cobas EGFR Mutation Test v2

cobas EGFR Mutation Test Do stosowania w diagnostyce in vitro cobas DNA Sample Preparation Kit 24 Tests P/N: 05985536190 cobas cfdna Sample Preparation Kit24 Tests P/N: 07247737190 cobas EGFR Mutation Test 24 Tests P/N: 07248563190

cobas EGFR Mutation Test SPIS TREŚCI cobas EGFR Mutation Test : Zastosowanie... 5 Podsumowanie oraz opis testu... 5 Informacje podstawowe... 5 Zasady procedury... 7 Przygotowanie próbek... 7 Amplifikacja PCR... 7 CZĘŚĆ A: DO STOSOWANIA Z PRÓBKAMI TKANKI... 9 Przygotowanie próbek... 9 Materiały i odczynniki... 10 Dostarczane materiały i odczynniki... 10 Przechowywanie i użytkowanie odczynników... 12 Wymagane materiały dodatkowe... 13 Urządzenia i oprogramowanie wymagane, lecz niedostarczane... 14 Wymagania dotyczące środków ostrożności i użytkowania... 14 Ostrzeżenia i środki ostrożności... 14 Dobra praktyka laboratoryjna... 14 Zanieczyszczenie... 15 Integralność... 15 Utylizacja... 15 Rozlanie płynów i czyszczenie... 16 Pobieranie, transport i przechowywanie próbek... 16 Pobieranie próbek... 16 Przechowywanie i trwałość próbek podczas transportu... 16 Przechowywanie i stabilność próbki przetworzonej... 17 Procedura testowa... 17 Wykonywanie oznaczenia... 17 Instrukcja użytkowania... 18 Procedura izolacji DNA... 20 Ocena ilościowa stężenia DNA... 22 Amplifikacja i detekcja... 22 Konfigurowanie aparatu... 23 Konfiguracja zlecenia testu... 23 Konfigurowanie aparatu... 24 Obliczanie rozcieńczenia roztworu podstawowego DNA, pochodzącego z próbki... 25 Rozcieńczenie próbki... 26 Doc. Rev. 1.0 2

Konfiguracja reakcji... 26 Przygotowanie roboczych odczynników Master Mix (MMX-1, MMX-2 i MMX-3 )... 26 Przygotowanie płytki... 27 Rozpoczęcie reakcji PCR... 28 cobas EGFR Mutation Test Wyniki... 29 Interpretacja wyników... 29 Ponowny test próbek z nieważnymi wynikami... 29 Kontrola jakości i ważność wyników... 30 Kontrola mutacji... 30 Kontrola ujemna... 30 Ograniczenia metody... 30 Ocena skuteczności w badaniach nieklinicznych... 32 Czułość analityczna granica próby ślepej... 32 Granica wykrywalności przy użyciu mieszanek próbek FFPET... 32 Minimalna zawartość tkanki guza... 34 Swoistość mikroorganizmy i homologi EGFR... 35 Mikroorganizmy związane z płucami... 35 Plazmidy homologów EGFR... 35 Substancje wpływające na wynik testu... 35 Tkanka martwicza... 36 Powtarzalność... 36 Odtwarzalność przygotowywania próbek... 36 Ocena klinicznej skuteczności testu... 36 Badanie odtwarzalności klinicznej... 36 Korelacja z metodą referencyjną wykorzystującą próbki fazy III z badania EURTAC... 37 Dane dotyczące wyniku klinicznego... 39 CZĘŚĆ B: DO STOSOWANIA Z PRÓBKAMI OSOCZA... 41 Przygotowanie próbek... 41 Materiały i odczynniki... 42 Dostarczane materiały i odczynniki... 42 Przechowywanie i użytkowanie odczynników... 45 Wymagane materiały dodatkowe... 45 Urządzenia i oprogramowanie wymagane, lecz niedostarczane... 46 Wymagania dotyczące środków ostrożności i użytkowania... 46 Ostrzeżenia i środki ostrożności... 46 Dobra praktyka laboratoryjna... 46 Zanieczyszczenie... 47 Doc. Rev. 1.0 3

cobas EGFR Mutation Test Integralność... 47 Utylizacja... 47 Rozlanie płynów i czyszczenie... 48 Pobieranie, transport i przechowywanie próbek... 48 Pobieranie próbek i praca z próbkami... 48 Transport, przechowywanie i stabilność próbek... 48 Przechowywanie i stabilność próbki przetworzonej... 49 Procedura testowa... 50 Wykonywanie oznaczenia... 50 Instrukcja użytkowania... 50 Amplifikacja i detekcja... 53 Konfigurowanie aparatu... 55 Konfiguracja reakcji... 55 Przygotowanie płytki... 56 Rozpoczęcie reakcji PCR... 57 Wyniki... 58 Interpretacja wyników... 58 Wskaźnik półilościowy (SQI)... 58 Ponowny test próbek z nieważnymi wynikami... 59 Kontrola jakości i ważność wyników... 59 Kontrola mutacji... 59 Kontrola ujemna... 59 Ograniczenia metody... 59 Ocena skuteczności w badaniach nieklinicznych... 60 Granica wykrywalności przy użyciu DNA linii komórkowych... 61 Korelacja z MiSeq przy użyciu klinicznych próbek osocza K2 EDTA... 61 Liniowość... 62 Powtarzalność... 65 Dodatkowe informacje... 66 Oznaczenia... 66 Wytwórca i dystrybutorzy... 67 Znaki towarowe i patenty... 67 Copyright... 67 Piśmiennictwo... 68 Wersja dokumentu... 69 Doc. Rev. 1.0 4

cobas EGFR Mutation Test cobas EGFR Mutation Test : Zastosowanie Test cobas EGFR Mutation Test jest oparty na reakcji PCR zachodzącej w czasie rzeczywistym, przeznaczony do jakościowej detekcji i identyfikacji mutacji w eksonach 18., 19., 20. i 21. genu kodującego receptor naskórkowego czynnika wzrostu (ang. epidermal growth factor receptor, EGFR) w DNA pochodzącym z utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie próbek tkanki (ang. formalin-fixed paraffin-embedded tissue, FFPET) nowotworowej lub osocza od pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca (ang. non-small cell lung cancer, NSCLC). Test jest także przeznaczony jako pomoc w doborze pacjentów z NSCLC do terapii inhibitorem kinazy tyrozynowej (ang. tyrosine kinase inhibitor, TKI) EGFR. Test cobas EGFR Mutation Test do stosowania z osoczem jest także wskazany do półilościowego oznaczania mutacji w eksonach 18., 19., 20. i 21. genu EGFR z pobranych serii próbek osocza ludzkiego i jako pomoc w leczeniu pacjentów z rakiem NSCLC. Próbki FFPET są przetwarzane przy użyciu zestawu cobas DNA Sample Preparation Kit, a próbki osocza są przetwarzane przy użyciu cobas cfdna Sample Preparation Kit. Test cobas EGFR Mutation Test i analizator cobas z 480 są stosowane razem do automatycznej amplifikacji i detekcji. Podsumowanie oraz opis testu Informacje podstawowe Uaktywnienie się mutacji genu kodującego EGFR następuje głównie w przypadku NSCLC i skutkuje konstytutywną aktywacją białka EGFR, które wykazuje aktywność kinazy, przyczyniając się tym samym do rozwoju procesu onkogennego. 1 Częstość występowania tych mutacji w niewyselekcjonowanych przypadkach NSCLC wynosi około 10 30% 2, 3. Jednak mutacje te występują częściej (choć nie wyłącznie) u niepalących/palących rzadko pacjentek pochodzenia azjatyckiego, u których w badaniach histopatologicznych wykrywa się gruczolakoraka 4. Najczęstsze mutacje EGFR w NSCLC obejmują różne delecje w eksonie 19. i mutację substytucji L858R w eksonie 21.; mutacje te łącznie stanowią około 85% mutacji EGFR obserwowanych w NSCLC. 5 Test cobas EGFR Mutation (cobas EGFR Test) to test reakcji PCR zachodzącej w czasie rzeczywistym opracowany do wykrywania mutacji substytucji G719X w eksonie 18., mutacji delecji w eksonie 19., mutacji substytucji T790M i S768I w eksonie 20., mutacji insercji w eksonie 20. oraz mutacji substytucji L858R i L861Q w eksonie 21. Tabela 1 wymienia mutacje EGFR wykrywane za pomocą testu cobas EGFR. Doc. Rev. 1.0 5

cobas EGFR Mutation Test Tabela 1 Test cobas EGFR jest przeznaczony do detekcji następujących mutacji Ekson Ekson 18. Ekson 19. Ekson 20. Ekson 21. Grupa mutacji EGFR G719X Ex19Del Sekwencja kwasu nukleinowego genu kodującego EGFR Identyfikator COSMIC 6 2156G>C 6239 2155G>A 6252 2155G>T 6253 2240_2251del12 6210 2239_2247del9 6218 2238_2255del18 6220 2235_2249del15 6223 2236_2250del15 6225 2239_2253del15 6254 2239_2256del18 6255 2237_2254del18 12367 2240_2254del15 12369 2240_2257del18 12370 2239_2248TTAAGAGAAG>C 12382 2239_2251>C 12383 2237_2255>T 12384 2235_2255>AAT 12385 2237_2252>T 12386 2239_2258>CA 12387 2239_2256>CAA 12403 2237_2253>TTGCT 12416 2238_2252>GCA 12419 2238_2248>GC 12422 2237_2251del15 12678 2236_2253del18 12728 2235_2248>AATTC 13550 2235_2252>AAT 13551 2235_2251>AATTC 13552 2253_2276del24 13556 2237_2257>TCT 18427 2238_2252del15 23571 2233_2247del15 26038 S768I 2303G>T 6241 T790M 2369C>T 6240 2307_2308ins9GCCAGCGTG 12376 2319_2320insCAC 12377 Ex20Ins 2310_2311insGGT 12378 2311_2312ins9GCGTGGACA 13428 2309_2310AC>CCAGCGTGGAT 13558 L858R 2573T>G 6224 2573_2574TG>GT 12429 L861Q 2582T>A 6213 Doc. Rev. 1.0 6

cobas EGFR Mutation Test Zasady procedury Test cobas EGFR jest oparty na dwóch głównych procesach: (1) ręcznym przygotowaniu próbki w celu pozyskania DNA z próbek FFPET oraz (2) amplifikacji PCR i detekcji docelowego DNA z użyciem komplementarnych par primerów oraz znakowanych barwnikami fluorescencyjnymi sond oligonukleotydowych. Test cobas EGFR jest przeznaczony do detekcji następujących mutacji: Ekson 18.: G719X (G719A, G719C i G719S) Ekson 19.: delecje i mutacje złożone Ekson 20.: S768I, T790M i insercje Ekson 21.: L858R i L861Q Detekcję mutacji uzyskuje się w toku analizy PCR za pomocą analizatora cobas z 480. Do każdego przebiegu testowego włącza się kontrolę mutacji oraz kontrolę ujemną w celu potwierdzenia ważności przebiegu. Przygotowanie próbek Zestawy cobas DNA Sample Preparation Kit oraz cobas cfdna Sample Preparation Kit to zestawy do ręcznego przygotowywania próbek na podstawie wiązania kwasu nukleinowego do włókien szklanych. Proteaza i chaotropowy bufor do lizy/wiążący uwalnia kwasy nukleinowe i chroni uwolniony DNA przed DNazami. W dalszej kolejności do mieszaniny, w której dokonano lizy, dodaje się izopropanol, po czym mieszaninę wiruje się i przepuszcza przez kolumnę z wkładem filtrującym, zawierającym włókna szklane. W trakcie wirowania DNA ulega związaniu na powierzchni włókien szklanych filtra. Substancje niezwiązane, takie jak sole, białka i inne zanieczyszczenia pochodzenia komórkowego, zostają usunięte w wyniku wirowania. Zaadsorbowane kwasy nukleinowe są przemywane i poddane elucji roztworem wodnym. Następnie docelowy DNA amplifikuje się i poddaje detekcji w analizatorze cobas z 480 z użyciem odczynników do amplifikacji i detekcji, dostarczanych wraz z zestawem cobas EGFR Mutation Test. Amplifikacja PCR Wybór sekwencji docelowej W teście cobas EGFR wykorzystuje się primery określające specyficzne sekwencje par zasad każdej z mutacji docelowych. W przypadku mutacji substytucji G719X w eksonie 18. docelowe są sekwencje liczące od 104 do 106 par zasad; w przypadku mutacji delecji w eksonie 19. docelowe są sekwencje liczące od 125 do 141 par zasad; w przypadku mutacji substytucji S768I w eksonie 20. docelowa jest sekwencja licząca 133 pary zasad; w przypadku mutacji substytucji T790M w eksonie 20. docelowa jest sekwencja licząca 118 par zasad; w przypadku mutacji insercji w eksonie 20. docelowe są sekwencje liczące od 125 do 143 par zasad; w przypadku mutacji substytucji L858R w eksonie 21. docelowa jest sekwencja licząca 138 par zasad; w przypadku mutacji substytucji L861Q w eksonie 21. docelowa jest sekwencja licząca 129 par zasad. Amplifikacja zachodzi jedynie w regionach genu kodującego EGFR między primerami; całość genu kodującego EGFR nie ulega amplifikacji. Amplifikacja sekwencji docelowej Do amplifikacji sekwencji docelowej wykorzystuje się polimerazę DNA Z05-AS1 pochodzącą ze szczepów Thermus. Mieszanina PCR jest najpierw podgrzewana w celu denaturacji genomowego DNA oraz odsłonięcia sekwencji docelowych primerów. W miarę ochładzania się mieszaniny primery sensowne oraz antysensowne hybrydyzują z docelowymi sekwencjami DNA. Polimeraza DNA Z05 w obecności kationu dwuwartościowego metalu oraz nadmiaru dezoksyrybonukleotydów (dntp) wydłuża każdy przyłączony w wyniku hybrydyzacji primer i w ten sposób następuje synteza drugiej nici DNA. Proces ten kończy pierwszy cykl PCR, dostarczając dwuniciowej kopii DNA, zawierającej regiony genu kodującego EGFR z docelowymi sekwencjami par zasad. Doc. Rev. 1.0 7

cobas EGFR Mutation Test Proces ten powtarza się wielokrotnie, przy czym w każdym z cykli ilość zwielokrotnionego DNA (amplikonu) ulega podwojeniu. Zautomatyzowana detekcja mutacji w czasie rzeczywistym Test cobas EGFR wykorzystuje technologię PCR w czasie rzeczywistym (ang. real-time PCR). W tej reakcji każda swoista dla sekwencji docelowej sonda oligonukleotydowa jest znakowana barwnikiem fluorescencyjnym, służącym jako reporter, a także cząsteczką pełniącą funkcję wygaszacza absorbującego (wygaszającego) emisje fluorescencyjne pochodzące z barwnika reporterowego w nienaruszonej sondzie. W trakcie każdego cyklu amplifikacji sonda komplementarna do sekwencji jednoniciowego DNA w amplikonie wiąże się z nią, a następnie ulega rozszczepieniu pod wpływem polimerazy DNA Z05-AS1, wykazującej aktywność nukleazy w kierunku od końca 5' do końca 3' łańcucha. Po oddzieleniu się barwnika reporterowego od wygaszacza wskutek aktywności nukleazy można zmierzyć promieniowanie fluorescencyjne o charakterystycznej długości fali po wzbudzeniu barwnika reporterowego odpowiednim widmem światła. Do znakowania mutacji docelowych dla tego testu użyto czterech różnych barwników reporterowych. Produkty amplifikacji docelowych siedmiu sekwencji wchodzących w skład genu kodującego EGFR są wykrywane niezależnie w toku trzech reakcji przez pomiar fluorescencji o czterech charakterystycznych długościach fal w wydzielonych kanałach optycznych. Amplifikacja wybiórcza Amplifikacja wybiórcza docelowego kwasu nukleinowego z próbki jest osiągana w teście cobas EGFR dzięki użyciu enzymu AmpErase (uracylo-n-glikozylaza) i trifosforanu dezoksyurydyny (dutp). 7 Enzym AmpErase rozpoznaje i katalizuje niszczenie nici DNA zawierających dezoksyurydynę, ale nie DNA zawierającego tymidynę. Dezoksyurydyna nie wchodzi w skład występującego w naturze DNA, jest natomiast zawsze obecna w amplikonie wskutek użycia dutp zamiast trójfosforanu dezoksytymidyny jako jednego z trójfosforanów nukleotydów w odczynnikach Master Mix; dlatego wyłącznie amplikon zawiera dezoksyurydynę. Dezoksyurydyna powoduje wrażliwość zanieczyszczającego amplikonu na rozkład przez enzym AmpErase przed amplifikacją docelowego DNA. Enzym AmpErase zawarty w odczynnikach Master Mix katalizuje rozkład DNA zawierającego dezoksyurydynę w miejscu reszt dezoksyurydynowych przez otwarcie łańcucha dezoksyrybozy w pozycji C1. Podczas ogrzewania w pierwszym cyklu termicznym przy wartościach ph oznaczających środowisko zasadowe łańcuch amplikonu DNA pęka w miejscu, w którym znajduje się dezoksyurydyna, w ten sposób wykluczając dalszą amplifikację DNA. Enzym AmpErase jest nieczynny w temperaturach powyżej 55 C, tj. w czasie trwania całego cyklu termicznego, dlatego też nie niszczy on amplikonu docelowego. Wykazano, że test cobas EGFR inaktywuje zmutowany amplikon EGFR zawierający dezoksyurydynę. Doc. Rev. 1.0 8

CZĘŚĆ A: Do stosowania z próbkami tkanek cobas EGFR Mutation Test W PRZYPADKU PRÓBEK TKANKI NALEŻY POSTĘPOWAĆ ZGODNIE Z INSTRUKCJAMI W CZĘŚCI A. W PRZYPADKU PRÓBEK OSOCZA NALEŻY POSTĘPOWAĆ ZGODNIE Z INSTRUKCJAMI W CZĘŚCI B. CZĘŚĆ A: DO STOSOWANIA Z PRÓBKAMI TKANKI Przygotowanie próbek Próbki FFPET są przetwarzane w celu izolowania genomowego DNA przy użyciu zestawu cobas DNA Sample Preparation Kit, manualnego przygotowywania próbek opartego na podstawie wiązania kwasu nukleinowego do włókien szklanych. Pozbawiony parafiny skrawek próbki FFPET o grubości 5 mikronów zostaje poddany lizie przez inkubację w podwyższonej temperaturze z proteazą i chaotropowym buforem do lizy/wiążącym, który uwalnia kwasy nukleinowe i chroni uwolniony genomowy DNA przed DNazami. W dalszej kolejności do mieszaniny, w której dokonano lizy, dodaje się izopropanol, po czym mieszaninę wiruje się i przepuszcza przez kolumnę z wkładem filtrującym, zawierającym włókna szklane. W trakcie wirowania genomowy DNA ulega związaniu na powierzchni włókien szklanych filtra. Substancje niezwiązane, takie jak sole, białka i inne zanieczyszczenia pochodzenia komórkowego, zostają usunięte w wyniku wirowania. Zaadsorbowane kwasy nukleinowe są przemywane i poddane elucji roztworem wodnym. Ilość genomowego DNA określa się spektrofotometrycznie i dostosowuje do ustalonego stężenia dodawanego do mieszaniny do amplifikacji/detekcji. Następnie docelowy DNA amplifikuje się i poddaje detekcji w analizatorze cobas z 480 z użyciem odczynników do amplifikacji i detekcji, dostarczanych wraz z zestawem cobas EGFR Mutation Test. Doc. Rev. 1.0 9

CZĘŚĆ A: Do stosowania z próbkami tkanek cobas EGFR Mutation Test Materiały i odczynniki Dostarczane materiały i odczynniki Zestaw/kasety Elementy i składniki odczynników Ilość na test Symbol bezpieczeństwa i ostrzeżenie a cobas DNA Sample Preparation Kit 24 testów (P/N: 05985536190) DNA TLB (DNA Bufor do lizy tkanek) (P/N: 05517613001) Bufor Tris-HCl Chlorek potasu 0,04% EDTA 0,1% Triton X-100 0,09% azydku sodu PK (Proteinaza K) (P/N: 05860695102) Proteinaza K, liofilizowana DNA PBB (DNA Bufor wiążący parafinę) (P/N: 05517621001) Bufor Tris-HCl 49,6% chlorowodorku guanidyny 0,05% mocznika 17,3% Triton X-100 WB I (DNA Bufor płuczący I) (P/N: 05517656001) Bufor Tris-HCl 64% chlorowodorku guanidyny WB II (DNA Bufor płuczący II) (P/N: 05517664001) Bufor Tris-HCl Chlorek sodu DNA EB (DNA bufor do elucji) (P/N: 05517630001) Bufor Tris-HCl 0,09% azydku sodu FT (Probówki z filtrem i z zatyczkami) (P/N: 05089506102) 1 x 10 ml Niebezpieczeństwo H302 + H332: Działa szkodliwie po połknięciu i w następstwie wdychania. H315: Działa drażniąco na skórę. H317: Może powodować reakcję alergiczną skóry. H318: Powoduje poważne uszkodzenie 1 x 100 mg oczu. H334: Może powodować objawy alergii lub astmy lub trudności w oddychaniu w następstwie wdychania. H335: Może powodować podrażnienie dróg oddechowych. 1 x 10 ml P261: Unikać wdychania pyłu/dymu/gazu/mgły/par/rozpylonej cieczy. P280: Stosować rękawice ochronne/ochronę oczu/ochronę twarzy. P284: Stosować indywidualne środki 1 x 25 ml ochrony dróg oddechowych. P305 + P351 + P338 + P310: W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO OCZU: Ostrożnie płukać wodą przez kilka minut. Wyjąć soczewki kontaktowe, jeżeli są i 1 x 12,5 ml można je łatwo usunąć. Nadal płukać. Natychmiast skontaktować się z OŚRODKIEM ZATRUĆ lub lekarzem. P342 + P311: W przypadku wystąpienia objawów ze strony układu oddechowego: Skontaktować się z OŚRODKIEM 1 x 6 ml ZATRUĆ lub lekarzem. P362 + P364: Zanieczyszczoną odzież zdjąć i wyprać przed ponownym użyciem. 1 x 25 sztuk CT (Probówki zbiorcze) (P/N: 05880513001) 3 x 25 sztuk Doc. Rev. 1.0 10

CZĘŚĆ A: Do stosowania z próbkami tkanek cobas EGFR Mutation Test Zestaw/kasety Elementy i składniki odczynników Ilość na test Symbol bezpieczeństwa i ostrzeżenie a cobas EGFR Mutation Test 24 testów (P/N: 07248563190) EGFR MMX-1 (EGFR Master Mix 1) (P/N 06471366001) Bufor Tris Chlorek potasu Glicerol EDTA Tween 20 3,13% dimetylosulfotlenku 0,09% azydku sodu < 0,10% dntp < 0,01% polimerazy DNA Z05-AS1 (bakteryjnej) < 0,01% enzymu AmpErase (uracylo- N-glikozylazy) (bakteryjnej) < 0,01% aptameru < 0,01% primerów sensownych i antysensownych EGFR < 0,01% sond EGFR znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym EGFR MMX-2 (EGFR Master Mix 2) (P/N 06471382001) Bufor Tris Chlorek potasu Glicerol EDTA Tween 20 3,13% dimetylosulfotlenku 0,09% azydku sodu < 0,10% dntp < 0,01% polimerazy DNA Z05-AS1 (bakteryjnej) < 0,01% enzymu AmpErase (uracylo- N-glikozylazy) (bakteryjnej) < 0,01% aptameru < 0,01% primerów sensownych i antysensownych EGFR < 0,01% sond EGFR znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym EGFR MMX-3 (EGFR Master Mix 3) (P/N 07248610001) Bufor Tris Chlorek potasu Glicerol EDTA Tween 20 3,13% dimetylosulfotlenku 0,09% azydku sodu < 0,10% dntp < 0,01% polimerazy DNA Z05-AS1 (bakteryjnej) < 0,01% enzymu AmpErase (uracylo- N-glikozylazy) (bakteryjnej) < 0,01% aptameru < 0,01% primerów sensownych i antysensownych EGFR < 0,01% sond EGFR znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym 2 x 0,48 ml 2 x 0,48 ml 2 x 0,48 ml Nie dotyczy Nie dotyczy Nie dotyczy Doc. Rev. 1.0 11

CZĘŚĆ A: Do stosowania z próbkami tkanek cobas EGFR Mutation Test Zestaw/kasety Elementy i składniki odczynników Ilość na test Symbol bezpieczeństwa i ostrzeżenie a cobas EGFR Mutation Test 24 testów (P/N: 07248563190) MGAC (Octan magnezu) (P/N 05854326001) Octan magnezu 0,09% azydku sodu EGFR MC (EGFR Kontrola mutacji) (P/N 06471455001) Bufor Tris EDTA Poli-rA RNA (syntetyczny) 0,05% azydku sodu < 0,1% plazmidowego DNA (bakteryjnego) zawierającego sekwencje eksonów: 18., 19., 20. i 21. genu kodującego EGFR < 0,1% naturalnie występującego DNA genu kodującego EGFR (z hodowli komórkowej) DNA SD (DNA Rozcieńczalnik próbki) (P/N 05854474001) Bufor Tris-HCl 0,09% azydku sodu 6 x 0,2 ml 6 x 0,1 ml 2 x 3,5 ml a Oznakowanie bezpieczeństwa produktu jest zasadniczo zgodne z wytycznymi GHS UE. Nie dotyczy Nie dotyczy Nie dotyczy Przechowywanie i użytkowanie odczynników Odczynnik Temperatura przechowywania cobas DNA Sample Preparation Kit* od 15 C do 30 C cobas EGFR Mutation Test ** od 2 C do 8 C Uwaga: Nie wolno zamrażać odczynników z wyjątkiem odczynnika PK. Czas przechowywania Po otwarciu zachowują stabilność do 8-krotnego użycia w ciągu 90 dni lub do podanej daty ważności, w zależności od tego, który termin wypada wcześniej. Po otwarciu zachowują stabilność do 4-krotnego użycia w ciągu 90 dni lub do podanej daty ważności, w zależności od tego, który termin wypada wcześniej. * Po dodaniu jałowej wody wolnej od nukleaz do odczynnika PK, niezużyty, rozpuszczony odczynnik PK należy przechowywać w porcjach o równych objętościach po 450 µl w temperaturze -20 C. Po rozpuszczeniu odczynnik PK trzeba zużyć w ciągu 90 dni albo do daty ważności, zależnie od tego, który termin wypada wcześniej. Po dodaniu etanolu bezwodnego odczynniki WB I i WB II należy przechowywać w temperaturze od 15 C do 30 C. Wymienione roztwory robocze zachowują stabilność przez 90 dni albo do daty ważności, w zależności od tego, który termin wypada wcześniej. ** Odczynniki EGFR MMX-1, EGFR MMX-2, EGFR MMX-3 oraz roboczy odczynnik MMX (przygotowany przez dodanie odczynnika MGAC do EGFR MMX-1 lub EGFR MMX-2 lub EGFR MMX-3 ) należy chronić przed długotrwałą ekspozycją na światło. Roboczy odczynnik MMX trzeba przechowywać w zaciemnionym miejscu w temperaturze od 2 C do 8 C. Przygotowane próbki i kontrole należy dodać do roboczego odczynnika MMX w ciągu 1 godziny od jego przygotowania. Amplifikację należy rozpocząć w ciągu 1 godziny od chwili dodania przygotowanych próbek badanych i kontrolnych do roboczego odczynnika MMX. Doc. Rev. 1.0 12

CZĘŚĆ A: Do stosowania z próbkami tkanek cobas EGFR Mutation Test Wymagane materiały dodatkowe Materiały Ksylen (ACS, 98,5% ksylenów) Etanol bezwodny (200 proof, do biologii molekularnej) Dowolny dostawca P/N Sigma, nr kat. E7023 lub Fisher Scientific, nr kat. BP2818-500 albo odpowiednik Izopropanol (ACS, >99,5%) Sigma, nr kat. 190764 lub Fisher Scientific, nr kat. A451-1 albo odpowiednik Jałowa woda wolna od nukleazy (do biologii molekularnej) Wybielacz Applied Biosystems (Ambion) AM9937 lub GE Healthcare Hyclone TM SH3053801 albo odpowiednik Dowolny dostawca 70% etanol Dowolny dostawca Jałowe, jednorazowe, serologiczne pipety 5 i 25 ml Płytki z mikrodołkami systemu cobas 4800 (płytki AD) i film do zaklejania Aplikator filmu do zaklejania systemu cobas 4800 (dostarczany wraz z instalacją systemu cobas 4800) Pipetory regulowane* (mogące pipetować 5 1000 µl) Wolne od DNaz końcówki z osłoną aerozolową lub dodatnim wypieraniem. Pipet-Aid TM * Mikrowirówka laboratoryjna* (umożliwiająca wirowanie przy 20 000 x g) Dwa suche bloki grzejne, umożliwiające ogrzewanie probówek do mikrowirówki do temperatury 56 C i 90 C* Probówki do mikrowirówki Safe-Lock TM (jałowe o pojemności 1,5 ml, wolne od RNaz/DNaz, o czystości do PCR) Statywy do probówek do mikrowirówki Spektrofotometr do pomiaru stężenia DNA* Mieszadło wibracyjne* Rękawiczki jednorazowe, bezpudrowe Kalibrowane termometry do suchego bloku grzejnego* Łaźnia wodna*, umożliwiająca utrzymywanie temperatury 37 C Skalpel z jednostronnym ostrzem lub podobne narzędzie Dowolny dostawca Roche 05232724001 Roche 04900383001 Dowolny dostawca Dowolny dostawca Drummond 4-000-100 albo odpowiednik Eppendorf 5430 lub 5430R albo odpowiednik Dowolny dostawca Eppendorf 022363204 albo odpowiednik Dowolny dostawca Dowolny dostawca Dowolny dostawca Dowolny dostawca Dowolny dostawca Dowolny dostawca Dowolny dostawca Całe wyposażenie powinno być konserwowane zgodnie z instrukcjami producenta. W celu uzyskania dodatkowych informacji dotyczących materiałów sprzedawanych oddzielnie prosimy o kontakt z miejscowym przedstawicielstwem firmy Roche. Doc. Rev. 1.0 13

CZĘŚĆ A: Do stosowania z próbkami tkanek cobas EGFR Mutation Test Urządzenia i oprogramowanie wymagane, lecz niedostarczane Analizator cobas z 480 Wymagane urządzenia i oprogramowanie, lecz niedostarczane Jednostka sterująca systemu cobas 4800 z oprogramowaniem systemu w wersji 2.1 lub nowszej Pakiet oprogramowania EGFR Tissue Analysis Package Software w wersji 1.0 lub nowszy Zewnętrzny czytnik kodów kreskowych, podłączany do portu USB Drukarka (np. HP P2055d) W celu uzyskania dodatkowych informacji dotyczących materiałów sprzedawanych oddzielnie prosimy o kontakt z miejscowym przedstawicielstwem firmy Roche. Wymagania dotyczące środków ostrożności i użytkowania Ostrzeżenia i środki ostrożności Podobnie jak w przypadku każdej procedury testowej, dla prawidłowego przeprowadzenia badania kluczowe znaczenie ma zachowanie zasad dobrej praktyki laboratoryjnej. Do stosowania wyłącznie w diagnostyce in vitro. Karty charakterystyki (Safety Data Sheet, SDS) są dostępne na żądanie w miejscowym przedstawicielstwie firmy Roche. Niniejszy test jest przeznaczony do badania próbek FFPET NSCLC. Z próbkami należy obchodzić się tak, jak z materiałem zakaźnym, stosując laboratoryjne procedury bezpieczeństwa, takie jak określone w dokumentach Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 8 oraz w dokumencie M29-A4 CLSI. 9 Odczynniki DNA PBB i DNA TLB zawierają Triton X-100, środek drażniący błony śluzowe. Należy unikać kontaktu tych odczynników z oczami, skórą i błonami śluzowymi. Ksylen to niebezpieczny związek chemiczny i podczas używania go należy korzystać z wyciągu chroniącego przed chemikaliami. Należy go wyrzucać wraz z odpadami chemicznymi zgodnie z przepisami lokalnymi, stanowymi i federalnymi. Zaleca się używanie jałowych, jednorazowych pipet oraz końcówek pipetorów wolnych od DNaz. Dobra praktyka laboratoryjna Nie należy pipetować za pomocą ust. Nie wolno jeść, pić ani palić w obszarach roboczych laboratorium. Po pracy z próbkami i zestawami odczynników należy dokładnie umyć ręce. Podczas pracy z jakimikolwiek odczynnikami należy używać osłon na oczy oraz fartuchów laboratoryjnych i rękawic jednorazowych. Należy unikać kontaktu wymienionych materiałów ze skórą, oczami i błonami śluzowymi. Jeżeli dojdzie do kontaktu, miejsce jego wystąpienia należy natychmiast spłukać dużą ilością wody. Jeżeli nie zostaną podjęte odpowiednie działania lecznicze, może dojść do oparzeń. W razie rozlania przed wytarciem należy rozcieńczyć wodą. Dokładnie oczyścić i odkazić wszystkie laboratoryjne powierzchnie robocze świeżo przygotowanym roztworem 0,5% podchlorynu sodu w wodzie destylowanej lub dejonizowanej (rozcieńczyć domowy wybielacz w stosunku 1:10). Następnie należy przetrzeć powierzchnię 70% etanolem. Doc. Rev. 1.0 14

CZĘŚĆ A: Do stosowania z próbkami tkanek cobas EGFR Mutation Test Uwaga: Dostępny w handlu płynny wybielacz przeznaczony do zastosowań domowych zazwyczaj zawiera podchloryn sodu o stężeniu 5,25%. Rozcieńczenie domowego wybielacza w stosunku 1:10 daje 0,5% roztwór podchlorynu sodu. Zanieczyszczenie W celu zapobieżenia zanieczyszczeniu konieczne jest noszenie rękawic i ich zmiana pomiędzy pracą z próbkami i odczynnikami testu cobas EGFR. Podczas pracy z próbkami należy unikać zanieczyszczenia rękawiczek. Rękawiczki należy często zmieniać, aby ograniczyć możliwość zanieczyszczenia. Rękawiczki należy zmieniać przed opuszczeniem obszarów izolacji DNA lub w przypadku podejrzenia kontaktu z roztworami lub próbką. Należy unikać mikrobiologicznego i przez rybonukleazy zanieczyszczenia odczynników. Przed przygotowaniem roboczego MMX należy dokładnie oczyścić obszar roboczy amplifikacji i detekcji. Materiały i urządzenia powinny być przeznaczone do każdego z działań; nie mogą być stosowane w innych działaniach lub przenoszone pomiędzy obszarami. Na przykład pipetory i materiały przeznaczone do izolacji DNA nie mogą być stosowane do przygotowywania odczynników do amplifikacji i detekcji. Zdecydowanie zaleca się, aby przebieg pracy w laboratorium był jednokierunkowy i polegał na zakończeniu jednej czynności przed przejściem do kolejnej. Na przykład izolację DNA należy zakończyć przed rozpoczęciem amplifikacji i detekcji. Izolacja DNA powinna być prowadzona w obszarze oddzielonym od amplifikacji i detekcji. Aby uniknąć zanieczyszczenia odczynnika roboczego Master Mix próbkami DNA, obszar roboczy amplifikacji i detekcji powinien być dokładnie oczyszczony przed przygotowaniem odczynnika roboczego Master Mix. Integralność Nie wolno używać zestawów po upływie daty ważności. Nie należy zlewać odczynników pochodzących z różnych zestawów lub serii. Nie wolno używać przedmiotów jednorazowego użytku po upływie daty ważności. Wszystkie przedmioty jednorazowego użytku są przeznaczone do jednokrotnego użycia. Nie wykorzystywać ponownie. Całe wyposażenie powinno być odpowiednio konserwowane, zgodnie z instrukcjami producenta. Utylizacja Odczynniki DNA TLB, DNA EB, MGAC, EGFR MMX-1, EGFR MMX-2, EGFR MMX-3, EGFR MC i DNA SD zawierają azydek sodu. Azydek sodu może reagować z instalacjami wodno-kanalizacyjnymi wykonanymi z ołowiu lub miedzi, tworząc silnie wybuchowe azydki metali. Usuwając roztwory zawierające azydek sodu do zlewów laboratoryjnych, należy spłukać rury dużą ilością zimnej wody, aby zapobiec nagromadzeniu azydków. Należy wyrzucić wszystkie nieużyte odczynniki, postępując zgodnie z przepisami krajowymi, federalnymi, stanowymi i lokalnymi. Doc. Rev. 1.0 15

CZĘŚĆ A: Do stosowania z próbkami tkanek cobas EGFR Mutation Test Rozlanie płynów i czyszczenie Odczynniki DNA PBB i WB I zawierają chlorowodorek guanidyny. Jeśli płyn zawierający wspomniany bufor ulegnie rozlaniu, do czyszczenia należy używać odpowiedniego detergentu laboratoryjnego i wody. W przypadku rozlania płynu zawierającego potencjalne czynniki zakaźne do czyszczenia należy używać najpierw detergentu laboratoryjnego i wody, a następnie 0,5% roztworu podchlorynu sodu. Jeśli do rozlania płynu dojdzie na powierzchni aparatu cobas 4800, należy postępować zgodnie z instrukcjami zamieszczonymi w odpowiednim Podręczniku systemu system cobas 4800 w celu przeprowadzenia czyszczenia. Do czyszczenia analizatora cobas z 480 nie wolno używać roztworu podchlorynu sodu (wybielacza). Czyszczenie analizatora cobas z 480 należy przeprowadzać zgodnie z procedurami opisanymi w Podręczniku użytkownika systemu cobas 4800. Dodatkowe ostrzeżenia, środki ostrożności i procedury mające na celu zmniejszenie ryzyka zanieczyszczenia analizatora cobas z 480 zamieszczono w Instrukcji obsługi analizatora cobas z 480. Pobieranie, transport i przechowywanie próbek Uwaga: Ze wszystkimi próbkami należy obchodzić się jak z materiałem potencjalnie zakaźnym. Pobieranie próbek Próbki NSCLC FFPET zostały zatwierdzone do wykorzystania w teście cobas EGFR. Przechowywanie i trwałość próbek podczas transportu Próbki FFPET NSCLC można transportować w temperaturze od 15 C do 30 C. Próbki FFPET muszą być transportowane zgodnie z krajowymi, federalnymi, stanowymi i lokalnymi przepisami dotyczącymi transportu czynników chorobotwórczych 10. Stabilność próbek FFPET przechowywanych w temperaturze od 15 C do 30 C potwierdzono przez okres do 12 miesięcy od daty pobrania. Skrawki o grubości pięciu mikronów, osadzone na szkiełkach, można przechowywać w temperaturze od 15 C do 30 C do 60 dni. Doc. Rev. 1.0 16

CZĘŚĆ A: Do stosowania z próbkami tkanek cobas EGFR Mutation Test Przechowywanie i stabilność próbki przetworzonej Próbki przetworzone (ekstrahowany DNA) są stabilne dla: Temperatura przechowywania ekstrahowanego DNA Czas przechowywania Od -15 C do -25 C Od 2 C do 8 C Od 15 C do 30 C Do 3 cykli rozmrażania przez 60 dni Do 14 dni Do 1 dnia Ekstrahowany DNA powinien być używany w zalecanych okresach przechowywania lub przed upływem daty ważności zestawu cobas DNA Sample Preparation Kit użytego do ekstrahowania DNA, w zależności od tego, co nastąpi wcześniej. Procedura testowa Wykonywanie oznaczenia Ryc. 1 Przebieg pracy z testem cobas EGFR Mutation Test i zestawem cobas DNA Sample Preparation Kit 1 Uruchomienie systemu. 2 Wykonanie czynności konserwacyjnych w odniesieniu do aparatu. 3 Wyjęcie próbek i odczynników z miejsca przechowywania. 4 Pozbawienie próbek parafiny. 5 Przeprowadzenie izolacji DNA. 6 Wymycie DNA. 7 Utworzenie harmonogramu pracy i wydrukowanie układu płytki. 8 Przygotowanie odczynników do amplifikacji. 9 Umieszczenie odczynników do amplifikacji na płytce z mikrodołkami. 10 Umieszczenie próbki na płytce z mikrodołkami. 11 Uszczelnienie płytki z mikrodołkami. 12 Umieszczenie płytki z mikrodołkami w analizatorze cobas z 480. 13 Rozpoczęcie przebiegu. 14 Przeanalizowanie wyników. 15 W przypadku korzystania z systemu LIS: przesłanie wyników do systemu LIS. 16 Wyjęcie płytki z analizatora. Doc. Rev. 1.0 17

CZĘŚĆ A: Do stosowania z próbkami tkanek cobas EGFR Mutation Test Instrukcja użytkowania Uwaga: Do badania za pomocą testu cobas EGFR można używać wyłącznie skrawków próbki FFPET NSCLC o grubości 5 mikronów, zawierających co najmniej 10% tkanki guza z danego obszaru. Każdą próbkę zawierającą mniej niż 10% tkanki guza z danego obszaru należy po pozbawieniu jej parafiny przeciąć makroskopowo. Uwaga: Szczegółowe wskazówki dotyczące obsługi analizatora cobas z 480 zamieszczono w Instrukcji obsługi analizatora cobas z 480. Uwaga: Suche bloki grzejne, umożliwiające ogrzewanie probówek do mikrowirówki Safe-Lock TM, należy włączyć i nastawić na temperaturę 56 C i 90 C. Wielkość przebiegu Pojedynczy przebieg testowy może obejmować od 1 do 30 próbek (plus kontrole) w każdej płytce z 96 mikrodołkami. Przy przeprowadzaniu przebiegu testowego obejmującego więcej niż 24 próbki trzeba będzie użyć wielu zestawów testu cobas EGFR. Test cobas EGFR zawiera ilość odczynników wystarczającą do wykonania 8 przebiegów testowych po 3 próbki (plus kontrole), czyli maksymalnie na 24 próbki na zestaw. Przygotowanie odczynników Przed użyciem zestawu po raz pierwszy przygotować odczynniki robocze zgodnie z informacją poniżej. Do dozowania wody użyć pipety serologicznej 5 ml. Do dozowania etanolu użyć pipet serologicznych 25 ml. Jeśli proteinaza K została już rozpuszczona i zamrożona, rozmrozić liczbę równych objętości odczynnika, wystarczającą do przetworzenia liczby próbek przeznaczonych do danego przebiegu testowego. Odczynniki Proteinaza K (PK) Bufor do wymywania I (WB I) Bufor do wymywania II (WB II) Rozpuszczenie / Przygotowanie Rozpuścić proteinazę K (PK) przez dodanie do fiolki 4,5 ml jałowej wody niezawierającej nukleazy (o stopniu czystości odpowiednim do PCR) za pomocą jałowej, jednorazowej pipety serologicznej o pojemności 5 ml. Wymieszać zawartość, odwracając fiolkę do góry dnem od 5 do 10 razy. Przenieść porcję 450 µl rozpuszczonej PK do probówek do mikrowirówki Safe-Lock TM o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -20 C przez maksymalnie 90 dni lub do daty ważności, w zależności od tego, co nastąpi wcześniej. Jeśli proteinaza K została już rozpuszczona i zamrożona, przed pozbawieniem próbek parafiny rozmrozić liczbę równych objętości odczynnika, wystarczającą do przetworzenia liczby próbek przeznaczonych do danego przebiegu testowego (każda próbka wymaga 70 µl rozpuszczonego odczynnika PK). Przygotować roboczy odczynnik WB I dodając 15 ml alkoholu bezwodnego do butelki WB I. Wymieszać odwracając butelkę od 5 do 10 razy. Zapisać na butelce, że dodano etanol, i wpisać datę. Przechowywać odczynnik WB I w temperaturze od 15 C do 30 C przez maksymalnie 90 dni lub do daty ważności, w zależności od tego, co nastąpi wcześniej. Przygotować roboczy odczynnik WB II przez dodanie do butelki z odczynnikiem WB II 50 ml etanolu bezwodnego. Wymieszać zawartość, odwracając butelkę do góry dnem od 5 do 10 razy. Zapisać na butelce, że dodano etanol, i wpisać datę. Przechowywać odczynnik WB II w temperaturze od 15 C do 30 C przez maksymalnie 90 dni lub do daty ważności, w zależności od tego, co nastąpi wcześniej. Wszystkie roztwory przechowywane w temperaturze od 15 C do 30 C powinny być klarowne. Jeżeli w którymkolwiek odczynniku obecny jest osad, ogrzać roztwór w łaźni wodnej o temperaturze 37 C aż do rozpuszczenia się osadu. Nie wolno używać odczynnika do czasu rozpuszczenia się całego osadu. Doc. Rev. 1.0 18

CZĘŚĆ A: Do stosowania z próbkami tkanek cobas EGFR Mutation Test Pozbawienie parafiny skrawków FFPET osadzonych na szkiełkach Uwaga: Ksylen to niebezpieczny związek chemiczny. Wszystkie etapy pozbawiania próbek parafiny należy wykonywać pod wyciągiem chroniącym przed chemikaliami. Patrz rozdział Ostrzeżenia i środki ostrożności. Uwaga: Jeżeli próbka zawiera poniżej 10% tkanki guza z danego obszaru, skrawek należy przeciąć makroskopowo. 1. Włożyć szkiełko z osadzonym skrawkiem FFPET o grubości 5 mikronów do pojemnika zawierającego ksylen w ilości wystarczającej do przykrycia tkanki; pozostawić do nasiąknięcia przez 5 minut. 2. Przenieść szkiełko do pojemnika z etanolem bezwodnym w ilości wystarczającej do przykrycia tkanki; pozostawić do nasiąknięcia przez 5 minut. 3. Wyjąć szkiełko z etanolu i odczekać, aż skrawek całkowicie wyschnie na powietrzu (od 5 do 10 minut). 4. Jeśli próbka zawiera mniej niż 10% tkanki guza z danego obszaru, należy przeciąć ją makroskopowo. 5. Oznakować jedną probówkę do mikrowirówki Safe-Lock TM o pojemności 1,5 ml na każdą próbkę informacjami umożliwiającymi zidentyfikowanie próbki. 6. Dodać 180 µl odczynnika DNA TLB do probówki do mikrowirówki Safe-Lock TM o pojemności 1,5 ml. 7. Dodać 70 µl rozpuszczonego odczynnika PK do probówki do mikrowirówki Safe-Lock TM zawierającej odczynnik DNA TLB. 8. Zeskrobać tkankę ze szkiełka do probówki do mikrowirówki Safe-Lock TM. Zanurzyć tkankę w mieszaninie odczynników DNA TLB/PK. 9. Kontynuować postępowanie od punktu 1 procedury izolacji DNA. Pozbawienie parafiny skrawków FFPET nieosadzonych na szkiełkach Uwaga: Ksylen to niebezpieczny związek chemiczny. Wszystkie etapy pozbawiania próbek parafiny należy wykonywać pod wyciągiem chroniącym przed chemikaliami. Patrz rozdział Ostrzeżenia i środki ostrożności. Uwaga: Jeśli próbka zawiera mniej niż 10% tkanki guza z danego obszaru, należy osadzić skrawek na szkiełku w celu makroskopowego przecięcia, a następnie postępować zgodnie z procedurą omówioną w rozdziale Pozbawienie parafiny skrawków FFPET osadzonych na szkiełkach. 1. Włożyć jeden skrawek FFPET o grubości 5 mikronów do probówki do mikrowirówki Safe-Lock TM o pojemności 1,5 ml oznakowanej informacjami umożliwiającymi zidentyfikowanie każdej próbki. 2. Dodać 500 µl ksylenu do probówki do mikrowirówki Safe-Lock TM, zawierającej skrawek FFPET. 3. Mieszać dokładnie na mieszadle wibracyjnym przez 10 sekund. 4. Odstawić probówkę na 5 minut w temperaturze od 15 C do 30 C. 5. Dodać 500 µl etanolu bezwodnego i mieszać na mieszadle wibracyjnym przez 10 sekund. 6. Odstawić probówkę na 5 minut w temperaturze od 15 C do 30 C. 7. Wirować z przyspieszeniem od 16 000 x g do 20 000 x g przez 2 minuty. Usunąć supernatant bez uszkodzenia peletki. Wyrzucić supernatant do odpadów chemicznych. 8. Dodać 1 ml etanolu bezwodnego i mieszać na mieszadle wibracyjnym przez 10 sekund. 9. Wirować z przyspieszeniem od 16 000 x g do 20 000 x g przez 2 minuty. Usunąć supernatant bez uszkodzenia peletki. Wyrzucić supernatant do odpadów chemicznych. Doc. Rev. 1.0 19

CZĘŚĆ A: Do stosowania z próbkami tkanek cobas EGFR Mutation Test 10. Jeśli peletka unosi się w pozostałym supernatancie, ponownie wirować przez 1 minutę z przyspieszeniem od 16 000 x g do 20 000 x g. Usunąć pozostały supernatant. 11. Suszyć peletkę tkanki przez 10 minut w bloku grzejnym o temperaturze 56 C w otwartej probówce. 12. Przed przejściem do następnego etapu należy upewnić się, że etanol został całkowicie odparowany i peletka jest sucha. 13. W razie potrzeby suche peletki można przechowywać do 24 godzin w temperaturze od 2 C do 8 C. 14. Wytworzyć z peletki tkanki ponownie zawiesinę w 180 µl odczynnika DNA bufor do lizy tkanek (DNA TLB). 15. Dodać 70 µl rozpuszczonego odczynnika PK. 16. Kontynuować postępowanie od punktu 1 procedury izolacji DNA. Procedura izolacji DNA Uwaga: Jednocześnie z próbką(-ami) należy przeprowadzić przetwarzanie kontroli ujemnej. Przygotować kontrolę ujemną przez połączenie 180 µl odczynnika DNA Bufor do lizy tkanek (DNA TLB) i 70 µl roztworu odczynnika PK w probówce do mikrowirówki Safe-Lock TM o pojemności 1,5 ml, oznakowanej napisem NEG. Przetwarzanie kontroli ujemnej powinno przebiegać według takiej samej procedury, jak przetwarzanie próbek. 1. Mieszać na mieszadle wibracyjnym przez 30 sekund probówki zawierające mieszaninę próbka/dna TLB/PK i mieszaninę kontroli ujemnej (NEG). Uwaga: Tkanka musi być całkowicie zanurzona w mieszaninie DNA TLB/PK. 2. Umieścić probówki w suchym bloku grzejnym o temperaturze 56 C i inkubować przez 60 minut. 3. Mieszać probówki na mieszadle wibracyjnym przez 10 sekund. Uwaga: Tkanka musi być całkowicie zanurzona w mieszaninie DNA TLB/PK. 4. Umieścić probówki w suchym bloku grzejnym o temperaturze 90 C i inkubować przez 60 minut. Uwaga: Podczas inkubacji należy przygotować wymaganą liczbę probówek z filtrem (FT) z zawiasowymi zatyczkami, umieszczając każdą FT na probówce zbiorczej (CT) i oznakowując zatyczkę każdej FT odpowiednimi informacjami identyfikującymi próbkę lub kontrolę. Uwaga: Na każdą próbkę będą potrzebne: 1 FT, 3 CT i 1 probówka do elucji (probówka do mikrowirówki Safe-Lock TM o pojemności 1,5 ml). Uwaga: Podczas inkubacji należy oznakować wymaganą liczbę probówek do elucji (probówek do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml) odpowiednimi informacjami identyfikującymi próbkę lub kontrolę. 5. Pozostawić probówki do schłodzenia do temperatury od 15 C do 30 C. Po schłodzeniu odwirować pulsacyjnie, aby zgromadzić płyn z zatyczek. 6. Dodać do każdej probówki po 200 µl odczynnika DNA PBB i wymieszać zawartość przez trzykrotne pobranie mieszaniny pipetą i jej wypuszczenie. 7. Inkubować probówki w temperaturze od 15 C do 30 C przez 10 minut. 8. Dodać do każdej probówki 100 µl izopropanolu i 3 razy wymieszać lizat przez nabieranie pipetą i wypuszczanie. 9. Przenieść każdy lizat do właściwie oznakowanej jednostki FT/CT. 10. Wirować jednostki FT/CT z przyspieszeniem 8000 x g przez 1 minutę. 11. Umieścić każdą probówkę FT na nowej probówce CT. Wyrzucić zawartość ze starej probówki CT do odpadów chemicznych i w odpowiedni sposób usunąć zużytą probówkę CT. 12. Dodać 500 µl roboczego odczynnika WB I do każdej probówki FT. Doc. Rev. 1.0 20

CZĘŚĆ A: Do stosowania z próbkami tkanek cobas EGFR Mutation Test Uwaga: Przygotowanie roboczego odczynnika WB I opisano w rozdziale Przygotowanie odczynników. 13. Wirować jednostki FT/CT z przyspieszeniem 8000 x g przez 1 minutę. 14. Wyrzucić zawartość każdej probówki CT do odpadów chemicznych. Umieścić probówkę FT z powrotem na tej samej probówce CT. 15. Dodać 500 µl roboczego odczynnika WB II do każdej probówki FT. Uwaga: Przygotowanie roboczego odczynnika WB II opisano w rozdziale Przygotowanie odczynników. 16. Wirować jednostki FT/CT z przyspieszeniem 8000 x g przez 1 minutę. 17. Umieścić każdą probówkę FT na nowej probówce CT. Wyrzucić zawartość ze starej probówki CT do odpadów chemicznych i w odpowiedni sposób usunąć zużytą probówkę CT. 18. Wirować jednostki FT/CT z przyspieszeniem od 16 000 do 20 000 x g przez 1 minutę, aby osuszyć membrany filtrów. 19. Umieścić każdą FT w probówce do elucji (probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml), oznakowanej uprzednio informacjami identyfikującymi próbkę lub kontrolę. Wyrzucić zawartość ze zużytej probówki CT do odpadów chemicznych i w odpowiedni sposób usunąć zużytą probówkę CT. 20. Dodać po 100 µl odczynnika DNA EB na środek membrany każdej probówki FT bez dotykania membrany probówki FT. 21. Inkubować probówkę FT z probówką do elucji w temperaturze od 15 C do 30 C przez 5 minut. 22. Wirować probówkę FT z probówką do elucji z przyspieszeniem 8000 x g przez 1 minutę, aby zebrać eluat do probówki do elucji. Usunąć w odpowiedni sposób zużytą probówkę FT. 23. Zamknąć zatyczkę na probówce do elucji. Probówka do elucji zawiera roztwór podstawowy DNA. Przejść do punktu 1 w rozdziale Ocena ilościowa stężenia DNA. Uwaga: Pomiar stężenia DNA należy przeprowadzać natychmiast po zakończeniu procedury izolacji DNA i przed odłożeniem materiału do przechowywania. Doc. Rev. 1.0 21

CZĘŚĆ A: Do stosowania z próbkami tkanek cobas EGFR Mutation Test Ocena ilościowa stężenia DNA 1. Wymieszać każdy roztwór podstawowy DNA na mieszadle wibracyjnym przez 5 sekund. 2. Przeprowadzić ocenę ilościową stężenia DNA za pomocą spektrofotometru zgodnie z protokołem postępowania, podanym przez producenta urządzenia. Do wyzerowania urządzenia użyć odczynnika DNA EB. Należy obliczyć średnią z dwóch zgodnych odczytów. Wyniki dwóch pomiarów powinny mieścić się w granicach ± 10% każdego z nich przy odczytach stężenia DNA > 20,0 ng/µl. W przypadku odczytów stężenia DNA < 20,0 ng/µl wyniki dwóch pomiarów powinny mieścić się w granicach ± 2 ng/µl. Jeżeli wyniki dwóch pomiarów nie mieszczą się w granicach ± 10% każdego z nich przy odczytach stężenia DNA > 20,0 ng/µl lub w granicach ± 2 ng/µl przy odczytach stężenia DNA < 20,0 ng/µl, należy uzyskać dodatkowe 2 odczyty, aby wymogi badania zostały spełnione. Wówczas należy obliczyć średnią z dwóch nowych wyników pomiarów. Uwaga: Nie ma potrzeby wykonywania pomiarów w przypadku roztworu podstawowego DNA, pochodzącego z przetworzonej kontroli ujemnej (NEG CT). 3. Stężenie roztworu podstawowego DNA, pochodzącego z próbek, musi być > 2 ng/µl, aby można było wykonać test cobas EGFR. Każdą próbkę poddaje się trzykrotnej amplifikacji/detekcji z użyciem w każdej amplifikacji/detekcji 25 µl rozcieńczonego roztworu podstawowego DNA o stężeniu 2 ng/µl (co daje ogółem 50 ng DNA). Uwaga: Aby można było przeprowadzić test cobas EGFR Mutation, każdy roztwór podstawowy DNA musi mieć minimalne stężenie 2 ng/µl. Jeżeli stężenie roztworu podstawowego DNA jest < 2 ng/µl, należy powtórzyć procedury: pozbawiania próbek parafiny, izolacji DNA i oceny ilościowej stężenia DNA z użyciem dwóch skrawków FFPET tej próbki o grubości 5 µm. W przypadku próbek osadzonych na szkiełkach po pozbawieniu ich parafiny należy połączyć tkankę z obu skrawków w jednej probówce, zanurzyć tkankę w odczynnikach DNA TLB + PK i przeprowadzić izolację oraz ocenę ilościową stężenia DNA w sposób opisany powyżej. W przypadku próbek nieosadzonych na szkiełkach należy połączyć oba skrawki w jednej probówce i zanurzyć tkankę w odczynnikach DNA TLB + PK, po czym przeprowadzić izolację oraz ocenę ilościową stężenia DNA w sposób opisany powyżej. Jeżeli stężenie roztworu podstawowego DNA nadal jest < 2 ng/µl, należy zwrócić się do ośrodka klinicznego, zlecającego wykonanie badania, o przysłanie kolejnej próbki FFPET. Uwaga: Przetwarzane próbki (wyizolowane DNA) są stabilne maksymalnie przez 24 godziny w temperaturze od 15 C do 30 C, maksymalnie przez 14 dni w temperaturze od 2 C do 8 C, maksymalnie przez 60 dni w temperaturze od -15 C do -25 C lub po przejściu 3 cykli zamrażania i rozmrażania przy przechowywaniu w temperaturze od -15 C do -25 C. Ekstrahowane DNA powinno zostać poddane amplifikacji podczas okresu przechowywania zalecanego w danych warunkach lub przed upłynięciem daty ważności zestawu cobas DNA Sample Preparation Kit użytego do wyizolowania DNA w zależności od tego, co nastąpi wcześniej. Amplifikacja i detekcja Uwaga: Aby zapobiec zanieczyszczeniu roboczego odczynnika MMX próbkami DNA, należy przeprowadzać amplifikację i detekcję w miejscu oddzielonym od obszaru wykonywania izolacji DNA. Przed przygotowaniem roboczego MMX należy dokładnie oczyścić obszar roboczy amplifikacji i detekcji. W celu właściwego oczyszczenia należy dokładnie przetrzeć wszystkie powierzchnie, włącznie ze statywami i pipetorami, 0,5% roztworem podchlorynu sodu, a następnie 70% roztworem etanolu. Dostępny w handlu płynny wybielacz przeznaczony do zastosowań domowych zazwyczaj zawiera podchloryn sodu o stężeniu 5,25%. Rozcieńczenie domowego wybielacza w stosunku 1:10 daje 0,5% roztwór podchlorynu sodu. Doc. Rev. 1.0 22

CZĘŚĆ A: Do stosowania z próbkami tkanek cobas EGFR Mutation Test Konfigurowanie aparatu Szczegółowe wskazówki dotyczące konfigurowania analizatora cobas z 480 zamieszczono w Instrukcji obsługi analizatora cobas z 480. Konfiguracja zlecenia testu Szczegółowe instrukcje dotyczące etapów przebiegu EGFR zamieszczono w Instrukcji obsługi analizatora cobas 4800 System cobas z 480 oraz podręczniku operatora oprogramowania cobas EGFR Mutation Test. Wygenerować mapę płytki z pozycjami wszystkich próbek i kontroli do przebiegu. Kontrola mutacji jest umieszczona w pozycjach A01 A03 płytki. Kontrola ujemna jest umieszczona w pozycjach B01 B03 płytki. Następnie rozcieńczone próbki są dodawane w zestawach po 3 kolumny począwszy od C01 C03 do H09 H12 jak przedstawia to Ryc. 2. Doc. Rev. 1.0 23

CZĘŚĆ A: Do stosowania z próbkami tkanek cobas EGFR Mutation Test Ryc. 2 Układ płytki dla testu cobas EGFR Mutation Test Rząd/k olumna 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 A B C D E F G H MC NEG S1 S2 S3 S4 S5 S6 MC NEG S1 S2 S3 S4 S5 S6 MC NEG S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14 S15 S16 S17 S18 S19 S20 S21 S22 S15 S16 S17 S18 S19 S20 S21 S22 S15 S16 S17 S18 S19 S20 S21 S22 S23 S24 S25 S26 S27 S28 S29 S30 S23 S24 S25 S26 S27 S28 S29 S30 S23 S24 S25 S26 S27 S28 S29 S30 Gdzie: MC = kontrola mutacji, NEG = kontrola ujemna, S# = identyfikator próbki, a MMX-# odpowiada odczynnikowi Master Mix 1, 2 lub 3. Uwaga: Każda próbka musi rozciągać się przez trzy kolejne kolumny w jednym rzędzie, aby możliwe było utworzenie wyniku. Uwaga: Odczynnik roboczy Master Mix 1 musi być umieszczony w kolumnie 01, 04, 07 i 10 na płytce. Odczynnik roboczy Master Mix 2 musi być umieszczony w kolumnie 02, 05, 08 i 11 na płytce. Odczynnik roboczy Master Mix 3 musi być umieszczony w kolumnie 03, 06, 09 i 12 na płytce. Uwaga: Na jednej płytce można umieścić do 30 próbek. Jeżeli do przetworzenia wszystkich próbek na płytce potrzebny jest więcej niż jeden zestaw odczynnika, wszystkie zestawy muszą pochodzić z tej samej serii. Konfigurowanie aparatu 4. Włączyć analizator cobas z 480. Zanim będzie można rozpocząć przebieg, instrument będzie przez kilka minut rozgrzewał się. 5. Włączyć jednostkę sterującą. Jednostka sterująca automatycznie zaloguje się do systemu Windows. 6. Kliknąć dwukrotnie ikonę oprogramowania cobas 4800 i zalogować się, aby przeprowadzić przebieg używając określonego identyfikatora użytkownika laboratorium i hasła. 7. Kliknąć w menu ikonę New Run. 8. Zostanie wyświetlone okno wyskakujące Select Test. Wybrać EGFR Tissue Test i kliknąć przycisk OK. 9. Po wyświetleniu ekranu Work Place wpisać lub zeskanować kod kreskowy MWP w polu Microwell Plate ID. Zeskanować w odpowiednich polach kody kreskowe identyfikatora zestawu do izolacji DNA oraz identyfikator zestawu cobas EGFR Mutation Test Reagent. W polu Sample wprowadzić 24 dla pierwszego i 6 dla drugiego zestawu (jeżeli planowany jest przebieg dla pełnej płytki 30 próbek). Jeżeli Doc. Rev. 1.0 24