cobas KRAS Mutation Test KRAS

Transkrypt

1 cobas KRAS Mutation Test DO STOSOWANIA W DIAGNOSTYCE IN VITRO. cobas DNA Sample Preparation Kit DNA SP 24 Tests P/N: cobas KRAS Mutation Test KRAS 24 Tests P/N: Zakup niniejszego produktu umożliwi nabywcy zastosowanie go do amplifikacji i detekcji sekwencji kwasu nukleinowego z zastosowaniem reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) oraz związanych z nią procesów w ramach diagnostyki in vitro z użyciem materiału ludzkiego. Wraz z nabyciem niniejszego produktu nabywca nie otrzymuje żadnego patentu ogólnego ani innej licencji, oprócz prawa do określonego, szczególnego zastosowania produktu. ZASTOSOWANIE Test cobas KRAS Mutation Test, przeznaczony do stosowania z systemem cobas 4800, to test oparty na reakcji real-time PCR, przeznaczony do identyfikacji mutacji w kodonach 12, 13 i 61 genu KRAS w DNA uzyskanym z utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie próbek ludzkiej tkanki raka jelita grubego oraz niedrobnokomórkowego raka płuc. PODSUMOWANIE ORAZ OPIS TESTU Białko KRAS: Białko KRAS należy do nadrodziny małych białek G. Białko KRAS działa jak przełącznik regulowany przez GDP/GTP, przekazujący sygnały zewnątrzkomórkowe, które wpływają na proliferację komórkową, apoptozę i przebudowę cytoszkieletu aktynowego. Mutacje w aminokwasach numer 12, 13 oraz 61, występujące w wielu rodzajach nowotworów u ludzi, w tym w raku jelita grubego (ang. colorectal cancer, CRC) oraz niedrobnokomórkowym raku płuc (ang. non-small cell lung cancer, NSCLC), powodują zablokowanie enzymu w aktywowanej formie związanej z GTP, co powoduje stałe przekazywanie sygnału i stymulację procesu onkogennego 1. Rak jelita grubego (CRC): Mutacje w genie KRAS występują w 24 43% przypadków nowotworów jelita grubego 2-3. Chociaż zidentyfikowano ponad 3000 mutacji punktowych w genie KRAS, większość z nich występuje w kodonie 12 lub 13 (ok. 82% w kodonie 12 oraz ok. 17% w kodonie 13); mutacje genu KRAS występujące w innych kodonach (np. kodonie 61) są rzadsze (1 4% mutacji). Chociaż mutacje w kodonie 61 nie są częste, wykazano, że podobnie jak mutacje w kodonie 12 i 13 również skutkują konstytutywną aktywacją białka KRAS 4, a opublikowane dane wskazują, że wystąpienie mutacji w kodonie 61 pozwala przewidzieć brak odpowiedzi na leczenie z użyciem przeciwciał monoklonalnych anty-egfr 5-6. Cetuximab oraz panitumumab to przeciwciała monoklonalne skierowane przeciwko receptorowi naskórkowego czynnika wzrostu (ang. Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR) i zatwierdzone do stosowania u pacjentów z dającym przerzuty rakiem jelita grubego. Mimo że od 50% do 80% guzów jelita grubego cechuje się nadekspresją genu EGFR, ekspresja białka EGFR i amplifikacja kodującego go genu mają ograniczoną wartość prognostyczną w ocenie prawdopodobieństwa odpowiedzi na leczenie cetuximabem lub panitumumabem 7. Istnieją jednak silne dowody na to, że mutacja w genie KRAS koreluje z brakiem odpowiedzi na stosowanie przeciwciał skierowanych przeciwko białku EGFR u pacjentów z dającym przerzuty rakiem jelita grubego oraz że stosowanie przeciwciał przeciwko białku EGFR może być szkodliwe dla tych pacjentów 8-9. Dowody popierające te ustalenia pochodzą z: retrospektywnych analiz badań bez grupy kontrolnej 10-11, retrospektywnych analiz badań randomizowanych 12-13, prospektywnych badań randomizowanych 14. Wyniki tych badań przyczyniły się do sformułowania przez główne organizacje onkologiczne w Stanach Zjednoczonych (ASCO, NCCN) i Europie (ESMO) 17 zalecenia wykonywania testów wykrywających mutacje w genie KRAS u pacjentów, którzy mają zostać poddani leczeniu z użyciem przeciwciał anty-egfr. Co więcej, organy regulacyjne w Stanach Zjednoczonych i Europie ograniczyły stosowanie tej metody leczenia wyłącznie do pacjentów z guzami charakteryzującymi się naturalnie występującą sekwencją genu KRAS Niedrobnokomórkowy rak płuc (NSCLC): W przypadku NSCLC zidentyfikowano wiele powtarzających się nieprawidłowości molekularnych. Mutacje punktowe w genie KRAS stwierdzono w 10 30% przypadków zaawansowanego raka niedrobnokomórkowego płuc, głównie w gruczolakorakach 20. Najczęściej mutacje somatyczne występują w kodonach 12, 13 i 61 genu KRAS/RAS i powodują nagromadzenie w komórce aktywnego białka KRAS/RAS, co skutkuje aktywacją ścieżek sygnałowych biorących udział w transformacji nowotworowej. Rozdział Informacje na temat wersji dokumentu znajduje się na końcu tego dokumentu PL 1 Doc Rev. 3.0

2 W opublikowanym piśmiennictwie można znaleźć informacje, że w przypadku pacjentów z zaawansowanym NSCLC z mutacją w genie KRAS rokowanie jest gorsze 21, a chemioterapia uzupełniająca 22 lub leczenie z wykorzystaniem terapii TKI skierowanej przeciwko białku EGFR może nie przynieść korzyści 23. Stwierdzono również, że u pacjentów z guzami obarczonymi mutacjami w genie EGFR nie występują mutacje w genie KRAS i na odwrót 24. W związku z tym pacjenci ci stanowią podgrupę chorych z NSCLC z niespełnionym istotnym zapotrzebowaniem klinicznym ze względu na mniejszą liczbę dostępnych opcji leczenia w porównaniu z pacjentami, u których w tkankach guza nie stwierdzono mutacji w genie KRAS. Test cobas KRAS Mutation Test Test cobas KRAS Mutation Test to test oparty na reakcji PCR, przeznaczony do wykrywania obecności mutacji somatycznych w kodonach 12, 13 i 61 protoonkogenu KRAS i umożliwiający dzięki temu identyfikację pacjentów z zaawansowanym rakiem jelita grubego (CRC), w przypadku których leczenie z użyciem przeciwciał monoklonalnych anty-egfr może nie być korzystne, lub pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuc (NSCLC), którzy mogą nie odnieść korzyści ze stosowania chemioterapii uzupełniającej lub leczenia erlotynibem. ZASADY PROCEDURY cobas KRAS Mutation Test oparty jest na dwóch głównych procesach: (1) ręcznym przygotowaniu próbki w celu pozyskania genomowego DNA z utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie próbek tkanki (ang. formalin-fixed, paraffin-embedded tissue, FFPET) oraz (2) amplifikacji w reakcji PCR docelowego DNA z użyciem par primerów komplementarnych oraz dwóch znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym sond oligonukleotydowych. Jedna z sond przeznaczona jest do detekcji sekwencji kodonu 12/13 genu KRAS w eksonie 2, natomiast druga sonda wykrywa sekwencję kodonu 61 genu KRAS w eksonie 3 genu KRAS. Detekcję mutacji uzyskuje się w toku analizy krzywej topnienia z użyciem analizatora cobas z 480. Do każdego przebiegu testowego włącza się kontrolę mutacji, kontrolę ujemną oraz kalibrator w celu potwierdzenia ważności przebiegu. Przygotowanie próbki Przetwarzanie próbek FFPET oraz izolowanie genomowego DNA wykonuje się za pomocą zestawu do przygotowywania próbek cobas DNA Sample Preparation Kit według ogólnej metody ręcznego przygotowywania próbek, opartej na wiązaniu kwasu nukleinowego przez włókna szklane. Pozbawiony parafiny skrawek próbki FFPET o grubości 5 µm zostaje poddany lizie przez inkubację w podwyższonej temperaturze z proteazą i chaotropowym buforem do lizy/wiążącym, który uwalnia kwasy nukleinowe i chroni uwolniony genomowy DNA przed DNazami. W dalszej kolejności do mieszaniny, w której dokonano lizy, dodaje się izopropanol, po czym mieszaninę wiruje się i przepuszcza przez kolumnę z wkładem filtrującym, zawierającym włókna szklane. W trakcie wirowania genomowy DNA ulega związaniu na powierzchni włókien szklanych filtra. Substancje niezwiązane, takie jak sole, białka i inne zanieczyszczenia pochodzenia komórkowego, zostają usunięte w wyniku wirowania. Zaadsorbowane kwasy nukleinowe są przemywane i poddane elucji roztworem wodnym. Ilość genomowego DNA określa się spektrofotometrycznie i dostosowuje do ustalonego stężenia dodawanego do mieszaniny do amplifikacji/detekcji. Następnie docelowy DNA amplifikuje się i poddaje detekcji w analizatorze cobas z 480 z użyciem odczynników do amplifikacji i detekcji, dostarczanych wraz z zestawem cobas KRAS Mutation Test. Amplifikacja PCR Wybór sekwencji docelowej W teście cobas KRAS Mutation Test stosowane są primery określające w ludzkim genomowym DNA fragment sekwencji eksonu 2 składający się z 85 par zasad, obejmujący kodon 12 i 13 genu KRAS, oraz fragment o długości 75 par zasad w eksonie 3, obejmujący kodon 61 genu KRAS. Amplifikacja zachodzi jedynie w regionach genu kodującego KRAS między primerami; całość genu KRAS nie ulega amplifikacji. Amplifikacja sekwencji docelowej Do amplifikacji sekwencji docelowej wykorzystuje się polimerazę DNA Z05 pochodzącą z gatunku Thermus. Mieszanina reakcyjna PCR jest najpierw podgrzewana w celu zdenaturowania genomowego DNA oraz odsłonięcia sekwencji docelowych primerów. W miarę ochładzania się mieszaniny primery sensowne oraz antysensowne hybrydyzują z docelowymi sekwencjami DNA. Polimeraza DNA Z05 w obecności jonu dwuwartościowego metalu oraz nadmiaru dezoksyrybonukleotydów (dntp) wydłuża każdy przyłączony w wyniku hybrydyzacji primer i w ten sposób następuje synteza drugiej nici DNA. Proces ten kończy pierwszy cykl reakcji PCR, dostarczając dwuniciowej kopii DNA, zawierającej regiony genu kodującego KRAS z docelowymi sekwencjami o długości 85 i 75 par zasad. Proces ten powtarza się wielokrotnie, przy czym w każdym z cykli ilość zwielokrotnionego DNA (amplikonu) ulega podwojeniu. Amplifikacja zachodzi jedynie w regionach genu kodującego KRAS między parami primerów; całość genu KRAS nie ulega amplifikacji PL 2 Doc Rev. 3.0

3 Zautomatyzowana detekcja mutacji w czasie rzeczywistym Analizator cobas z 480 umożliwia wykonywanie w czasie rzeczywistym pomiarów poziomu fluorescencji generowanej przez określone produkty reakcji PCR. Po procesie amplifikacji każdy amplikon wytworzony z użyciem testu cobas KRAS Mutation Test jest poddawany programowi topnienia, w którym temperatura jest podnoszona stopniowo od 40 C do 95 C (TaqMelt). W niskich temperaturach sonda swoista do naturalnie występującej sekwencji genu wiąże się zarówno do amplikonu o naturalnie występującej sekwencji, jak i zawierającego mutację. W stanie związanym fluoresceina znajdująca się na końcu 5' sondy, będąca barwnikiem reporterowym, jest zlokalizowana wystarczająco daleko od umieszczonego na końcu 3' barwnika wygaszającego, co powoduje, że barwnik fluorescencyjny emituje światło o określonej długości fali. Wraz ze wzrostem temperatury sonda oddysocjowuje od amplikonu, umożliwiając barwnikowi wygaszającemu kontakt z barwnikiem fluorescencyjnym, co powoduje obniżenie poziomu mierzalnej fluorescencji. Amplikony z idealnym dopasowaniem do sondy (naturalnie występująca sekwencja) ulegają topnieniu w temperaturze wyższej niż amplikony z jednym lub większą liczbą niedopasowań (sekwencja z mutacją). Na każdym etapie przyrostu temperatury mierzony jest poziom fluorescencji, a następnie obliczana temperatura topnienia. Obecność sekwencji genu KRAS z mutacją w kodonach 12 i 13 eksonu 2 oraz w kodonie 61 eksonu 3 można wykryć, gdy temperatury topnienia mieszczą się w określonych przedziałach. Aby uniknąć wykrycia w kodonie 12 i 13 mutacji cichych (niewywołujących zmian sekwencji aminokwasów), wprowadzono zmodyfikowaną zasadę, pełniącą rolę zasady uniwersalnej, która jest odpowiedzialna za wygenerowanie temperatury topnienia mieszczącej się w zakresie temperatur dla sekwencji bez mutacji. Amplifikacja wybiórcza Amplifikację wybiórczą docelowego kwasu nukleinowego z próbki podczas przeprowadzania testu cobas KRAS Mutation Test uzyskuje się dzięki zastosowaniu enzymu AmpErase (uracylo-n-glikozylazy) i trójfosforanu dezoksyurydyny (dutp) 25. Enzym AmpErase rozpoznaje i katalizuje niszczenie nici DNA zawierających dezoksyurydynę, lecz nie łańcuchów DNA zawierających tymidynę. Dezoksyurydyna nie wchodzi w skład występującego w naturze DNA, jest natomiast zawsze obecna w amplikonie wskutek użycia dutp zamiast trójfosforanu tymidyny jako jednego z trójfosforanów nukleotydów w odczynnikach Reaction Mix; dlatego wyłącznie amplikon zawiera dezoksyurydynę. Dezoksyurydyna powoduje wrażliwość zanieczyszczającego amplikonu na rozkład przez enzym AmpErase przed amplifikacją docelowego DNA. Zawarty w odczynniku Reaction Mix enzym AmpErase katalizuje rozkład DNA zawierającego dezoksyurydynę w miejscu reszt dezoksyurydynowych przez otwarcie łańcucha dezoksyrybozy w pozycji C1. Podczas ogrzewania w pierwszym cyklu termicznym przy wartościach ph oznaczających środowisko zasadowe łańcuch amplikonu DNA pęka w miejscu, w którym znajduje się dezoksyurydyna, w ten sposób wykluczając dalszą amplifikację DNA. Enzym AmpErase jest nieczynny w temperaturach powyżej 55 C, tj. w czasie trwania całego cyklu termicznego, dlatego też nie niszczy on amplikonu docelowego. Wykazano, że cobas KRAS Mutation Test dezaktywuje na każdą reakcję PCR co najmniej 10 3 kopii zawierającego dezoksyurydynę amplikonu zmutowanej sekwencji genu KRAS. ODCZYNNIKI cobas DNA Sample Preparation Kit Zestaw do przygotowywania próbek DNA cobas (P/N: ) DNA TLB (DNA Bufor do lizy tkanek) Bufor Tris-HCl Chlorek potasu 0,04% EDTA 0,1% Tritonu X-100 0,09% azydku sodu PK (Proteinaza K) Proteinaza K (liofilizowana) Xn Proteinaza K DNA SP 24 testy 1 x 10 ml 1 x 100 mg Produkt szkodliwy PL 3 Doc Rev. 3.0

4 DNA PBB (DNA Bufor wiążący parafinę) Bufor Tris-HCl 49,6% chlorowodorku guanidyny 0,05% mocznika 17,3% Tritonu X-100 Xn 49,6% (udział wagowy) chlorowodorku guanidyny 1 x 10 ml Produkt szkodliwy WB I (DNA Bufor płuczący I) Bufor Tris-HCl 64% chlorowodorku guanidyny Xn 64% (udział wagowy) chlorowodorku guanidyny 1 x 25 ml Produkt szkodliwy WB II (DNA Bufor płuczący II) Bufor Tris-HCl Chlorek sodu DNA EB (DNA bufor do elucji) Bufor Tris-HCl 0,09% azydku sodu FT (Probówki z filtrem i z zatyczkami) CT (Probówki zbiorcze) cobas KRAS Mutation Test (P/N: ) KRAS MIX (Mieszanina reakcyjna KRAS) Bufor Tricine Octan potasu Wodorotlenek potasu Glicerol 4,76% dimetylosulfotlenku 0,1% substancji konserwującej ProClin 300 < 0,9% dntp < 0,1% polimerazy DNA Z05 (bakteryjnej) < 0,1% enzymu AmpErase (uracylo-n-glikozylazy) (bakteryjnej) MGAC (Octan magnezu) Octan magnezu 0,09% azydku sodu KRAS 12/13 OM (Odczynnik KRAS Oligo Mix kodon 12/13) Bufor Tris-HCl EDTA Poli-rA RNA (syntetyczny) 0,1% substancji konserwującej ProClin 300 < 0,01% primerów sensownych i antysensownych KRAS < 0,01% sondy KRAS znakowanej barwnikiem fluorescencyjnym KRAS 1 x 12,5 ml 1 x 6 ml 1 x 25 sztuk 3 x 25 sztuk 24 testy 4 x 0,3 ml 4 x 0,2 ml 2 x 0,3 ml PL 4 Doc Rev. 3.0

5 KRAS 61 OM (Odczynnik KRAS Oligo Mix kodon 61) Bufor Tris-HCl EDTA Poli-rA RNA (syntetyczny) 0,1% substancji konserwującej ProClin 300 < 0,01% primerów sensownych i antysensownych KRAS < 0,01% sondy KRAS znakowanej barwnikiem fluorescencyjnym KRAS MC (Kontrola mutacji genu KRAS) Bufor Tris-HCl EDTA Poli-rA RNA (syntetyczny) 0,05% azydku sodu < 0,001% plazmidowego DNA (bakteryjnego) zawierającego sekwencję eksonu 2 i 3 genu KRAS < 0,001% DNA z naturalnie występującą sekwencją genu KRAS (z hodowli komórkowej) KRAS CAL (Kalibrator KRAS) Bufor Tris-HCl EDTA Poli-rA RNA (syntetyczny) 0,05% azydku sodu < 0,001% DNA z naturalnie występującą sekwencją genu KRAS (z hodowli komórkowej) DNA SD (DNA Rozcieńczalnik próbki) Bufor Tris-HCl 0,09% azydku sodu 2 x 0,3 ml 4 x 0,1 ml 4 x 0,1 ml 2 x 3,5 ml OSTRZEŻENIA I ŚRODKI OSTROŻNOŚCI A. DO STOSOWANIA W DIAGNOSTYCE IN VITRO. B. Niniejszy test jest przeznaczony do badania utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie próbek tkanki raka jelita grubego oraz niedrobnokomórkowego raka płuc. C. Nie należy pipetować za pomocą ust. D. Nie wolno jeść, pić ani palić w obszarach roboczych laboratorium. E. Należy unikać zakażenia odczynników: bakteryjnego i przez DNA. F. Należy wyrzucić wszystkie niezużyte odczynniki oraz zlewki, postępując zgodnie z przepisami krajowymi, federalnymi, stanowymi i lokalnymi. G. Nie wolno używać zestawów po upływie ich dat przydatności. H. Nie należy poddawać pulowaniu odczynników pochodzących z różnych zestawów lub serii. I. Aby zapobiec kontaminacji próbek i odczynników, należy nakładać rękawice i zmieniać je przed wznowieniem pracy z tymi materiałami. J. Aby zapobiec kontaminacji roboczego odczynnika Master Mix (roboczego odczynnika MMX) próbkami DNA, należy przeprowadzać amplifikację i detekcję w miejscu oddzielonym od obszaru wykonywania izolacji DNA. Przed przygotowaniem roboczego MMX należy dokładnie oczyścić obszar roboczy amplifikacji i detekcji. W celu właściwego oczyszczenia należy dokładnie przetrzeć wszystkie powierzchnie, włącznie ze statywami i pipetorami, 0,5% roztworem podchlorynu sodu*, a następnie 70% roztworem etanolu. K. Odczynniki DNA PBB i WB I zawierają chlorowodorek guanidyny. Jeśli płyn zawierający wspomniany bufor ulegnie rozlaniu, do czyszczenia należy używać odpowiedniego detergentu laboratoryjnego i wody. W przypadku rozlania płynu zawierającego potencjalne czynniki zakaźne do czyszczenia należy używać najpierw detergentu laboratoryjnego i wody, a następnie 0,5% roztworu podchlorynu sodu. W razie rozlania płynu na powierzchni analizatora cobas z 480 należy postępować zgodnie ze wskazówkami zamieszczonymi w instrukcji obsługi analizatora cobas z PL 5 Doc Rev. 3.0

6 * Dostępne na rynku typowe płyny wybielające do zastosowania w gospodarstwach domowych zawierają podchloryn sodu o stężeniu 5,25%. Rozcieńczenie domowego wybielacza w stosunku 1:10 pozwoli uzyskać 0,5-procentowy roztwór podchlorynu sodu. L. Z próbkami należy obchodzić się tak jak z materiałem zakaźnym, stosując laboratoryjne procedury bezpieczeństwa, takie jak określone w dokumentach: Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 26 oraz CLSI Document M29-A3. 27 M. Odczynnik DNA PBB zawiera Triton X-100, środek drażniący błony śluzowe. Należy unikać kontaktu tych odczynników z oczami, skórą i błonami śluzowymi. N. Odczynniki DNA TLB, DNA EB, MGAC, KRAS MC, KRAS CAL oraz DNA SD zawierają azydek sodu. Azydek sodu może reagować z instalacjami wodno-kanalizacyjnymi wykonanymi z ołowiu lub miedzi, tworząc silnie wybuchowe azydki metali. Usuwając roztwory zawierające azydek sodu do zlewów laboratoryjnych, należy spłukać rury dużą ilością zimnej wody, aby zapobiec nagromadzeniu azydków. O. Ksylen to niebezpieczny związek chemiczny i podczas używania go należy korzystać z wyciągu chroniącego przed chemikaliami. Należy go wyrzucać wraz z odpadami chemicznymi zgodnie z przepisami lokalnymi, stanowymi i federalnymi. P. Podczas pracy z jakimikolwiek odczynnikami należy używać osłon na oczy oraz fartuchów laboratoryjnych i rękawic jednorazowych. Należy unikać kontaktu wymienionych materiałów ze skórą, oczami i błonami śluzowymi. Jeżeli dojdzie do kontaktu, trzeba natychmiast spłukać dużą ilością wody. Jeżeli nie zostaną podjęte odpowiednie środki, może dojść do oparzeń. W razie rozlania należy przed wytarciem rozcieńczyć wodą. Q. Wszystkie przedmioty jednorazowego użytku są przeznaczone do jednokrotnego użycia. Nie należy ich używać powtórnie. R. Nie wolno używać przedmiotów jednorazowego użytku po upływie daty ważności. S. Do czyszczenia analizatora cobas z 480 nie wolno używać roztworu podchlorynu sodu (wybielacza). Czyszczenie analizatora cobas z 480 należy przeprowadzać zgodnie z procedurami opisanymi w instrukcji obsługi analizatora cobas z 480. T. Dodatkowe ostrzeżenia, środki ostrożności i procedury mające na celu zmniejszenie ryzyka kontaminacji analizatora cobas z 480 zamieszczono w instrukcji obsługi analizatora cobas z 480. U. Zaleca się używanie jałowych, jednorazowych pipet oraz końcówek pipetorów wolnych od DNaz. WYMAGANIA DOTYCZĄCE PRZECHOWYWANIA I UŻYTKOWANIA A. Odczynniki DNA TLB, DNA PBB, WB I, WB II, DNA EB, PK, FT oraz CT przechowywać w temperaturze od 15 C do 30 C. Po otwarciu odczynniki DNA TLB, DNA PBB, WB I, WB II, DNA EB oraz PK zachowują stabilność w przypadku maksymalnie 8-krotnego użycia, przez 90 dni lub do momentu upływu daty ważności (w zależności od tego, który termin wypada wcześniej). B. Po dodaniu jałowej wody wolnej od nukleaz do odczynnika PK niezużyty, rozpuszczony odczynnik PK należy przechowywać w porcjach o równych objętościach po 450 µl w temperaturze 20 C. Po rozpuszczeniu odczynnik PK trzeba zużyć w ciągu 90 dni albo do daty ważności, zależnie od tego, który termin wypada wcześniej. C. Po dodaniu etanolu bezwodnego odczynniki WB I i WB II należy przechowywać w temperaturze od 15 C do 30 C. Wymienione roztwory robocze zachowują stabilność przez 90 dni albo do daty ważności, w zależności od tego, który termin wypada wcześniej. D. Odczynniki KRAS MIX, MGAC, KRAS 12/13 OM, KRAS 61 OM, KRAS MC, KRAS CAL oraz DNA SD należy przechowywać w temperaturze od 15 C do 25 C. Po otwarciu odczynniki te zachowują stabilność w przypadku maksymalnie 4-krotnego użycia, przez 60 dni albo do daty ważności, w zależności od tego, który termin wypada wcześniej. E. Przed użyciem wszystkie odczynniki należy pozostawić do rozmrożenia na co najmniej 1 godzinę w temperaturze od 15 C do 30 C. Po rozmrożeniu odczynniki należy użyć w ciągu 1 godziny, a niezużyty odczynnik w ciągu 1 godziny zwrócić do przechowywania w temperaturze od 15 C do 25 C. Po otwarciu każda fiolka z odczynnikiem z wyjątkiem odczynnika DNA SD może zostać wykorzystana do wykonania dozowania maksymalnie 4 porcji w ciągu 60 dni lub do upływu daty ważności (zależnie od tego, który termin jest wcześniejszy). F. Odczynniki KRAS 12/13 OM, KRAS 61 OM i odczynnik roboczy MMX (przygotowany przez dodanie odczynników KRAS 12/13 OM lub KRAS 61 OM oraz MGAC do odczynnika KRAS MIX) powinny być chronione przed długotrwałą ekspozycją na światło PL 6 Doc Rev. 3.0

7 G. Przygotowany odczynnik roboczy MMX należy przechowywać w zaciemnionym miejscu w temperaturze od 2 C do 8 C. Przygotowane próbki i kontrole należy dodać do roboczego odczynnika MMX w ciągu 1 godziny od jego przygotowania. H. Próbki poddane obróbce (wyizolowany DNA) są stabilne przez 24 godziny w temperaturze od 20 C do 30 C, przez 14 dni w temperaturze od 2 C do 8 C lub przez 60 dni w temperaturze od 15 C do 25 C. Poddane obróbce próbki zachowują stabilność również w temperaturze od 15 C do 25 C po przebyciu 4 cykli zamrażania i rozmrażania. I. Amplifikację należy rozpocząć w ciągu 1 godziny od chwili dodania przetworzonych próbek i kontroli do roboczego odczynnika MMX (przygotowanego przez dodanie odczynnika KRAS 12/13 OM lub KRAS 61 OM oraz MGAC do odczynnika KRAS MIX). DOSTARCZONE MATERIAŁY A. cobas DNA Sample Preparation Kit DNA SP 24 testy Zestaw do przygotowywania próbek DNA cobas (P/N: ) DNA TLB (DNA Bufor do lizy tkanek) PK (Proteinaza K) DNA PBB (DNA Bufor wiążący parafinę) WB I (DNA Bufor płuczący I) WB II (DNA Bufor płuczący II) DNA EB (DNA Bufor do elucji) FT (Probówki z filtrem i zatyczkami) CT (Probówki zbiorcze) B. cobas KRAS Mutation Test KRAS 24 testy (P/N: ) KRAS MIX (Mieszanina reakcyjna) (zatyczka z bezbarwnym przyciskiem) MGAC (Octan magnezu) (zatyczka z żółtym przyciskiem) KRAS 12/13 OM (Odczynnik KRAS Oligo Mix kodon 12/13) (zatyczka z białym przyciskiem) KRAS 61 OM (Odczynnik KRAS Oligo Mix kodon 61) (zatyczka ze złotym przyciskiem) KRAS MC (Kontrola mutacji KRAS) (zatyczka z czerwonym przyciskiem) KRAS CAL (Kalibrator KRAS) (zatyczka z fioletowym przyciskiem) DNA SD (DNA Rozcieńczalnik próbki) PL 7 Doc Rev. 3.0

8 MATERIAŁY WYMAGANE, LECZ NIEDOSTARCZANE Ksylen (Sigma, nr kat , lub Fisher Scientific, nr kat. X5-4) Etanol bezwodny (Sigma, nr kat. E7023 lub Fisher Scientific, nr kat. BP ) Izopropanol (Sigma, nr kat , lub Fisher Scientific, nr kat. A451-1) Jałowa woda niezawierająca nukleazy (Applied Biosystems, woda o stopniu czystości odpowiednim do PCR, nr kat. AM9937, lub Thermo Scientific, woda o stopniu czystości odpowiednim do zastosowań w biologii molekularnej, nr kat. SH ) Jałowe, jednorazowe pipety serologiczne: 5 ml oraz 25 ml Płytka z mikrodołkami (płytka AD) systemu cobas 4800 i folia uszczelniająca (Roche P/N ) Aplikator folii uszczelniającej cobas 4800 (Roche P/N ) Pipetory zmiennopojemnościowe* (pojemność 10 µl, 20 µl, 200 µl i 1000 µl) z końcówkami z barierą aerozolową lub dodatniego wypierania, wolnymi od DNaz Rękojeść pomocnicza do pipety (Drummond P/N: lub jej odpowiednik) Mikrowirówka stojąca laboratoryjna, umożliwiająca wirowanie z przyspieszeniem 8000 x g oraz od do x g (Eppendorf 5417C lub jej odpowiednik)** Dwa (2) suche bloki grzejne, umożliwiające ogrzewanie probówek do mikrowirówki do temperatury 56 C i 90 C** Jałowe probówki do mikrowirówki Safe-Lock o pojemności 1,5 ml, niezawierające RNazy/DNazy, odpowiednie do PCR (Eppendorf, nr kat ) Spektrofotometr Nanodrop UV-Vis (Thermo Scientific ND-1000 lub ND-2000)** Mieszadło wibracyjne** Statywy do probówek do mikrowirówki Rękawice jednorazowe bezpudrowe Kalibrowane termometry do suchego bloku grzejnego** Łaźnia wodna**, umożliwiająca utrzymywanie temperatury 37 C Skalpel z jednostronnym ostrzem lub podobne narzędzie Zamrażarka umożliwiająca przechowywanie w temperaturze od 15 C do 25 C * Pipetory powinny być konserwowane zgodnie z instrukcją producenta, a ich dokładność powinna mieścić się w granicach 3% podanej objętości. W sytuacjach określonych w dokumentacji należy używać wolnych od DNaz końcówek z barierą aerozolową lub dodatniego wypierania, aby zapobiec degradacji próbki i kontaminacji krzyżowej. ** Całe wyposażenie powinno być odpowiednio konserwowane zgodnie z instrukcjami producenta Przyrządy i oprogramowanie Analizator cobas z 480 Jednostka sterująca systemu cobas 4800 SR2 z obrazem systemu Windows XP Oprogramowanie systemu cobas 4800 SR2 w wersji 2.0 lub nowsze Pakiet oprogramowania do analizy genu KRAS w wersji 1.0 lub nowszy Zewnętrzny czytnik kodów kreskowych, podłączany do portu USB Drukarka PL 8 Doc Rev. 3.0

9 POBIERANIE, TRANSPORT I PRZECHOWYWANIE PRÓBEK Ze wszystkimi próbkami należy obchodzić się jak z materiałem potencjalnie zakaźnym. A. Pobieranie próbek Próbki FFPET raka jelita grubego oraz niedrobnokomórkowego raka płuc zostały zatwierdzone do wykorzystania w teście cobas KRAS Mutation Test. B. Transport próbek Próbki FFPET można transportować w temperaturze od 15 C do 30 C. Próbki FFPET muszą być transportowane zgodnie z krajowymi, federalnymi, stanowymi i lokalnymi przepisami dotyczącymi transportu czynników chorobotwórczych. 28 C. Przechowywanie próbek Próbki FFPET można przechowywać w temperaturze od 15 C do 30 C przez maksymalnie 12 miesięcy od daty pobrania tkanki. Osadzone na szkiełkach skrawki o grubości 5 mikronów można przechowywać w temperaturze od 15 C do 30 C przez maksymalnie 60 dni. INSTRUKCJA UŻYTKOWANIA W teście cobas KRAS Mutation Test można wykorzystywać wyłącznie skrawki FFPET o grubości 5 µm, zawierające co najmniej 10% tkanki guza. Każdą próbkę zawierającą mniej niż 10% tkanki guza należy przed usunięciem parafiny przeciąć makroskopowo. Szczegółowe wskazówki dotyczące obsługi analizatora cobas z 480 zamieszczono w instrukcji obsługi analizatora cobas z 480. Suche bloki grzejne, umożliwiające ogrzewanie probówek do mikrowirówki, należy włączyć i nastawić na temperaturę 56 C i 90 C. Liczba testów w cyklu pracy Pojedynczy przebieg testowy może obejmować od 1 do 45 próbek (plus kontrole i kalibrator) w każdej płytce z 96 mikrodołkami. Do przeprowadzenia przebiegu testowego obejmującego więcej niż 24 próbki należy użyć kilku zestawów testu cobas KRAS Mutation Test z tej samej serii. cobas KRAS Mutation Test zawiera ilość odczynników wystarczającą do wykonania 8 przebiegów testowych po 3 próbki (plus kontrole i kalibrator), czyli maksymalnie na 24 próbki na zestaw. Przebieg pracy Wykonanie testu cobas KRAS Mutation Test obejmuje etap ręcznego przygotowywania próbek za pomocą zestawu cobas DNA Sample Preparation Kit, po którym następuje amplifikacja/detekcja w analizatorze cobas z 480 z zastosowaniem zestawu cobas KRAS Mutation Test. Przygotowanie odczynników 1. Rozpuścić proteinazę K (PK) przez dodanie do fiolki 4,5 ml jałowej wody wolnej od nukleaz (o stopniu czystości odpowiednim do reakcji PCR) za pomocą jałowej, jednorazowej pipety serologicznej o pojemności 5 ml. Wymieszać zawartość, odwracając fiolkę do góry dnem od 5 do 10 razy. Rozdzielić jednakowe objętości po 450 µl rozpuszczonego odczynnika PK do probówek do mikrowirówki Safe-Lock o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze 20 C. Jeśli proteinaza K została wcześniej rozpuszczona i zamrożona, należy przed deparafinizacją próbek rozmrozić ilość porcji wystarczającą do przetworzenia planowanej liczby próbek (do każdej próbki potrzebne jest 70 µl rozpuszczonego odczynnika PK). 2. Wszystkie roztwory przechowywane w temperaturze C powinny być klarowne. Jeżeli w którymkolwiek odczynniku obecny jest osad, ogrzać roztwór w łaźni wodnej o temperaturze 37 C aż do rozpuszczenia się osadu. Nie wolno używać odczynnika do czasu rozpuszczenia się całego osadu. 3. Przygotować roboczy odczynnik DNA bufor płuczący I (WB I) przez dodanie do butelki z odczynnikiem WB I 15 ml etanolu bezwodnego. Wymieszać zawartość, odwracając butelkę do góry dnem od 5 do 10 razy. Zapisać na butelce, że dodano do niej etanol i wpisać datę. Przechowywać roboczy odczynnik WB I w temperaturze od 15 C do 30 C PL 9 Doc Rev. 3.0

10 4. Przygotować roboczy odczynnik DNA bufor płuczący II (WB II) przez dodanie do butelki z odczynnikiem WB II 50 ml etanolu bezwodnego. Wymieszać zawartość, odwracając butelkę do góry dnem od 5 do 10 razy. Zapisać na butelce, że dodano do niej etanol i wpisać datę. Przechowywać roboczy odczynnik WB II w temperaturze od 15 C do 30 C. Pozbawienie parafiny skrawków FFPET osadzonych na szkiełkach Ksylen to niebezpieczny związek chemiczny. Wszystkie etapy pozbawiania próbek parafiny należy wykonywać pod wyciągiem chroniącym przed chemikaliami. Patrz rozdział Ostrzeżenia i środki ostrożności. A. Włożyć szkiełko z osadzonym skrawkiem FFPET o grubości 5 µm do pojemnika zawierającego ksylen w ilości wystarczającej do przykrycia tkanki; pozostawić do nasiąknięcia przez 5 minut. B. Przenieść szkiełko do pojemnika z etanolem bezwodnym w ilości wystarczającej do przykrycia tkanki; pozostawić do nasiąknięcia przez 5 minut. C. Wyjąć szkiełko z etanolu i odczekać, aż skrawek całkowicie wyschnie na powietrzu (od 5 do 10 minut). D. Jeśli próbka zawiera mniej niż 10% tkanki guza, należy wykonać procedurę makroskopowego przecięcia. E. Oznakować jedną probówkę do mikrowirówki Safe-Lock o pojemności 1,5 ml na każdą próbkę informacjami umożliwiającymi zidentyfikowanie próbki. F. Dodać 180 µl odczynnika DNA TLB do probówki do mikrowirówki Safe-Lock o pojemności 1,5 ml. G. Dodać 70 µl rozpuszczonego odczynnika PK do probówki Safe-Lock, zawierającej odczynnik DNA TLB. H. Zeskrobać tkankę ze szkiełka do probówki Safe-Lock. Zanurzyć tkankę w mieszaninie odczynników DNA TLB/PK. I. Kontynuować postępowanie od punktu A procedury izolacji DNA. Pozbawienie parafiny skrawków FFPET nieosadzonych na szkiełkach Ksylen to niebezpieczny związek chemiczny. Wszystkie etapy pozbawiania próbek parafiny należy wykonywać pod wyciągiem chroniącym przed chemikaliami. Patrz rozdział Ostrzeżenia i środki ostrożności. Jeśli próbka zawiera mniej niż 10% tkanki guza, należy osadzić skrawek na szkiełku w celu makroskopowego przecięcia, a następnie postępować zgodnie z procedurą omówioną w rozdziale Pozbawienie parafiny skrawków FFPET osadzonych na szkiełkach. A. Włożyć jeden skrawek FFPET o grubości 5 mikronów do probówki do mikrowirówki Safe-Lock o pojemności 1,5 ml, oznakowanej informacjami umożliwiającymi zidentyfikowanie każdej próbki. B. Dodać 500 µl ksylenu do probówki Safe-Lock, zawierającej skrawek FFPET. C. Mieszać dokładnie na mieszadle wibracyjnym przez 10 sekund. D. Odstawić probówkę na 5 minut w temperaturze od 15 C do 30 C. E. Dodać 500 µl etanolu bezwodnego i mieszać na mieszadle wibracyjnym przez 10 sekund. F. Odstawić probówkę na 5 minut w temperaturze od 15 C do 30 C. G. Wirować z przyspieszeniem od x g do x g przez 2 minuty. Usunąć supernatant bez uszkodzenia peletki. Wyrzucić supernatant do odpadów chemicznych. H. Dodać 1 ml etanolu bezwodnego i mieszać na mieszadle wibracyjnym przez 10 sekund. I. Wirować z przyspieszeniem od x g do x g przez 2 minuty. Usunąć supernatant bez uszkodzenia peletki. Wyrzucić supernatant do odpadów chemicznych. Jeśli peletka unosi się w pozostałym supernatancie, ponownie wirować przez 1 minutę z przyspieszeniem od x g do x g. Usunąć pozostały supernatant PL 10 Doc Rev. 3.0

11 J. Suszyć peletkę tkanki w otwartej probówce przez 10 minut w bloku grzejnym o temperaturze 56 C. Przed przejściem do następnego etapu należy upewnić się, że etanol został całkowicie odparowany i peletka jest sucha. W razie potrzeby suche peletki można przechowywać do 24 godzin w temperaturze od 2 C do 8 C. K. Wytworzyć z peletki tkanki ponownie zawiesinę w 180 µl odczynnika DNA bufor do lizy tkanek (DNA TLB). L. Dodać 70 µl rozpuszczonego odczynnika PK. M. Kontynuować postępowanie od punktu A procedury izolacji DNA. PRZYGOTOWANIE PRÓBKI Procedura izolacji DNA Jednocześnie z próbką(-ami) należy przeprowadzić przetwarzanie kontroli ujemnej. Przygotować kontrolę ujemną przez połączenie 180 µl odczynnika DNA Bufor do lizy tkanki (DNA TLB) oraz 70 µl roztworu PK w probówce do mikrowirówki Safe-Lock o pojemności 1,5 ml, oznakowanej napisem NEG CT. Przetwarzanie kontroli ujemnej powinno przebiegać według takiej samej procedury, jak przetwarzanie próbek. A. Mieszać na mieszadle wibracyjnym przez 30 sekund probówki zawierające mieszaninę próbka/dna TLB/PK i mieszaninę kontroli ujemnej (NEG CT). Tkanka musi być całkowicie zanurzona w mieszaninie DNA TLB/PK. B. Umieścić probówki w suchym bloku grzejnym o temperaturze 56 C i inkubować przez 60 minut. C. Mieszać probówki na mieszadle wibracyjnym przez 10 sekund. Tkanka musi być całkowicie zanurzona w mieszaninie DNA TLB/PK. D. Umieścić probówki w suchym bloku grzejnym o temperaturze 90 C i inkubować przez 60 minut. Podczas inkubacji należy przygotować wymaganą liczbę probówek z filtrem (FT) z zawiasowymi zatyczkami, umieszczając każdą FT na probówce zbiorczej (CT) i oznakowując zatyczkę każdej FT odpowiednimi informacjami identyfikującymi próbkę lub kontrolę. Na każdą próbkę będą potrzebne: 1 FT, 3 CT i 1 probówka do elucji (probówka do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml). Podczas inkubacji należy oznakować wymaganą liczbę probówek do elucji (probówek do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml) odpowiednimi informacjami identyfikującymi próbkę lub kontrolę. E. Pozostawić probówki do schłodzenia do temperatury od 15 C do 30 C. Po schłodzeniu odwirować pulsacyjnie, aby zgromadzić płyn z zatyczek. F. Dodać do każdej probówki po 200 µl odczynnika DNA PBB i wymieszać zawartość przez trzykrotne pobranie mieszaniny pipetą i jej wypuszczenie. G. Inkubować probówki w temperaturze od 15 C do 30 C przez 10 minut. H. Dodać do każdej probówki 100 µl izopropanolu i 3 razy wymieszać lizat przez nabieranie pipetą i wypuszczanie. I. Przenieść każdy lizat do właściwie oznakowanej jednostki FT/CT. J. Wirować jednostki FT/CT z przyspieszeniem 8000 x g przez 1 minutę. K. Umieścić każdą FT na nowej CT. Wyrzucić zawartość ze starej CT do odpadów chemicznych i usunąć w odpowiedni sposób zużytą CT. L. Dodać po 500 µl roboczego odczynnika WB I do każdej FT PL 11 Doc Rev. 3.0

12 Przygotowanie roboczego odczynnika WB I opisano w rozdziale Przygotowanie odczynników. M. Wirować jednostki FT/CT z przyspieszeniem 8000 x g przez 1 minutę. N. Wyrzucić zawartość każdej CT do odpadów chemicznych. Umieścić FT z powrotem na tej samej CT. O. Dodać po 500 µl roboczego odczynnika WB II do każdej FT. Przygotowanie roboczego odczynnika WB II opisano w rozdziale Przygotowanie odczynników. P. Wirować jednostki FT/CT z przyspieszeniem 8000 x g przez 1 minutę. Q. Umieścić każdą FT na nowej CT. Wyrzucić zawartość ze starej CT do odpadów chemicznych i usunąć w odpowiedni sposób zużytą CT. R. Wirować jednostki FT/CT z przyspieszeniem od do x g przez 1 minutę, aby osuszyć membrany filtrów. S. Umieścić każdą FT w probówce do elucji (probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml), oznakowanej uprzednio informacjami identyfikującymi próbkę lub kontrolę. Wyrzucić zawartość ze starej CT do odpadów chemicznych i usunąć w odpowiedni sposób zużytą CT. T. Dodać po 100 µl odczynnika DNA EB na środek membrany każdej FT bez dotykania membrany FT. U. Inkubować FT z probówką do elucji w temperaturze od 15 C do 30 C przez 5 minut. V. Wirować FT z probówką do elucji z przyspieszeniem 8000 x g przez 1 minutę, aby zebrać eluat do probówki do elucji. Usunąć w odpowiedni sposób zużytą FT. W. Zamknąć zatyczkę na probówce do elucji. Probówka do elucji zawiera roztwór podstawowy DNA. Przejść do punktu A w rozdziale Ocena ilościowa stężenia DNA. Pomiar stężenia DNA należy przeprowadzać natychmiast po zakończeniu procedury izolacji DNA i przed odłożeniem materiału do przechowywania. Ocena ilościowa stężenia DNA: A. Wymieszać każdy roztwór podstawowy DNA na mieszadle wibracyjnym przez 5 sekund. B. Przeprowadzić ocenę ilościową stężenia DNA za pomocą spektrofotometru Nanodrop UV-Vis (ND-1000 lub ND-2000) zgodnie z protokołem postępowania, podanym przez producenta urządzenia. Do wyzerowania urządzenia użyć odczynnika DNA EB. Należy obliczyć średnią z dwóch zgodnych odczytów. Wyniki dwóch pomiarów powinny mieścić się w granicach ± 10% każdego z nich przy odczytach stężenia DNA 20,0 ng/µl. W przypadku odczytów stężenia DNA < 20,0 ng/µl wyniki dwóch pomiarów powinny mieścić się w granicach ± 2 ng/µl. Jeżeli wyniki dwóch pomiarów nie mieszczą się w granicach ± 10% każdego z nich przy odczytach stężenia DNA 20,0 ng/µl lub w granicach ± 2 ng/µl przy odczytach stężenia DNA < 20,0 ng/µl, należy uzyskać dodatkowe 2 odczyty, aby wymogi badania zostały spełnione. Wówczas należy obliczyć średnią z dwóch nowych wyników pomiarów. Nie ma potrzeby wykonywania pomiarów w przypadku roztworu podstawowego DNA, pochodzącego z przetworzonej kontroli ujemnej (NEG CT). C. Stężenie roztworu podstawowego DNA, pochodzącego z próbek, musi być 4 ng/µl, aby można było wykonać cobas KRAS Mutation Test. Każdą próbkę poddaje się dwukrotnej amplifikacji/detekcji z użyciem w każdej amplifikacji/detekcji 25 µl rozcieńczonego roztworu podstawowego DNA o stężeniu 2 ng/µl (co daje ogółem 50 ng DNA). Aby można było przeprowadzić cobas KRAS Mutation Test, każdy roztwór podstawowy DNA musi mieć minimalne stężenie 4 ng/µl. Jeżeli stężenie roztworu podstawowego DNA jest < 4 ng/µl, należy powtórzyć procedury: pozbawiania próbek parafiny, izolacji DNA i oceny ilościowej stężenia DNA z użyciem dwóch skrawków FFPET tej próbki o grubości 5 µm. W przypadku próbek osadzonych na szkiełkach po pozbawieniu ich parafiny należy połączyć tkankę z obu skrawków w jednej probówce, zanurzyć tkankę w odczynnikach DNA TLB + PK i przeprowadzić izolację oraz ocenę ilościową stężenia DNA w sposób opisany powyżej. W przypadku próbek nieosadzonych na szkiełkach należy połączyć oba skrawki w jednej probówce i zanurzyć tkankę w odczynnikach DNA TLB + PK, po czym przeprowadzić izolację oraz ocenę ilościową stężenia DNA w sposób opisany powyżej. Jeżeli stężenie roztworu podstawowego DNA nadal jest niższe od 4 ng/µl, należy poprosić o przysłanie kolejnej próbki FFPET. Roztwór podstawowy DNA (przetworzoną próbkę i kontrolę ujemną) przechowuje się w temperaturze 2 8 C przez maksymalnie 2 tygodnie albo w temperaturze 20 C przez 60 dni PL 12 Doc Rev. 3.0

13 AMPLIFIKACJA I DETEKCJA Aby zapobiec kontaminacji roboczego odczynnika MMX próbkami DNA, należy przeprowadzać amplifikację i detekcję w miejscu oddzielonym od obszaru wykonywania izolacji DNA. Przed przygotowaniem roboczego MMX należy dokładnie oczyścić obszar roboczy amplifikacji i detekcji. W celu właściwego oczyszczenia należy dokładnie przetrzeć wszystkie powierzchnie, włącznie ze statywami i pipetorami, 0,5% roztworem podchlorynu sodu, a następnie 70% roztworem etanolu. Dostępny w handlu płynny wybielacz przeznaczony do zastosowań domowych zazwyczaj zawiera podchloryn sodu o stężeniu 5,25%. Rozcieńczenie domowego wybielacza w stosunku 1:10 pozwoli uzyskać 0,5-procentowy roztwór podchlorynu sodu. Konfiguracja urządzenia: Szczegółowe wskazówki dotyczące konfigurowania analizatora cobas z 480 zamieszczono w instrukcji obsługi analizatora cobas z 480. Konfiguracja zlecenia testu: Szczegółowe instrukcje dotyczące etapów przebiegu pracy podczas wykonywania badań genu kodującego KRAS zamieszczono w podręczniku użytkownika systemu cobas 4800 w części dotyczącej testu cobas KRAS Mutation Test (Podręcznik użytkownika testu cobas KRAS). Obliczanie rozcieńczenia roztworu podstawowego DNA, pochodzącego z próbki: Obliczanie rozcieńczenia roztworu podstawowego DNA w przypadku stężeń od 4 ng/µl do 28 ng/µl Roztwory podstawowe DNA, pochodzące z próbek, należy rozcieńczać bezpośrednio przed amplifikacją i detekcją. Każdą próbkę poddaje się dwukrotnej (2 x) amplifikacji/detekcji, co wymaga objętości rozcieńczonego roztworu podstawowego DNA o stężeniu 2 ng/µl wynoszącej ogółem 50 µl (po 25 µl na każdą z reakcji dla kodonu 12/13 oraz kodonu 61) (ogółem 100 ng DNA). A. Obliczyć dla każdej próbki potrzebną objętość (µl) roztworu podstawowego DNA: ilość µl roztworu podstawowego DNA = (70 µl x 2 ng/µl) stężenie roztworu podstawowego DNA [ng/µl] B. Obliczyć dla każdej próbki potrzebną objętość (µl) odczynnika DNA Rozcieńczalnik próbki (DNA SD): ilość µl odczynnika DNA SD = 70 µl ilość µl roztworu podstawowego DNA Przykład: stężenie roztworu podstawowego DNA = 6,5 ng/µl A. ilość µl roztworu podstawowego DNA = (70 µl x 2 ng/µl) 6,5 ng/µl = 21,5 µl B. ilość µl odczynnika DNA SD = (70 µl 21,5 µl) = 48,5 µl Obliczanie rozcieńczenia roztworu podstawowego DNA w przypadku stężeń > 28 ng/µl Roztwory podstawowe DNA, pochodzące z próbek, należy rozcieńczać bezpośrednio przed amplifikacją i detekcją. Każdą próbkę poddaje się dwukrotnej (2 x) amplifikacji/detekcji, co wymaga objętości rozcieńczonego roztworu podstawowego DNA o stężeniu 2 ng/µl wynoszącej ogółem 50 µl (po 25 µl na każdą z reakcji dla kodonu 12/13 oraz kodonu 61) (ogółem 100 ng DNA). A. W przypadku stężeń roztworu podstawowego DNA > 28 ng/µl do obliczania ilości odczynnika DNA Rozcieńczalnik próbki (DNA SD), wymaganej do przygotowania co najmniej 70 µl rozcieńczonego roztworu podstawowego DNA, należy użyć zamieszczonego poniżej wzoru. Ma to na celu zapewnienie, że do badania każdej próbki zostanie użyta objętość co najmniej 5 µl roztworu podstawowego DNA. B. Obliczyć dla każdej próbki objętość (µl) odczynnika DNA SD, potrzebną do rozcieńczenia 5 µl roztworu podstawowego DNA do stężenia 2 ng/µl: wymagana obj. DNA SD w µl = [(5 µl roztworu podstawowego DNA x stężenie roztworu podstawowego DNA w ng/µl) / 2 ng/µl] 5 µl PL 13 Doc Rev. 3.0

14 Przykład: stężenie roztworu podstawowego DNA = 31,7 ng/µl A. Wymagana obj. DNA SD w µl = [(5 µl x 31,7 ng/µl) / 2 ng/µl] 5 µl = 74,3 µl B. Użyć obliczonej objętości odczynnika DNA SD do rozcieńczenia 5 µl roztworu podstawowego DNA. Rozcieńczanie próbki Przed rozcieńczeniem DNA należy wyjąć rozcieńczalnik do próbek (DNA SD) z miejsca przechowywania w temperaturze od 15 C do 25 C i rozmrażać przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze od 15 C do 30 C. Przed użyciem każdego odczynnika mieszać go przez 5 sekund na mieszadle wibracyjnym, po czym zgromadzić płyn na dnie probówki. A. Przygotować stosowną liczbę probówek do mikrowirówki Safe-Lock o pojemności 1,5 ml na rozcieńczenia DNA, oznakowując je odpowiednimi informacjami identyfikującymi próbkę. B. Używając pipetora z końcówką zabezpieczoną przed powstawaniem aerozolu, przenieść pipetą obliczone objętości odczynnika DNA SD do odpowiednio oznakowanych probówek. Przenieść pipetą 35 µl odczynnika DNA SD do probówki Safe-Lock, oznakowanej napisem NEG CT. C. Mieszać każdy roztwór podstawowy DNA i kontrolę ujemną na mieszadle wibracyjnym od 5 do 10 sekund. D. Używając pipetora z końcówką zabezpieczoną przed powstawaniem aerozolu (nowa końcówka do przenoszenia każdej próbki), delikatnie przenieść pipetą obliczoną objętość każdego roztworu podstawowego DNA do odpowiedniej probówki zawierającej odczynnik DNA SD. Przenieść pipetą 35 µl kontroli ujemnej (wyizolowanego eluatu) do probówki z napisem NEG CT. E. Zamknąć probówki zatyczkami i mieszać zawartość każdej z nich na mieszadle wibracyjnym od 5 do 10 sekund. F. Zmienić rękawiczki. Przygotowanie roboczych odczynników Master Mix (MMX 12/13 oraz MMX 61) Odczynniki KRAS 12/13 OM, KRAS 61 OM oraz roboczy odczynnik MMX są wrażliwe na światło i należy je chronić przed długotrwałą ekspozycją na światło. Ze względu na lepkość odczynników KRAS MIX oraz roboczego odczynnika MMX przenoszenie pipetą należy wykonywać powoli, aby zagwarantować podanie z końcówki całej objętości mieszaniny. Odczynniki KRAS MIX, KRAS 12/13 OM oraz KRAS 61 OM mogą mieć barwę od przezroczystej do żółtej. Nie wpływa to na działanie odczynnika. Przygotować w oddzielnych probówkach do mikrowirówki Safe-Lock o pojemności 1,5 ml dwie większe porcje odczynników potrzebnych do sporządzenia roboczych odczynników MMX jedną z odczynnikiem KRAS 12/13 OM i drugą zawierającą odczynnik KRAS 61 OM. A. Obliczyć objętość odczynnika KRAS MIX, wymaganą do sporządzenia każdego z odczynników roboczych MMX, według następującego wzoru: wymagana objętość odczynnika KRAS MIX = (liczba próbek + 2 kontrole + 1 kalibrator + 1) x 10 µl B. Obliczyć objętość odczynnika KRAS 12/13 OM lub KRAS 61 OM, wymaganą do sporządzenia każdego z odczynników roboczych MMX, według następującego wzoru: wymagana objętość odczynnika KRAS 12/13 OM lub KRAS 61 OM = (liczba próbek + 2 kontrole + 1 kalibrator + 1) x 10 µl C. Obliczyć objętość odczynnika MGAC, wymaganą do sporządzenia każdego z odczynników roboczych MMX, według następującego wzoru: wymagana objętość odczynnika MGAC = (liczba próbek + 2 kontrole + 1 kalibrator + 1) x 6 µl Posługując się tabelą 1, określić objętość każdego odczynnika, potrzebną do przygotowania roboczego odczynnika MMX, na podstawie liczby próbek włączonych do przebiegu testowego PL 14 Doc Rev. 3.0

15 Tabela 1 Objętości odczynników potrzebne do sporządzenia roboczego odczynnika MMX 12/13 i roboczego odczynnika MMX 61 Objętości odczynników potrzebne do przygotowania odczynnika roboczego MMX Liczba próbek* KRAS MIX 10 µl KRAS 12/13 OM lub KRAS 61 OM 10 µl MGAC 6 µl Całkowita objętość (μl) * Zawiera objętość wystarczającą na 1 probówkę na próbkę, 2 probówki z materiałem kontrolnym, 1 probówkę z kalibratorem i 1 nadprogramową probówkę D. Wyjąć odpowiednią liczbę fiolek z odczynnikami KRAS MIX, KRAS 12/13 OM, KRAS 61 OM i MGAC z miejsca, w którym były przechowywane w temperaturze od 15 C do 25 C. Przed użyciem wszystkie odczynniki należy pozostawić do rozmrożenia na co najmniej 1 godzinę w temperaturze od 15 C do 30 C. Przed użyciem każdego odczynnika mieszać go przez 5 sekund na mieszadle wibracyjnym, po czym zgromadzić płyn na dnie probówki. Oznakować jałową probówkę do mikrowirówki, przeznaczoną na roboczy odczynnik MMX 12/13 i roboczy odczynnik MMX 61. Robocze odczynniki MMX należy przygotować w ciągu 1 godziny od rozmrożenia odczynników. Po rozmrożeniu jakiekolwiek pozostałości niewykorzystanych odczynników należy w ciągu 1 godziny od użycia ponownie umieścić w miejscu przechowywania w temperaturze od 15 C do 25 C. E. Dodać obliczoną objętość odczynnika KRAS MIX do probówek przeznaczonych na robocze odczynniki MMX. F. Dodać obliczoną objętość odczynnika KRAS 12/13 OM lub KRAS 61 OM do odpowiedniej probówki przeznaczonej na odczynnik MMX. G. Dodać obliczoną objętość odczynnika MGAC do probówek przeznaczonych na robocze odczynniki MMX. H. Mieszać zawartość probówek na mieszadle wibracyjnym od 3 do 5 sekund, aby zapewnić dostateczne wymieszanie odczynnika. Próbki, kontrole i kalibratory należy dodać do płytki z mikrodołkami (płytki AD) w ciągu 1 godziny od przygotowania roboczych odczynników MMX. Należy używać wyłącznie płytki z mikrodołkami (płytki AD) systemu cobas 4800 oraz odpowiedniej folii uszczelniającej (Roche P/N ). Rysunek 1 Rozmieszczenie próbek na płytce Rozmieszczenie próbek na płytce A B C D E F G H KRAS MC 12/13 NEG CTL 12/13 KRAS CAL 12/13 KRAS MC Próbka 6 Próbka 6 Próbka 14 Próbka 14 Próbka 22 Próbka / / /13 61 NEG CTL Próbka 7 Próbka 7 Próbka 15 Próbka 15 Próbka 23 Próbka / / /13 61 KRAS CAL Próbka 8 Próbka 8 Próbka 16 Próbka 16 Próbka 24 Próbka / / /13 61 Próbka 1 Próbka 1 Próbka 9 Próbka 9 Próbka 17 Próbka 17 12/ / /13 61 Próbka 2 Próbka 2 Próbka 10 Próbka 10 Próbka 18 Próbka 18 12/ / /13 61 Próbka 3 Próbka 3 Próbka 11 Próbka 11 Próbka 19 Próbka 19 12/ / /13 61 Próbka 4 Próbka 4 Próbka 12 Próbka 12 Próbka 20 Próbka 20 12/ / /13 61 Próbka 5 Próbka 5 Próbka 13 Próbka 13 Próbka 21 Próbka 21 12/ / / PL 15 Doc Rev. 3.0

16 A. Przenieść pipetą 25 µl roboczego odczynnika MMX do każdego dołka reakcyjnego płytki z mikrodołkami (płytki AD), potrzebnego do przeprowadzenia przebiegu testowego. Nie dopuścić do tego, aby końcówka pipetora dotknęła płytki poza obrębem dołka. Dodać roboczy odczynnik MMX 12/13 (zawierający odczynnik KRAS 12/13 OM) do dołków płytki z mikrodołkami (płytki AD) w kolumnach nieparzystych (1, 3, 5 itd.). Dodać roboczy odczynnik MMX 61 (zawierający odczynnik KRAS 61 OM) do dołków płytki z mikrodołkami (płytki AD) w kolumnach parzystych (2, 4, 6 itd.). B. Przenieść pipetą 25 µl odczynnika KRAS MC do dołków A1 oraz A2 płytki z mikrodołkami (płytki AD); dokładnie wymieszać, aspirując pipetą zawartość i podając ją z powrotem, co najmniej dwukrotnie w obrębie danego dołka. C. Używając nowej końcówki pipetora, przenieść 25 µl odczynnika NEG CT do dołków B1 i B2 płytki z mikrodołkami (płytki AD); dokładnie wymieszać, aspirując pipetą zawartość i podając ją z powrotem, co najmniej dwukrotnie w obrębie danego dołka. D. Używając nowej końcówki pipetora, przenieść 25 µl odczynnika KRAS CAL do dołków C1 i C2 płytki z mikrodołkami (płytki AD); dokładnie wymieszać, aspirując pipetą zawartość i podając ją z powrotem, co najmniej dwukrotnie w obrębie danego dołka. Każdy przebieg testowy musi zawierać kontrolę dodatnią (odczynnik KRAS MC) w dołkach A1 i A2, kontrolę ujemną (odczynnik NEG CT) w dołkach B1 i B2 oraz kalibrator (odczynnik KRAS CAL) w dołkach C1 i C2; w przeciwnym razie przebieg testowy zostanie uznany za nieważny. Należy zmieniać rękawice zgodnie z potrzebami, aby chronić próbki przed wzajemną kontaminacją zawartym w nich materiałem oraz chronić probówki do reakcji PCR przed kontaminacją na ich zewnętrznych powierzchniach. E. Używając nowych końcówek pipetora do każdej rozcieńczonej próbki DNA, dodać 25 µl pierwszej próbki DNA do dołków D1 oraz D2 płytki z mikrodołkami (płytki AD); dokładnie wymieszać, aspirując pipetą zawartość i podając ją z powrotem, co najmniej dwukrotnie w obrębie danego dołka. Powtórzyć tę procedurę z rozcieńczonym roztworem DNA z drugiej próbki (dołki E1 oraz E2). Postępować według szablonu przedstawionego na rysunku 1, dopóki rozcieńczone roztwory DNA ze wszystkich próbek nie zostaną umieszczone na płytce z mikrodołkami (płytce AD). Upewnić się, że cały płyn zebrał się na dnie dołków. F. Przykryć płytkę z mikrodołkami (płytkę AD) folią uszczelniającą (dostarczoną wraz z płytkami). Użyć aplikatora folii uszczelniającej do szczelnego przytwierdzenia folii do płytki z mikrodołkami (płytki AD). G. Przed rozpoczęciem reakcji PCR potwierdzić, że cały płyn zebrał się na dnie każdego z dołków. Amplifikacja i detekcja powinny rozpocząć się w ciągu 1 godziny od dodania rozcieńczonego roztworu DNA z pierwszej próbki do roboczego odczynnika MMX. Rozpoczęcie reakcji PCR Szczegółowe instrukcje dotyczące etapów przebiegu pracy podczas wykonywania badań genu kodującego KRAS zamieszczono w podręczniku użytkownika testu mutacji cobas KRAS PL 16 Doc Rev. 3.0