacja metodą elektrorozpylania - Electro Spray Ionization (ESI) 100 450000 80 302.7 Widma masowe początku i końca piku są różne. 60400000 40 350000 20 300000 286.7 303.8 316.8 399.7 Oznacza to, że ten pozornie pojedynczy pik powstał z nałożenia dwóch innych. 0 200 225 250 275 300 325 350 375 400 m/z 250000 100 200000 286.8 80 150000 60 100000 40 50000 20 287.8 0 0 200 225 250 275 300 325 350 375 400 m/z 2.5 5 7.5 10
Jonizacja metodą elektrorozpylania - Electro Spray Ionization (ESI) Możliwość pracy w układzie faz odwróconych (faza ruchoma może zawierać wodę). Przepływ fazy ruchomej rzędu 1 ml/min. Nadaje się do analizy związków wysokocząsteczkowych (peptydy, białka), metaloorganicznych i nieorganicznych. Miękka metoda jonizacji, niewielka fragmentacja jonów a co za tym idzie trudności w określeniu struktury analitu. Wysoka czułość. Metoda przydatna do łączenia z kapilarną elektroforezą
Jonizacja chemiczna pod ciśnieniem atmosferycznym - Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI) Ciśnienie atmosferyczne Próżnia Próbka ciekła Gaz rozpylający Grzałka 1. Jonizacja cząstek rozpuszczalnika + + + + + Analizator mas Wyładowanie koronowe 2. Reakcje powstałych jonów z cząsteczkami analitu, tworzenie się klastrów. Przeniesienie ładunku. 3. Rozpad klastrów Igła wyładowcza Gaz osłonowy
Jonizacja chemiczna pod ciśnieniem atmosferycznym - Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI)
Fotojonizacja chemiczna - Photo Ion Spray (PIS) Ciśnienie atmosferyczne Próżnia Próbka ciekła Gaz rozpylający Grzałka 1. Jonizacja cząstek fotoinicjatora + + + + + Analizator mas 2. Reakcje powstałych jonów z cząsteczkami analitu, tworzenie się klastrów. Przeniesienie ładunku. 3. Rozpad klastrów Lampa UV Gaz osłonowy
Jonizacja chemiczna pod ciśnieniem atmosferycznym - (APCI) Int. 12.5e6 APCI-tryb dodatni 215 O 10.0e6 7.5e6 5.0e6 (H 3 C) 3 C NH 2 Metribuzin N C8H14N4OS N M. cz.: 214.09 N SCH 3 2.5e6 0.0e6 58 79 94 107 131 146 172 187 218 237 288 305 322 340 360 395 422 451 469 485 50 100 150 200 250 300 350 400 450 m/z Int. 25000 20000 15000 10000 APCI-tryb ujemny 183 198 O (H 3 C) 3 C NH 2 Metribuzin N C8H14N4 OS N M. cz.: 214.09 N SCH 3 Wygląd widma masowego zależy nie tylko od rodzaju związku ale także od trybu i parametrów jonizacji, oraz składu fazy ruchomej. 168 5000 152 55 141 228 243 280 407 0 69 92 122 213 258 294 314 339 352 368 396 430 445 464 478 496 50 100 150 200 250 300 350 400 450 m/z
Jonizacja chemiczna pod ciśnieniem atmosferycznym - (APCI) Możliwość pracy w układzie faz odwróconych (faza ruchoma może zawierać wodę). Przepływ fazy ruchomej rzędu 2 ml/min. Przydatna do analizy związków nielotnych, nietrwałych termicznie, o małych i średnich masach cząsteczkowych, mało i średnio polarnych. Stosunkowo twarda metoda jonizacji, odpowiedni dobór parametrów jonizacji pozwala na fragmentację cząsteczek i określenie struktury analitu. Wysoka czułość i liniowość odpowiedzi.
Jonizacja strumieniem szybkich atomów - (FAB) Jonizacja strumieniem szybkich atomów zaliczana jest do miękkich metod jonizacji. Jonizacja analitów następuje na skutek bombardowania roztworu analitu w odpowiednio dobranym rozpuszczalniku (matrycy) za pomocą strumienia szybkich atomów argonu lub ksenonu o energiach rzędu 3-8 kev. Do jonizacji analitów można też wykorzystać strumień rozpędzonych jonów cezu o energii do 35 kev. Ta modyfikacja FAB znana jest pod nazwą spektrometrii jonów wtórnych (Secondary Ion Mass Spectrometry - SIMS). W praktyce różnice pomiędzy obiema metodami są niewielkie. Rolą matrycy (rozpuszczalnika) w metodzie FAB jest: 1) absorbcja energii rozpędzonych atomów uderzających w powierzchnię roztworu 2) rozpuszczenie analitu 3) ciągłe odnawianie powierzchni roztworu 4) wspomaganie jonizacji jako donor/akceptor protonów bądź elektronów
Jonizacja strumieniem szybkich atomów - (FAB) Działo "atomowe" Sonda z próbką Analizator mas
Jonizacja strumieniem szybkich atomów - (FAB) źródło jonów piewotnych (4-6 ev) soczewki jonowe anoda katoda emitująca elektrony - "powolne" atomy gazu - gaz zjonizowany - "szybkie" atomy gazu elektrody odchylające komora kolizyjna gaz obojętny (Ar, Xe) sonda z kroplą próbki + + strumień jonów wtórnych do analizatora mas
Jonizacja strumieniem szybkich atomów - (FAB) Sonda do wprowadzania próbki do komory jonizacyjnej FAB. Na zbliżeniu widoczna jest kropla gliceryny zawierająca rozpuszczony analit.
Jonizacja strumieniem szybkich atomów - (FAB) Dwustronna sonda do wprowadzania próbki do komory jonizacyjnej FAB. Po jednej stronie umieszcza się próbkę, po drugiej wzorzec. Widoczna na ilustracji dźwignia służy do obracania sondy o 180.
Jonizacja strumieniem szybkich atomów - (FAB) Porowaty spiek Xe 0/Cs Obudowa sondy Strumień jonów wtórnych Eluent z LC z dodatkiem matrycy FAB Do analizatora mas Kwarcowa kapilara Opcjonalny absorbent eluenta Ciągły film cieczy Modyfikacja sondy FAB umożliwiająca podłączenie chromatografu cieczowego lub kapilarnej elektroforezy.
Jonizacja strumieniem szybkich atomów - (FAB) tetramezytyloporfiryna C H N 56 54 4 NH N N HN Przykład widma masowego uzyskanego metodą FAB
Jonizacja strumieniem szybkich atomów - (FAB) Zakres przepływów tolerowanych w tej metodzie jest rzędu ułamków mililitra na minutę. Współpraca LC z FAB możliwa jest dzięki zastosowaniu dzielników strumienia eluenta. W przypadku CE dzielniki nie są potrzebne. Próbka musi być wymieszana/rozpuszczona w tzw. matrycy np. glicerolu, tioglicerolu bądź alkoholu nitrobenzylowym. Można to zrobić przed kolumną rozdzielczą (możliwe problemy z rozdzieleniem) bądź na jej wylocie (trudności wykonawcze). Przydatna do analizy związków nielotnych, nietrwałych termicznie, o dużych masach cząsteczkowych i wysokiej polarności (kwasy nukleinowe, leki, związki powierzchniowo czynne). Miękka metoda jonizacji. Stosunkowo wysoka czułość.
Wspomagana matrycą jonizacja światłem laserowym Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) Technika MALDI polega na jonizacji składników próbki na skutek naświetlenia silnym i krótkim impulsem lasera UV (3-5 ns, 337 nm). Mechanizm jonizacji nie jest jeszcze dokładnie zbadany, wiadomo że jest on kilkuetapowy. Pierwszym etapem jest jonizacja specjalnie dobranych składników tzw. matrycy (np. kwas 2,5-dihydroksybenzoesowy, kwas pikolinowy, 9- nitroantracen). W kolejnych etapach następuje jonizacja analitów na skutek przekazania ładunku (np. protonu lub kationu sodowego) od jonów matrycy. MALDI jest unikatową metodą jonizacji analitów. Jej specyficzne cechy można wykorzystać właściwie jedynie w połączeniu z jednym tylko typem analizatora mas jakim jest analizator czasu przelotu (Time Of Flight - TOF). Dlatego też, mówiąc MALDI najczęściej mamy na myśli połączenie MALDI-TOF.
Wspomagana matrycą jonizacja światłem laserowym Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) Laser Obszar przelotu jonów Repeler Próbka Detektor Płytki ogniskujące Schemat analizatora czasu przelotu ze źródłem jonów typu MALDI
Wspomagana matrycą jonizacja światłem laserowym Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) Zasada jonizacji techniką MALDI
Wspomagana matrycą jonizacja światłem laserowym Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) Schemat analizatora czasu przelotu ze źródłem jonów typu MALDI
Wspomagana matrycą jonizacja światłem laserowym Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI)
Wspomagana matrycą jonizacja światłem laserowym Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) tetramezytyloporfiryna C H N 56 54 4 NH N N HN Przykład widma masowego uzyskanego metodą MALDI
Wspomagana matrycą jonizacja światłem laserowym Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) Przykład widma masowego uzyskanego metodą MALDI
Wspomagana matrycą jonizacja światłem laserowym Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) Specyficzna metoda jonizacji. Nie stosuje się do połączeń on-line z technikami rozdzielania substancji. Wymaga połączenia z bardzo szybkim analizatorem mas. Dotychczas jedynie analizator TOF spełniał ten warunek. Ostatnio pojawiają się doniesienia o udanych próbach z użyciem analizatora FT-ICR (Fourier Transform - Ion Cyklotron Resonance). Próbka musi być wymieszana/rozpuszczona z tzw. matrycą np. kwasem 2,5- dihydroksybenzoesowym, kwasem pikolinowy lub 9-nitroantracenem. Zadaniem matrycy jest pochłonięcie promieniowania laserowego dzięki czemu następuje pośrednia jonizacja analitów. Przydatna do analizy związków nielotnych, o dużych masach cząsteczkowych i wysokiej polarności (kwasy nukleinowe, białka, polimery). Miękka metoda jonizacji.
Metody jonizacji próbek ciekłych (HPLC, CE) Jonizacja metodą elektrorozpylania - Electro Spray Ionization (ESI) oraz Jonizacja chemiczna pod ciśnieniem atmosferycznym - Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI) to w chwili obecnej dwie najczęściej stosowane metody jonizacji w chromatografii cieczowej. Wynika to z ich szerokiego spektrum zastosowań, łatwości użycia, wysokiej czułości oraz możliwości pracy z przepływami fazy ruchomej rutynowo stosowanymi w HPLC. ESI i APCI to komplementarne metody jonizacji.
Podstawy spektrometrii mas Wybrane metody jonizacji próbek gazowych
Techniki oparte o wykorzystanie spektrometrii mas (X-MS) Jonizacja strumieniem elektronów - Electron Ionization
Jonizacja strumieniem elektronów - Electron Ionization (EI) M M stabilny kationorodnik M M fragmenty m i Podczas jonizacji strumieniem elektronów (70 ev) zachodzą oba procesy, z przewagą twardej jonizacji. Uzyskane widmo masowe jest bogate w jony fragmentacyjne niestabilny kationorodnik m j
Jonizacja strumieniem elektronów - Electron Ionization (EI) Przykład widma EI 100 Benzen, m.cz.=78 Jon molekularny (M) 78 80 Pasmo główne (największe natężenie) 60 Jony fragmentacyjne 40 20 0 15 26 28 39 Pasmo izotopowe (M+1) 0 15 30 45 60 75 90 m/z 49 51 63 74 77 79
Jonizacja strumieniem elektronów - Electron Ionization (EI) Przykład widma EI. Widoczne charakterystyczne piki izotopowe chloru. 100. 80. 60. 40. 20. NH N N Cl N NH CH 3 CH 3 Cyprazine m. cz.:227,69 35 227 ( Cl) 37 229 ( Cl) 0. 0. 50. 100. 150. 200. 250. m/z
Jonizacja strumieniem elektronów - Electron Ionization (EI) Najbardziej popularna metoda jonizacji w chromatografii gazowej. Twarda metoda jonizacji. Często jon molekularny ma małą intensywność. Bogate biblioteki widm masowych - prosta identyfikacja analitów. Bardzo szeroki zakres zastosowań. Wysoka czułość, liniowość i powtarzalność odpowiedzi.
Jonizacja chemiczna - Chemical Ionization (CI) Zasadniczo konstrukcja komory jonizacyjnej do jonizacji chemicznej jest taka sama jak dla jonizacji strumieniem elektronów. Różnicę stanowi fakt, iż w przypadku jonizacji chemicznej wraz z próbką do komory jonizacyjnej doprowadza się gaz reakcyjny (metan, amoniak, izobutan). Cząsteczki gazu reakcyjnego ulegają jonizacji a powstałe jony reagują z cząsteczkami próbki. Wynikiem tych reakcji jest powstanie zjonizowanych cząsteczek analitów. Jest to stosunkowo miękka metoda jonizacji. Z reguły jon molekularny ma dużą intensywność przy ograniczonej fragmentacji.
Jonizacja chemiczna - Chemical Ionization (CI)
Względna intensywność Względna intensywność 100 80 60 40 20 0 100 80 60 40 20 0 EI ester metylowy kwasu oktanowego m.cz.=158 0 CI ester metylowy kwasu oktanowego m.cz.=158 0 0 0 Jonizacja chemiczna - Chemical Ionization (CI) 0 40 80 120 160 m/z [MH] + 0 40 80 120 160 200 m/z 127 M + 159 + [M C2H 5] + [M C3H 6] 187 199 Porównanie widm EI oraz CI tego samego związku. Charakterystyczny brak fragmentacji oraz obecność adduktów w obrazie widma CI.
Jonizacja chemiczna - Chemical Ionization (CI) Druga pod względem popularności metoda jonizacji w chromatografii gazowej. Komora do CI tak niewiele różni się konstrukcją od komory do EI, że wielu producentów wytwarza komory z możliwością przełączenia trybu jonizacji EI-CI Miękka metoda jonizacji. Ułatwione wyznaczenie masy cząsteczkowej analitu. Mała odtwarzalność procesu jonizacji = brak bibliotek widm masowych. Metoda komplementarna do EI
Metody jonizacji próbek gazowych (GC) Jonizacja strumieniem elektronów - Electron Ionization (EI) oraz Jonizacja chemiczna - Chemical Ionization (CI) wraz z ich modyfikacjami to dwie najczęściej stosowane metody jonizacji w chromatografii gazowej. Wynika to z ich szerokiego spektrum zastosowań, łatwości użycia i wysokiej czułości. EI oraz CI to komplementarne metody jonizacji. Największą zaletą jonizacji strumieniem elektronów jest powtarzalność tego procesu czego wynikiem są komercyjnie dostępne biblioteki widm masowych obejmujące tysiące związków chemicznych. Umożliwia to automatyzację procesu identyfikacji nieznanych substancji.
Podstawy spektrometrii mas Uniwersalne metody jonizacji próbek
Jonizacja przebiegająca z całkowitym rozpadem cząsteczki Jonizacja za pomocą indukcyjnie ogniskowanej plazmy - Inductively Coupled Plasma (ICP) to metoda jonizacji znacząco różniąca się od metod wcześniej omówionych. Wprowadzenie analitu do indukcyjnie ogniskowanej plazmy powoduje całkowity rozpad cząsteczki i powstanie jednoatomowych jonów. Metoda ta uniemożliwia określenie struktury cząsteczki ale pozwala na dokładne określenie jej składu pierwiastkowego. Dzięki wysokiej energii plazmy, efektywności jonizacji i wysokiej czułości, aparaturę ICP/MS można łączyć z praktycznie każdą techniką rozdzielania substancji.
Jonizacja za pomocą indukcyjnie ogniskowanej plazmy Inductively Coupled Plasma (ICP) Argon Palnik plazmowy Analizator mas Kolumna GC lub wylot rozpylacza Do pomp próżniowych
Przykład wykorzystania techniki ICP-MS 20000 MeEtHg Et Hg 2 202 Hg Impulsy [1] 15000 10000 5000 Hg 0 200 Hg 199 Hg Technika GC-ICP-MS Oznaczanie organicznych pochodnych rtęci w tkance dorsza. 0 0 50 100 150 200 Czas retencji [s]
Jonizacja za pomocą indukcyjnie ogniskowanej plazmy Inductively Coupled Plasma (ICP) Cząsteczka analitu rozpada się na atomy - brak informacji strukturalnej. Metoda ta nadaje się do połączeń ze wszystkimi technikami rozdzielania substancji. Niezwykle wysoka czułość związana z wysoką efektywnością procesu jonizacji. Niektóre pierwiastki można oznaczać na poziomie fg (!). Kosztowna zarówno inwestycyjnie, jak i eksploatacyjnie.
Podstawy spektrometrii mas
Podstawy spektrometrii mas - rodzaje analizatorów mas Kwadrupolowe (pojedyncze i wielokrotne) (Quadrupole) Pułapki jonowe (Ion Trap) Analizatory czasu przelotu (Time-Of-Flight TOF) Sektory magnetyczne (Magnetic Sector) Sektory magnetyczne z podwójnym ogniskowaniem (Double Focusing Magnetic Sector) Mieszane np. sektor magnetyczny/pułapka jonowa, kwadrupol/analizator czasu przelotu (Hybrid)
Podstawy spektrometrii mas Magnetic Spektrometry Sector Instruments z sektorem magnetycznym Constant rozdzielczość Resolution with mass nie zależy od masy 10% Valley Definition Rozdzielczość = m / m
Podstawy spektrometrii mas Kwadrupole Pułapki jonowe TOF Magnetic Sector Instruments rozdzielczość Constant zależy Resolution od masywith mass 10% Valley Definition Rozdzielczość = m / m m/z 500/1, R = 500 m/z 500/0.1, R = 5000 FWHM - Full Width at Half Maximum Całkowita szerokość w połowie wysokości
Wpływ rozdzielczości na kształt pików 1.0 FWHM 0.7 FWHM 0.5 FWHM 0.3 FWHM 0.2 FWHM 0.1 FWHM
Analizator kwadrupolowy - Quadrupole Pręty kwadrupola Detektor Źródło zasilające pręty kombinacją napięć, stałego i o częstotliowści radiowej Źródło jonów
Analizator kwadrupolowy - Quadrupole Wygląd analizatora kwadrupolowego z prętami o przekroju hiperbolicznym, firmy ThermoFinnigan
Analizator kwadrupolowy - cechy Najpowszechniej spotykany typ analizatora Typowy zakres m/z: 50-2000 Stosunkowo mała prędkość zbierania pełnych widm (niska czułość w trybie Full Scan) Wysoka czułość w trybie SIM Relatywnie niska rozdzielczość (siła rozdzielcza) Wysoka odtwarzalność (dobrze nadaje się do pomiarów ilościowych) Duży zakres dynamiczny (zdolność do pomiaru zarówno dużych jak i małych sygnałów)
Techniki oparte o wykorzystanie spektrometrii mas (X-MS) Pułapka jonowa - Ion Trap
Pułapka jonowa - Ion Trap
Pułapka jonowa - cechy Małe rozmiary, łatwość konserwacji Wysoka prędkość zbierania pełnych widm (duża czułość w trybie Full Scan) Stosunkowo niska czułość w trybie SIM Wysoka rozdzielczość, doskonała do pomiarów jakościowych (identyfikacja) Możliwość przeprowadzania wielokrotnych eksperymentów MS-MS Mały zakres dynamiczny Stosunkowo słaba odtwarzalność Jakość widm zależy od wielu parametrów
Analizator czasu przelotu - Time Of Flight (TOF) Laser Obszar przelotu jonów Repeler Próbka Detektor Płytki ogniskujące Schemat analizatora czasu przelotu ze źródłem jonów typu MALDI
Analizator czasu przelotu - Time Of Flight (TOF) Źródło jonów Lustro elektrostatyczne (reflektron) Repeler Detektor Pierwszy obszar przelotu jonów Płytki ogniskujące Drugi obszar przelotu jonów Niska energia Wysoka energia Średnia energia
Analizator czasu przelotu - cechy Najszybszy ze znanych analizatorów mas Najszerszy praktyczny zakres m/z Wysoka czułość Wysoka rozdzielczość (siła rozdzielcza) Z natury przystosowany do pracy z impulsowymi źródłami jonów jak np. MALDI, choć istnieją konstrukcje przystosowane do pracy z np. EI Wysokie wymagania co do prędkości detektora
Cyklotron jonowy z transformacją Fouriera wzmacniacz FFT m/z + B 0 RF wzbudzenie 8 MHz 100 khz
Cyklotron jonowy z transformacją Fouriera
Cyklotron jonowy z transformacją Fouriera - cechy Szybkość porównywalna z TOF Dokładność wyznaczania masy < 1 ppm Bardzo wysoka czułość: 1 attomol = 10-18 mola Wyjątkowo wysoka rozdzielczość >800 000 Możliwość przeprowadzania wielokrotnych eksperymentów MS-MS
Analizatory z sektorem magnetycznym - Magnetic Sector Analizator mas z sektorem magnetycznym
Analizatory z sektorem magnetycznym - Magnetic Sector Wysokorozdzielczy analizator mas z podwójnym ogniskowaniem
Analizatory z sektorem magnetycznym i podwójnym ogniskowaniem - cechy Stanowią wzorzec z którym porównuje się inne typy analizatorów mas Bardzo wysoka odtwarzalność Najlepszy ze znanych analizatorów pod względem analizy ilościowej Wysoka czułość Wysoka rozdzielczość (siła rozdzielcza) Bardzo szeroki zakres dynamiczny Duże rozmiary, wysokie koszty
Technika MS n Monitorowanie jonów fragmentacyjnych pochodzących od wybranego prekursora (Product (Fragment) Ion Scan) CID Gaz reakcyjny np. argon
Technika MS n Technika monitorowania jonów fragmentacyjnych pochodzących od wybranego prekursora (Product Ion Monitoring) pozwala na wygodne określenie struktury wybranego analitu (parent ion). Niektóre opublikowane zastosowania to: wczesna diagnoza niektórych chorób genetycznych np. choroby Fabry ego wykrywanie oraz identyfikacja narkotyków i środków farmakologicznych w płynach ustrojowych (bardzo skomplikowana matryca) wykrywanie oraz identyfikacja bojowych środków trujących (BST) i potencjalnych BST w warunkach polowych
Technika MS n Monitorowanie wybranego jonu fragmentacyjnego pochodzącego od wybranego prekursora (Selected Reaction Monitoring - SRM) Gaz reakcyjny np. argon
Technika MS n Technika monitorowania wybranego jonu (jonów) fragmentacyjnego pochodzącego od wybranego prekursora (Selected Reaction Monitoring) pozwala na znaczącą poprawę selektywności i czułości oznaczeń w przypadku analizy próbek o bardzo złożonej matrycy. 100 90 80 70 60 50 40 30 LC/MS SIM 393 20 10 0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 10 0 90 80 70 60 50 40 30 20 10 Ekstrakt z moczu konia wyścigowego. Monitorowanie obecności dexamethazonu. LC/MS/MS 393 121,147,237 0 1.0 2.0 3.0 4.0
Techniki oparte o wykorzystanie spektroskopii w podczerwieni (IR)
Techniki oparte o wykorzystanie spektroskopii w podczerwieni (X-IR) Podstawy spektroskopii w podczerwieni Spektroskopia w podczerwieni - metoda badawcza polegająca na pomiarze absorpcji promieniowania z zakresu podczerwieni (IR - Infra Red) przez badane substancje. Promieniowanie podczerwone (0,78 1000 µm) pochłaniane jest przez większość substancji chemicznych. Długość fali pochłanianego promieniowania zależy od rodzaju atomów tworzących wiązanie, jego długości i najbliższego otoczenia atomów. Wiedząc jakie długości fali promieniowania podczerwonego absorbuje dana substancja możemy określić jej budowę chemiczną. Można tego dokonać albo przez analizę poszczególnych pasm absorpcji albo przez porównanie widma nieznanej substancji z widmami zawartymi w bibliotekach.
Techniki oparte o wykorzystanie spektroskopii w podczerwieni (X-IR) Podstawy spektroskopii w podczerwieni 10-12 -12-10 promieniowanie kosmiczne (10 do 10 cm) 10-10 10-8 -10-8 promieniowanie gamma (10 do 10 cm) λ -8-6 promieniowanie X (10 do 10 cm) długość fali 10-6 -6-5 daleki ultrafiolet (10 do 2 10 cm) -5-5 ultrafiolet (2 10 do 3.8 10 cm) światło widzialne (3.8 10 do 7.8 10-5 -2 podczerwień (7.8 10 do 3 10-5 -5 cm) cm) energia ν = -- 1 λ 10-2 E = h ν 0-2 2 mikrofale (3 10 do 10 cm) 10 2 2 2 częstotliwości radiowe (0.6 10 do 5 10 cm) 10 3
Techniki oparte o wykorzystanie spektroskopii w podczerwieni (X-IR) Podstawy spektroskopii w podczerwieni widzialne BLISKA (NEAR) λ, cm λ, µm 7.8 10-5 do 3 10-4 (0.000078-0.0003) 0.78 do 3 λ, cm -1 (liczba falowa) 12820 do 4000 energia (E) 42-155 kj/mol podczerwień ŚREDNIA (MID) 3 10-4 do 3 10-3 (0.0003-0.003) 3 do 30 4000 do 400 4-42 kj/mol DALEKA (FAR) 3 10-3 do 3 10-2 (0.003-0.03) 30 do 300 400 do 33 0.4-4 kj/mol mikrofale cm = 10-2 m mm = 10-3 m µm = 10-6 m
Techniki oparte o wykorzystanie spektroskopii w podczerwieni (X-IR) Podstawy spektroskopii w podczerwieni region "fingerprint" Relative Transmittance 0.99 0.975 0.96 0.945 4-Acetamidophenol (paracetamol) HN OH O CH 3 3000. 2000. -1 Wavenumber (cm ) 1000.
Techniki oparte o wykorzystanie spektroskopii w podczerwieni (X-IR) Podstawy spektroskopii w podczerwieni Spektroskopia w podczerwieni (IR) jest nieniszczącą metodą badawczą. Dzięki temu aparaturę do IR można łączyć szeregowo z innymi technikami pomiarowymi. Znane są np. takie połączenia jak GC-IR-MS, LC-IR-MS czy CE-IR-UV. Dzięki spektroskopii IR możliwe jest rozróżnienie izomerów strukturalnych o bardzo podobnych widmach masowych (!). Spektroskopię w podczerwieni w połączeniu z chromatografią gazową lub cieczową wykorzystuje się głównie jako metodę identyfikacji analitów, często jako metodę uzupełniającą (komplementarną) do MS.
Techniki oparte o wykorzystanie spektroskopii w podczerwieni (X-IR) MS kontra IR 100. 1. Rel. Abundance Rel. Abundance 80. 60. 40. 20. 0. 100. 80. 60. 40. 20. Naftalen C H 10 8 Azulen C H 10 8 Relative Transmittance Relative Transmittance 0.8 0.6 0.4 Naftalen W niektórych przypadkach trudno C10H8 zidentyfikować 0.2 pewne substancje jedynie na podstawie prostego widma MS. 1. Wtedy 0.8 z pomocą może przyjść IR. 0.6 0.4 0.2 Azulen C H 10 8 0. 0. 40. 80. 120. 160. m/z 3000. 2000. -1 Wavenumber (cm ) 1000.
Techniki oparte o wykorzystanie spektroskopii w podczerwieni (X-IR) Połączenie GC-IR Obecnie stosowane spektrometry IR to praktycznie wyłącznie aparaty FT-IR (Fourier Transform Infra Red), cechują się one dużą prędkością zbierania widm (kilka sekund na widmo), mniejszym kosztem, wyższą stabilnością oraz lepszą czułością w porównaniu do klasycznych spektrometrów dyspersyjnych. Do innych detektorów np. MS Wylot kolumny GC Celka pomiarowa wykonana w technologii Lightpipe Wiązka IR ze spektrometru Detektor Ogrzewany termostat
Techniki oparte o wykorzystanie spektroskopii w podczerwieni (X-IR) Połączenie GC-IR
Techniki oparte o wykorzystanie spektroskopii w podczerwieni (X-IR) Połączenie HPLC-IR (SFC-IR) Eluent z kolumny HPLC Grzałka dyszy Kapilara śr. wew. 100 µm Do detektora Lustro IR Wiązka IR ze spektrometru Gaz ogrzewający kapilarę Faza ruchoma Osad analitu Germanowy dysk Silnik
Techniki oparte o wykorzystanie spektroskopii w podczerwieni (X-IR) Spektroskopia w podczerwieni - cechy Nieniszcząca metoda badawcza. Możliwość szeregowego łączenia z innymi detektorami. Umożliwia rozróżnienie izomerów strukturalnych. Metoda komplementarna do MS. Stosunkowo mała czułość. Szeroko stosowana do identyfikacji leków, używek, polimerów, barwników. Bogate biblioteki widm IR ułatwiają identyfikację nieznanych substancji.
Techniki oparte o wykorzystanie spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR)
Techniki oparte o wykorzystanie spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) Podstawy spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (Nuclear Magnetic Resonance) Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego - metoda badawcza polegająca na pomiarze absorbcji promieniowania elektromagnetycznego przez jądra atomowe umieszczone w silnym zewnętrznym polu magnetycznym. Jądra atomowe wykazują właściwość zwaną spinem. O ile liczba protonów i liczba neutronów tworzących jądro nie są jednocześnie parzyste to spin takiego jądra jest różny od zera. Takie jądra atomowe są przedmiotem badań NMR. W zależności od swojego ułożenia w cząsteczce związku chemicznego, atomy (jądra atomów) danego pierwiastka pochłaniają różne częstotliwości promieniowania co umożliwia określenie ich ilości oraz wzajemnego położenia.