COBAS TaqMan CT Test, v2.0

Transkrypt

1 COBAS TaqMan CT Test, v2.0 DO STOSOWANIA W DIAGNOSTYCE IN VITRO. COBAS TaqMan CT Test, v2.0 CTM CT v Tests P/N: AMPLICOR CT/NG Specimen Preparation Kit CT/NG PREP 100 Tests P/N: ART: US: UWAGA: Zakup niniejszego produktu umożliwi nabywcy zastosowanie go do amplifikacji i detekcji sekwencji kwasu nukleinowego z zastosowaniem reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) oraz związanych z nią procesów w ramach diagnostyki in vitro z użyciem materiału ludzkiego. Wraz z nabyciem niniejszego produktu nabywca nie otrzymuje żadnego patentu ogólnego ani innej licencji, oprócz prawa do określonego, szczególnego zastosowania produktu. ZASTOSOWANIE Test COBAS TaqMan CT, v2.0, jest testem in vitro, pozwalającym na amplifikację kwasów nukleinowych, umożliwiającym jakościową detekcję DNA Chlamydia trachomatis w próbkach wymazów z kanału szyjki macicy kobiet lub w moczu mężczyzn i kobiet. Próbki są przygotowywane przy użyciu zestawu do ręcznego przygotowywania próbek AMPLICOR CT/NG oraz analizatora COBAS TaqMan 48, który zapewnia automatyczną amplifikację i detekcję. PODSUMOWANIE ORAZ OPIS TESTU Chlamydia jest bakterią Gram-ujemną, nieruchliwą, występującą jako obligatoryjny pasożyt wewnątrzkomórkowy komórek eukariotycznych z uwagi na niezdolność do syntezy ATP. Rodzaj Chlamydia obejmuje cztery opisane dotychczas gatunki: C. trachomatis, C. psittaci, C. pecorum oraz C. pneumoniae (TWAR). C. psittaci jest zasadniczo patogenem zwierzęcym, a chorobotwórcza rola C. pecorum nie jest jasna 1. Zakażenia Chlamydia trachomatis są obecnie drugą co do częstości przyczyną schorzeń przenoszonych drogą płciową (STD, sexually transmitted diseases) w populacji ogólnoświatowej przy zapadalności wynoszącej około 89,1 miliona przypadków rocznie 2. Częstość występowania w Stanach Zjednoczonych wynosi około 2,8 miliona przypadków rocznie 3. Chlamydia trachomatis powoduje zapalenie szyjki macicy, zapalenie narządów miednicy mniejszej (Pelvic Inflammatory Disease, PID), niemowlęce zapalenie spojówek, niemowlęce zapalenie płuc, zapalenie cewki moczowej, zapalenie najądrza oraz zapalenie odbytu 1,4. Chlamydia trachomatis jest też najczęstszą przyczyną (około 25 55% przypadków) niegonokokowego zapalenia cewki moczowej (NGU, nongonococcal urethritis) u mężczyzn. U kobiet konsekwencje zakażenia chlamydiami są poważne w przypadku braku leczenia. Około połowy zakażeń przebiega bezobjawowo i dlatego wiele przypadków pozostaje nierozpoznanych i nieleczonych, co prowadzi do dodatkowych problemów, szczególnie u kobiet ciężarnych. U dzieci urodzonych przez kobiety z zakażeniem chlamydiami występuje wysokie ryzyko rozwoju wtrętowego zapalenia spojówek i zapalenia płuc. Tradycyjnie referencyjną, standardową metodę oznaczania C. trachomatis stanowią testy posiewowe. Jednak kłopoty ze standaryzacją, wysoki stopień trudności technicznej, a także konieczność utrzymania żywotności bakterii podczas transportu i przechowywania przed wykonaniem posiewu przyczyniły się do rozwoju innych, nieposiewowych metod oznaczania C. trachomatis 5. Metody niewymagające stosowania żywych bakterii obejmują testy amplifikacji kwasu nukleinowego (nucleic acid amplifacion test NAAT), testy z użyciem sond kwasu nukleinowego, testy immunoenzymatyczne (enzyme immunoassay EIA), testy immunofluorescencji bezpośredniej (direct fluorescent antibody DFA) oraz testy wiązania dopełniacza 1,5. Badania kliniczne wskazują, że metody NAAT cechują się większą czułością niż metody posiewowe i inne metody nieposiewowe, dlatego stały się preferowaną metodą klinicznej diagnostyki laboratoryjnej zakażeń C. trachomatis 5. ZASADY PROCEDURY Test COBAS TaqMan CT, v2.0, opiera się na dwóch głównych procesach: (1) ręcznej obróbce próbki w celu uzyskania DNA CT; (2) jednoczesnej amplifikacji PCR 6 docelowego DNA z użyciem swoistych dla CT komplementarnych primerów oraz detekcji rozszczepionych, znakowanych podwójnym barwnikiem fluorescencyjnym detekcyjnych sond oligonukleotydowych, które umożliwiają detekcję amplifikowanego docelowego produktu CT (amplikonu) oraz kontrolę wewnętrzną DNA CT preparatu, który amplifikuje się i poddaje detekcji równocześnie z próbką. Część Informacje na temat wersji dokumentu znajduje się na końcu tego dokumentu. 1

2 Odczynnik Master Mix zawiera pary primerów oraz sondy swoiste dla DNA plazmidu utajonego CT, DNA chromosomalnego genu ompa oraz DNA kontroli wewnętrznej CT. Odczynnik Master Mix został przygotowany tak, aby zapewniać detekcję wszystkich 15 serowarów CT. Detekcji amplifikowanego DNA dokonuje się przy użyciu swoistych dla sekwencji docelowych oraz swoistych dla kontroli wewnętrznej, podwójnie znakowanych sond oligonukleotydowych, pozwalających na niezależną identyfikację amplikonu CT i amplikonu kontroli wewnętrznej CT. Przygotowanie próbki Komórki nabłonka dróg moczowo-płciowych pobrane w trakcie wymazu lub odwirowane z moczu poddaje się działaniu roztworu detergentu w celu uwolnienia DNA chlamydii zawartego w ciałkach siateczkowatych. Kolejny roztwór detergentu dodaje się w celu przygotowania lizatu próbki do amplifikacji. Amplifikacja PCR Wybór sekwencji docelowej Oprócz chromosomalnego DNA, C. trachomatis zawiera dodatkowo plazmid utajony o wielkości około 7500 par zasad wspólny dla wszystkich serowarów C. trachomatis 7,8. W teście COBAS TaqMan CT, v2.0, wykorzystano primery CP102 i CP103 do określenia sekwencji DNA o długości około 206 nukleotydów wewnątrz plazmidu utajonego C. trachomatis. Dodatkowo w teście COBAS TaqMan CT, v2.0, wykorzystano również primery CTMP101 i CTMP102 do określenia sekwencji chromosomalnego DNA C. trachomatis o długości około 182 nukleotydów. Amplifikacja sekwencji docelowej Poddane obróbce próbki dodaje się do mieszaniny amplifikacyjnej w probówkach K do amplifikacji (K-tube) lub tackach K (K-tray), gdzie zachodzi amplifikacja PCR. Mieszanina reakcyjna jest podgrzewana w celu denaturacji wyizolowanego DNA oraz odsłonięcia sekwencji docelowych primerów. W trakcie schładzania mieszaniny primery sensowne i antysensowne w sposób swoisty hybrydyzują do jednej z nici DNA, Z05 wydłuża primer i syntetyzowana jest druga nić DNA. Proces ten kończy pierwszy cykl PCR, dostarczając dwuniciowej kopii DNA docelowych regionów CT i kontroli wewnętrznej CT. Mieszanina reakcyjna jest po raz kolejny podgrzewana w celu rozdzielenia powstałego dwuniciowego DNA i odsłonięcia sekwencji docelowych primerów. Podczas schładzania mieszaniny primery hybrydyzują do DNA docelowego. W obecności jonów Mn 2+ i nadmiaru trójfosforanów dezoksyrybonukleotydów (dntp) polimeraza DNA Z05 wydłuża przyłączone primery wzdłuż docelowych matryc, tworząc dwuniciową cząsteczkę DNA, zwaną amplikonem. Analizator COBAS TaqMan 48 automatycznie powtarza powyższy proces przez określoną liczbę cykli, w każdym z nich zmierzając do podwojenia ilości amplikonu DNA. Wymagana liczba cykli jest zaprogramowana w analizatorze COBAS TaqMan 48. Amplifikacja zachodzi wyłącznie w regionie plazmidu utajonego CT i/lub w regionach ompa w obrębie chromosomalnego DNA, które znajdują się pomiędzy dwoma primerami. Ani cały plazmid utajony CT, ani chromosom nie są amplifikowane. Amplifikacja kontroli wewnętrznej W wykorzystujących enzymy procesach amplifikacji, takich jak PCR, zawartość inhibitorów w próbce może skutkować zmniejszoną wydajnością amplifikacji. Kontrola wewnętrzna CT umożliwia identyfikację poddanych obróbce próbek zawierających substancje, które mogą zakłócać amplifikację PCR. Kontrola wewnętrzna CT to niezakaźny, rekombinowany plazmid DNA z identycznymi jak w sekwencji docelowej C. trachomatis regionami wiążącymi primery, losową sekwencją wewnętrzną o podobnej długości i składzie zasad jak sekwencja docelowa C. trachomatis oraz unikalnym regionem wiążącym sondy, odróżniającym amplikon kontroli wewnętrznej CT od amplikonu docelowego. Powyższe cechy wybrano, aby zapewnić równoważną amplifikację docelowego DNA kontroli wewnętrznej CT i C. trachomatis. Odczynnik kontroli wewnętrznej CT wchodzi w skład testu COBAS TaqMan CT, v2.0, i jest wprowadzany do każdej reakcji amplifikacji w celu równoczesnej amplifikacji z docelowym DNA z próbki. Kontrola wewnętrzna CT ma za zadanie zapewniać, że próbki nie zawierają inhibitorów mogących zakłócać amplifikację i detekcję 20 lub więcej kopii docelowego kwasu nukleinowego C. trachomatis, jak oszacowano przy użyciu analizy Poissona. Amplifikacja wybiórcza Amplifikację wybiórczą badanego kwasu nukleinowego z próbki w teście COBAS TaqMan CT, v2.0, uzyskuje się dzięki zastosowaniu enzymu AmpErase (uracylo-n-glikozylaza) i trójfosforanu dezoksyurydyny (dutp). Enzym AmpErase rozpoznaje i katalizuje niszczenie nici DNA zawierających dezoksyurydynę 9, lecz nie łańcuchów DNA zawierających dezoksytymidynę. W DNA występującym w naturze nie stwierdza się dezoksyurydyny, natomiast jest ona zawsze obecna w amplikonie, ze względu na stosowanie trójfosforanu dezoksyurydyny jako jednego spośród trójfosforanów dezoksyrybonukleotydu (dntp) w odczynniku Master Mix. Dlatego też dezoksyurydynę zawiera wyłącznie amplikon. Dezoksyurydyna warunkuje wrażliwość zanieczyszczającego amplikonu na rozkład przez enzym AmpErase przed amplifikacją docelowego DNA. Pod wpływem działania enzymu AmpErase zniszczeniu ulegają wszelkie nieswoiste produkty reakcji powstałe po wstępnej aktywacji odczynnika Master Mix przez jony manganu. Enzym AmpErase, zawarty w odczynniku Master Mix, katalizuje rozkład DNA zawierającego dezoksyurydynę w miejscu reszt dezoksyurydynowych 2

3 przez otwarcie pierścienia dezoksyrybozy w pozycji C1. Podczas ogrzewania w pierwszym cyklu termicznym łańcuch amplikonu DNA pęka w miejscu, gdzie znajduje się dezoksyurydyna, w ten sposób wykluczając dalszą amplifikację DNA. Enzym AmpErase jest nieczynny w temperaturach powyżej 55 C, tj. w czasie trwania całego cyklu termicznego, dlatego też nie niszczy on amplikonu docelowego, powstałego podczas amplifikacji. Detekcja produktów reakcji PCR w teście COBAS TaqMan Test COBAS TaqMan CT, v2.0, wykorzystuje technologię PCR w czasie rzeczywistym (real-time PCR) 10,11. Zastosowanie sond podwójnie znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym pozwala na detekcję w czasie rzeczywistym gromadzenia się produktu reakcji PCR przez monitorowanie intensywności emisji fluorescencyjnych barwników reporterowych, uwalnianych w trakcie procesu amplifikacji. Sondy składają się z oligonukleotydów swoistych dla plazmidu utajonego CT, regionu ompa CT i kontroli wewnętrznej CT, znakowanych barwnikiem reporterowym i wygaszaczem. W sondach dla plazmidu utajonego CT i genu ompa w teście COBAS TaqMan CT, v2.0, wykorzystano ten sam barwnik reporterowy, natomiast kontrola wewnętrzna CT jest znakowana fluorescencyjnym barwnikiem reporterowym innym niż w przypadku sond dla plazmidu utajonego CT i genu ompa. Gdy podwójnie oznakowane barwnikami fluorescencyjnymi cząsteczki sond są nienaruszone, fluorescencja reportera jest przytłumiona bliskością wygaszacza, na zasadzie efektu przenoszenia energii typu Förstera. Podczas reakcji PCR sondy ulegają hybrydyzacji z odpowiednią sekwencją docelową, a następnie rozszczepieniu pod wpływem posiadanej przez termostabilną polimerazę DNA Z05 aktywności 5' do 3' nukleazy. Od chwili uwolnienia i rozdzielenia reportera i wygaszacza nie zachodzi już zjawisko wygaszania, a aktywność fluorescencyjna barwników reporterowych nasila się. Amplifikacja plazmidu utajonego CT i/lub docelowego DNA genuompa są mierzone oddzielnie i przy innej długości fali niż w przypadku DNA kontroli wewnętrznej CT. Proces ten powtarza się przez określoną liczbę cykli, a w każdym cyklu następuje efektywne zwiększenie intensywności emisji poszczególnych barwników reporterowych, umożliwiając niezależną identyfikację DNA CT oraz DNA kontroli wewnętrznej CT. ODCZYNNIKI AMPLICOR CT/NG Specimen Preparation Kit CT/NG PREP 100 testów Zestaw do przygotowywania próbek AMPLICOR CT/NG (P/N: ; ART: ; US: 83315) CT/NG URINE WASH 1 50 ml (CT/NG bufor płuczący do próbek moczu) bufor Tris-HCl 300 mm chlorek sodu < 0,1% detergent 0,09% azydek sodu CT/NG LYS 1 25 ml (CT/NG odczynnik lizujący) bufor Tris-HCl < 1% substancja ułatwiająca rozpuszczalność 0,09% azydek sodu CT/NG DIL 2 50 ml (CT/NG rozcieńczalnik próbki) bufor Tris-HCl 6 mm chlorek magnezu < 25% detergent 0,05% azydek sodu COBAS TaqMan CT Test, v2.0 CTM CT v testów (P/N: ) Odczynniki do kontroli CT IC 3 0,1 ml (kontrola wewnętrzna CT) bufor Tris-HCl 8 kopii/μl niezakaźnego plazmidu DNA (bakteryjnego), zawierającego sekwencje wiążące primer C. trachomatis oraz unikatowy region wiążący sondę, równoważne około 20 kopiom IC/test < 0,005% poly ra RNA (syntetyczny) EDTA barwnik amarantowy 0,05% azydek sodu 3

4 CT (+) C, v2.0 1 x 0,75 ml [C. trachomatis kontrola (+), v2.0] bufor Tris-HCl 8,6 kopii/μl niezakaźnego plazmidu DNA (syntetycznego), zawierającego sekwencje C. trachomatis, równoważne około 20 kopiom/test < 0,005% poly ra RNA (syntetyczny) EDTA 0,05% azydek sodu CT ( ) C, v2.0 1 x 0,75 ml [C. trachomatis kontrola ( ), v2.0] bufor Tris-HCl < 0,005% poly ra RNA (syntetyczny) EDTA 0,05% azydek sodu Odczynniki do amplifikacji i detekcji CT MMX, v2.0 (COBAS TaqMan CT Master Mix, v2.0) 3 0,75 ml bufor Tricine wodorotlenek potasu octan potasu glicerol < 0,001% datp, dctp, dgtp, dutp < 0,001% primery sensowne i antysensowne dla plazmidu utajonego CT i genu ompa CT < 0,001% sondy oligonukleotydowe znakowane fluorescencyjnie, swoiste dla plazmidu utajonego CT, genu ompa CT i kontroli wewnętrznej CT < 0,001% aptamer < 0,05% polimeraza DNA Z05 (bakteryjna) < 0,1% enzym AmpErase (uracylo-n-glikozylaza) (bakteryjny) 0,09% azydek sodu CT Mn 2+ (roztwór manganu COBAS TaqMan CT) 3 0,2 ml < 1,0% octan manganu Lodowaty kwas octowy 0,09% azydek sodu OSTRZEŻENIA I ŚRODKI OSTROŻNOŚCI A. DO STOSOWANIA W DIAGNOSTYCE IN VITRO. B. Używany w niniejszej ulotce termin kopia odnosi się do 1 kopii docelowego kwasu nukleinowego C. trachomatis. Jedna (1) kopia jest równoważna najmniejszej ilości docelowego kwasu nukleinowego C. trachomatis, która daje dodatni wynik testu PCR. C. Test ten jest przeznaczony do użytku wyłącznie w przypadku próbek pobranych z kanału szyjki macicy oraz próbek moczu. Test nie jest przeznaczony do stosowania w odniesieniu do próbek pobranych z gardła, odbytnicy ani innych typów próbek. D. Nie pipetować za pomocą ust. E. Nie jeść, nie pić ani nie palić w obszarach roboczych laboratorium. Posługując się próbkami i odczynnikami z zestawów, stosować jednorazowe rękawice, fartuchy laboratoryjne oraz odpowiednią ochronę oczu. Po zakończeniu pracy z próbkami i odczynnikami testowymi należy dokładnie umyć ręce. F. Unikać skażenia odczynników bakteriami podczas pobierania porcji z butelek z odczynnikami. G. Zaleca się stosowanie jałowych, jednorazowych pipet oraz końcówek pipet. H. Nie łączyć odczynników z różnych serii ani z różnych butelek z tej samej serii. I. Nie mieszać odczynników pochodzących z różnych zestawów. J. Wyrzucić wszystkie niezużyte odczynniki, odpady i próbki, postępując zgodnie z przepisami krajowymi, federalnymi, stanowymi i lokalnymi. K. Nie używać zestawu po upływie daty ważności. L. Karty charakterystyki substancji niebezpiecznych (Material Safety Data Sheets MSDS) są dostępne na żądanie w miejscowym przedstawicielstwie firmy Roche. 4

5 M. Praca w laboratorium musi przebiegać jednokierunkowo należy ją rozpocząć w obszarze przedamplifikacyjnym i przemieszczać się jednokierunkowo w stronę obszaru poamplifikacyjnego (amplifikacji/detekcji). Materiały i wyposażenie muszą być przeznaczone wyłącznie do określonej czynności poprzedzającej proces amplifikacji. Nie wolno używać ich do innych czynności ani przemieszczać między obszarami. W każdym obszarze konieczne jest używanie rękawiczek, które należy zmienić przed opuszczeniem danego obszaru. Wyposażenie i materiały zastosowane do przygotowania odczynnika nie mogą być używane podczas czynności związanych z przygotowywaniem próbki lub pipetowaniem albo obróbką zamplifikowanego DNA lub innych źródeł docelowego DNA. Materiały i urządzenia używane w czynnościach po amplifikacji muszą pozostawać zawsze w obszarze poamplifikacyjnym. N. Z próbkami oraz kontrolami należy obchodzić się jak z materiałem zakaźnym, stosując bezpieczne procedury laboratoryjne, przedstawione w Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 12 oraz w CLSI Document M29-A3 13. Dokładnie oczyścić i odkazić wszystkie powierzchnie robocze świeżo przygotowanym roztworem 0,5% podchlorynu sodu w wodzie dejonizowanej lub destylowanej. UWAGA: Dostępny w handlu płynny domowy wybielacz zawiera zazwyczaj podchloryn sodu w stężeniu 5,25%. Rozcieńczenie domowego wybielacza w stosunku 1:10 daje 0,5% roztwór podchlorynu sodu. O. W przypadku próbek transportowanych na transportowym podłożu hodowlanym M4RT MicroTest (Remel, Inc.) waciki należy pozostawić w probówce transportowej, aby zapewnić wzrokowe potwierdzenie inokulacji próbki. Test COBAS TaqMan CT, v2.0, poddano ocenie przy użyciu próbek transportowanych w transportowej probówce z wacikiem i transportowym podłożem hodowlanym M4RT MicroTest (Remel, Inc.). Nie oceniano próbek transportowanych na transportowym podłożu hodowlanym M4RT MicroTest (Remel, Inc.) bez wacików i nie zaleca się stosowania tego rodzaju próbek z niniejszym testem. P. Przechowywanie próbek moczu w temperaturze pokojowej (15 30 C) przez ponad 24 godziny może spowodować degradację próbki. Próbek moczu przechowywanych przez ponad 24 godziny w temperaturze pokojowej (15 30 C) nie należy używać do testów. Q. Odczynniki CT/NG URINE WASH, CT/NG LYS, CT/NG DIL, CT MMX, v2.0; CT Mn 2+, CT IC, CT (+) C, v2.0, i CT ( ) C, v2.0, zawierają azydek sodu. Azydek sodu może reagować z instalacjami wodno-kanalizacyjnymi wykonanymi z ołowiu lub miedzi, tworząc silnie wybuchowe azydki metali. Usuwając roztwory zawierające azydek sodu do zlewów laboratoryjnych, należy spłukać rury dużą objętością wody, aby zapobiec nagromadzeniu azydków. R. Do przygotowywania próbek oraz kontroli należy używać probówek z zakręcanym korkiem, aby zapobiegać rozlaniu i możliwości skażenia krzyżowego próbek. Nie należy stosować probówek z korkiem zatrzaskowym. S. Podczas pracy z jakimkolwiek odczynnikiem należy używać osłon na oczy oraz fartuchów laboratoryjnych i rękawic jednorazowych. Unikać kontaktu wymienionych materiałów ze skórą, oczami i błonami śluzowymi. Jeżeli dojdzie do kontaktu, natychmiast spłukać dużą ilością wody. Jeżeli nie zostaną podjęte odpowiednie środki, może dojść do oparzeń. W razie rozlania wspomnianych odczynników należy przed wytarciem plam rozcieńczyć je wodą. WYMAGANIA DOTYCZĄCE PRZECHOWYWANIA I UŻYTKOWANIA Nie zamrażać odczynników ani kontroli. A. Przechowywać CT/NG LYS w temperaturze 2 25 C. Przechowywać CT/NG URINE WASH i CT/NG DIL w temperaturze 2 8 C. W przypadku powstania osadu podczas przechowywania powyższych odczynników należy je ogrzać do temperatury pokojowej (15 30 C) i dokładnie wymieszać przed użyciem. Odczynniki te zachowują stabilność do podanej daty przydatności. B. Przechowywać CT MMX, v2.0; CT Mn 2+, CT (+) C, v2.0; CT ( ) C, v2.0, i CT IC w temperaturze 2 8 C. Odczynniki te zachowują stabilność do podanej daty ważności. C. Pomiędzy przebiegami pracy urządzenia częściowo zużyte kontrole przechowuj w temperaturze 2 8 C. Przed użyciem należy sprawdzić datę przydatności otwartych kontroli. Odczynników CT (+) C, v2.0, i CT ( ) C, v2.0, można użyć do trzech razy w celu przygotowania kontroli roboczych CT (+), v2.0, i CT ( ), v2.0. D. Odczynniki CT MMX, v2.0; CT Mn 2+ i CT IC są dostarczane w jednorazowych fiolkach wystarczających na serię 16 reakcji. Niezużyty materiał z fiolek należy wyrzucić. 5

6 E. Odczynnik roboczy Master Mix (przygotowywany przez dodanie CT Mn 2+ i CT IC do CT MMX, v2.0) musi być przechowywany w ciemności, w temperaturze pokojowej (15 30 C) nie dłużej niż 2 godziny lub w temperaturze 2 8 C nie dłużej niż przez 16 godzin. Przygotowane próbki i kontrole należy dodać do odczynnika Master Mix w ciągu 2 godzin od jego przygotowania w przypadku przechowywania odczynnika w temperaturze pokojowej (15 30 C) lub w ciągu 16 godzin od jego przygotowania w przypadku przechowywania odczynnika w temperaturze 2 8 C. F. Poddane obróbce próbki zachowują stabilność do 2 godzin w temperaturze C i przez 7 dni w temperaturze 2 8 C. G. Amplifikację należy rozpocząć w ciągu 90 minut od chwili dodania przygotowanych próbek badanych i kontrolnych do roboczego odczynnika Master Mix. DOSTARCZONE MATERIAŁY Odczynniki do przygotowywania próbki A. AMPLICOR CT/NG Specimen Preparation Kit Zestaw do przygotowywania próbek AMPLICOR CT/NG (P/N: ; ART: ; US: 83315) CT/NG LYS (CT/NG odczynnik lizujący) CT/NG URINE WASH (CT/NG bufor płuczący do próbek moczu) CT/NG DIL (CT/NG rozcieńczalnik próbki) Odczynniki do amplifikacji i detekcji B. COBAS TaqMan CT Test, v2.0 (P/N: ) CT IC (kontrola wewnętrzna CT) CT (+) C, v2.0 [C. trachomatis kontrola (+), v2.0] CT ( ) C, v2.0 [C. trachomatis kontrola ( ), v2.0] CT MMX, v2.0 (COBAS TaqMan CT Master Mix, v2.0) CT Mn 2+ (roztwór manganu COBAS TaqMan CT) CT/NG PREP CTM CT v2.0 MATERIAŁY WYMAGANE, LECZ NIEDOSTARCZANE Przyrządy i oprogramowanie Analizator COBAS TaqMan 48 Oprogramowanie AMPLILINK w wersji serii 3.3 lub 3.4 Jednostka sterująca z oprogramowaniem AMPLILINK Podręczniki obsługi urządzeń i oprogramowania: Instrukcja obsługi analizatora COBAS TaqMan 48 do użytku z oprogramowaniem AMPLILINK w wersji serii 3.3 i 3.4 Podręcznik programu AMPLILINK w wersji serii 3.3 do użytku z aparatem COBAS AmpliPrep, analizatorem COBAS TaqMan, analizatorem COBAS TaqMan 48, analizatorem COBAS AMPLICOR i aparatem cobas p 630 lub Podręcznik oprogramowania AMPLILINK w wersji serii 3.4 Plik definicji testu (Test Definition File, TDF). Nazwa i numer bieżącej wersji TDF znajdują się na karcie informacyjnej produktu, dołączonej do opakowania zestawu. Urządzenie do mocowania korka w probówkach K Zasobnik K do analizatora COBAS TaqMan 48 Zasobnik na tace K do analizatora COBAS TaqMan 48 6

7 Pobieranie i transport próbek Zestaw MicroTest M4RT BL Ref , produkowany i dystrybuowany przez firmę Remel, Inc. Produkt dostępny jest również w systemie zamówień firmy Roche (P/N: ). Polipropylenowe kubeczki do pobierania próbek moczu pozbawione substancji konserwujących Materiały jednorazowego użytku Probówki K Tacki K do analizatora COBAS TaqMan 48 INNE MATERIAŁY WYMAGANE, LECZ NIEDOSTARCZANE Pipeta Eppendorf Repeater z końcówką 1,25 ml Eppendorf Combitip Reservoir (jałowa, pojedynczo pakowana) Wytrząsarka do probówek Rękojeść pomocnicza do pipety: Drummond (P/N: ) bądź jej odpowiednik Polipropylenowe probówki z zakręcanym korkiem o pojemności 2,0 ml, jałowe, niesilikonizowane, stożkowe (Sarstedt lub odpowiednik)** Statyw na probówki (Sarstedt lub odpowiednik) Pipetory (pojemność 50 μl, 100 μl, 200 μl, 250 μl, 500 μl i 1000 μl)* z osłoną aerozolową lub końcówkami z dodatnim wypieraniem Mikrowirówka (maks. RCF x g, min. RCF x g); Eppendorf 5415C, HERMLE Z230M lub odpowiednik Końcówki z przedłużoną osłoną aerozolową (Matrix 7055 lub odpowiednik) do stosowania z próbkami transportowanymi na transportowym podłożu hodowlanym M4RT MicroTest (Remel, Inc.) (zestaw M4RT MicroTest BL) Blok grzejny 37 C ± 2 C Papier chłonny Rękawice jednorazowe bezpudrowe * Dokładność pipetorów musi mieścić się w zakresie 3% podanej objętości. Aby zapobiec krzyżowemu skażeniu próbki i amplikonu, należy stosować osłonę aerozolową lub końcówki dodatniego wypierania, wolne od DNazy (lub wolne od nukleazy). ** Do przygotowania próbek i kontroli należy bezwzględnie używać probówek zakręcanych, aby uniknąć rozpryśnięcia i możliwości krzyżowego skażenia próbek i kontroli. Nie należy stosować probówek z korkiem zatrzaskowym. POBIERANIE, TRANSPORT I PRZECHOWYWANIE PRÓBEK UWAGA: Ze wszystkimi próbkami należy obchodzić się jak z materiałem potencjalnie zakaźnym. Jedynie dopuszczalne próbki to: 1. Próbki moczu (mężczyzn i kobiet) transportowane w czystych pojemnikach polipropylenowych. Nie używać próbek moczu pobranych do pojemników zawierających konserwanty. 2. Wymazy z kanału szyjki macicy pobrane i transportowane na transportowym podłożu hodowlanym M4RT MicroTest (Remel, Inc.). W celu uzyskania wiarygodnych wyników testu należy przestrzegać podanych poniżej instrukcji właściwego pobierania próbek. Test nie jest przeznaczony do stosowania z próbkami pobranymi z gardła, odbytnicy ani próbkami innymi niż wskazane. Aby zagwarantować dostarczenie do badań w laboratorium próbek wysokiej jakości, próbki moczu i wymazy z kanału szyjki macicy należy przetransportować do laboratorium w praktycznie najkrótszym czasie. Nie wolno dopuścić do transportowania próbek w warunkach uniemożliwiających kontrolę temperatury. A. Pobieranie próbek Próbki moczu (mężczyzn i kobiet) UWAGA: Pacjenci muszą powstrzymywać się od oddawania moczu przez 2 godziny poprzedzające badanie. 1. Pobierz ml pierwszej porcji moczu (pierwszą część strumienia) do czystego polipropylenowego pojemnika bez środków konserwujących. 2. Zamknij pojemnik z próbką i oznacz odpowiednią etykietą. Postępuj zgodnie z laboratoryjną procedurą pobierania i transportu próbek. Próbkę można transportować do miejsca badania w temperaturze pokojowej (15 30 C). 7

8 Wymazy z kanału szyjki macicy pobrane i transportowane na podłożu M4RT MicroTest Culture Transport System (Remel, Inc.) 1. Wymazy z kanału szyjki macicy mogą być pobrane i transportowane na transportowym podłożu hodowlanym M4RT MicroTest (Remel, Inc.) o pojemności 3 ml. Po usunięciu śluzu szyjkowego należy stosować zalecane metody w celu pobrania komórek nabłonka walcowatego oraz komórek okolicy połączenia nabłonka płaskiego i walcowatego Do pobierania próbek używaj wyłącznie wacików pokrytych dakronem, rayonem lub alginianem wapnia z uchwytem wykonanym z tworzywa sztucznego lub drutu innego niż aluminium. Nie używaj wacików z drewnianą lub aluminiową rękojeścią. 3. Pozostaw waciki w podłożu transportowym. Zamknij pojemnik z próbką i oznacz odpowiednią etykietą. Postępuj zgodnie z laboratoryjną procedurą pobierania i transportu próbek. Próbkę można transportować do miejsca badania w temperaturze pokojowej (15 30 C). B. Transport próbek Próbki moczu (mężczyzn i kobiet) 1. Próbki moczu można transportować do miejsca wykonania testu w temperaturze C. Próbki moczu pozostają stabilne przez 24 godziny w temperaturze C. 2. Próbki moczu wymagające transportu do ośrodków wykonujących oznaczenie zlokalizowanych poza miejscem pobrania muszą zostać przetransportowane w ciągu jednej nocy z zagwarantowanym terminem dostawy w ciągu 24 godzin. Próbki można transportować w temperaturze C. W przypadku transportu próbek moczu w temperaturze C do czasu transportu należy je przechowywać w temperaturze 2 8 C, aby zagwarantować, że czas przechowywania w temperaturze C nie przekroczy 24 godzin. Próbki należy przesyłać zgodnie z odpowiednimi przepisami lokalnymi, stanowymi i krajowymi dotyczącymi transportu czynników etiologicznych 15. Wymazy z kanału szyjki macicy pobrane i transportowane na transportowym podłożu hodowlanym M4RT MicroTest (Remel, Inc.) 1. Wymazy transportować można do miejsca wykonania testu w temperaturze C pod warunkiem, że całkowity czas przechowywania i transportu w temperaturze C nie przekroczy 14 dni. Jeżeli transport do laboratorium opóźnia się powyżej 14 dni od czasu pobrania próbki, wymazy należy przechowywać w niskiej temperaturze. W przypadku próbek przeznaczonych do posiewu należy postępować zgodnie z zaleceniami dla hodowli (-60 C, jeśli posiewu nie wykonano w ciągu 24 godzin). 2. Wymazy wymagające transportu do ośrodków wykonujących oznaczenie zlokalizowanych poza miejscem pobrania można przesyłać w temperaturze C po pobraniu zgodnie z laboratoryjnymi procedurami transportu próbek wymazów. Próbki należy przesyłać zgodnie z odpowiednimi przepisami lokalnymi, stanowymi i krajowymi dotyczącymi transportu czynników etiologicznych 15. C. Przechowywanie próbek UWAGA: Rutynowe zamrażanie lub przedłużone przechowywanie próbek może wpływać na skuteczność testu. Próbki moczu (mężczyzn i kobiet) Próbki moczu, które nie zostaną poddane obróbce w ciągu 24 godzin od pobrania, należy przechowywać w temperaturze 2 8 C i poddać obróbce w ciągu 7 dni od pobrania. Próbki moczu, których nie można poddać obróbce w ciągu 7 dni od pobrania można przechowywać w temperaturze -20 C lub niższej przez okres do 30 dni. Wymazy z kanału szyjki macicy pobrane i transportowane na transportowym podłożu hodowlanym M4RT MicroTest (Remel, Inc.) Wymazy, które nie są badane z chwilą dostarczenia do laboratorium wykonującego oznaczenie, należy przechowywać w temperaturze C i poddać obróbce w ciągu 14 dni. Wymazy, które nie mogą być poddane obróbce w ciągu 14 dni od pobrania, należy przechowywać w temperaturze -20 C lub niższej, a następnie poddać badaniu w ciągu 30 dni od daty pobrania. 8

9 INSTRUKCJA UŻYTKOWANIA UWAGA: Szczegółowe instrukcje obsługi, informacje na temat drukowania wyników oraz interpretacji znaczników, komentarzy i komunikatów o błędzie zawierają: (1) Instrukcja obsługi analizatora COBAS TaqMan 48 do użytku z Podręcznikiem oprogramowania AMPLILINK w wersji serii 3.3 i 3.4; (2) Podręcznik oprogramowania AMPLILINK w wersji serii 3.3 do użytku z urządzeniem COBAS AmpliPrep, analizatorem COBAS TaqMan, analizatorem COBAS TaqMan 48, analizatorem COBAS AMPLICOR i aparatem cobas p 630 lub (3) Podręcznik oprogramowania AMPLILINK w wersji serii 3.4. UWAGA: Przed użyciem wszystkie odczynniki do amplifikacji i detekcji należy ogrzać do temperatury pokojowej (15 30 C). Należy wyjąć je z miejsca przechowywania o temperaturze 2 8 C co najmniej 30 minut przed użyciem. UWAGA: Próbki wymazów i moczu należy przed użyciem ogrzewać przez minut do temperatury pokojowej (15 30 C). UWAGA: Tam gdzie jest to wskazane, należy używać pipetorów z końcówkami z barierą aerozolową lub dodatnim wypieraniem. Zachować najdalej posuniętą ostrożność, aby uniknąć zanieczyszczenia. Liczba testów w serii: Każdy zestaw testu COBAS TaqMan CT, v2.0, zawiera odczynniki wystarczające na trzy serie po 16 oznaczeń każda, które wykonywać można oddzielnie lub równocześnie. W każdej serii testowej, liczącej do 22 próbek umieszczonych w zasobniku na probówki K, należy włączyć co najmniej jedno równoległe oznaczenie kontroli CT ( ) C, v2.0, oraz CT (+) C, v2.0 (patrz rozdział Kontrola jakości ). Odczynniki do amplifikacji i detekcji są pakowane w 16-testowe fiolki jednorazowego użytku. Aby jak najwydajniej wykorzystać odczynniki, próbki badane i kontrolne należy poddawać obróbce w seriach będących wielokrotnością 16. Odczynniki do przygotowania próbki są pakowane w 100-testowe butelki jednorazowego użytku. Przygotowanie próbki i kontroli A. Przygotowanie próbek, miejsce wykonywania: obszar obróbki przedamplifikacyjnej obszar przygotowania próbki Próbki moczu (mężczyzn i kobiet) 1. Na każdą próbkę chorego oznacz jedną probówkę o pojemności 2,0 ml z zakręcanym korkiem. 2. Dodaj 500 μl CT/NG URINE WASH do każdej z oznaczonych probówek. 3. Dokładnie wymieszaj mocz na mieszadle wibracyjnym (3 10 sekund). W przypadku stosowania próbek zamrożonych należy je rozmrozić w temperaturze pokojowej (15 30 C) przed mieszaniem na mieszadle wibracyjnym (próbki o objętości powyżej 2 ml należy pozostawić na noc do rozmrożenia w temperaturze 2 8 C). Kontynuuj obróbkę nawet w przypadku obecności precypitatu. Ostrożnie zdejmij korki z pojemników z moczem. Zachowaj ostrożność, aby uniknąć skażenia rękawic moczem obecnym na korku. W przypadku zanieczyszczenia rękawic przed przystąpieniem do otwarcia następnej próbki załóż czystą parę rękawic. 4. Dodaj 500 μl każdej z dokładnie wymieszanych próbek moczu chorych do odpowiednio oznaczonej probówki z odczynnikiem CT/NG URINE WASH. Użyj nowej końcówki z osłoną aerozolową dla każdej próbki. Ponownie zamknij probówki i dokładnie wymieszaj na mieszadle wibracyjnym. 5. Przez 15 minut inkubuj probówki w temperaturze 37 C. 6. Odwiruj przy prędkości x g przez 5 minut. 7. Odlej supernatant i osusz każdą probówkę oddzielnym arkuszem bibuły absorpcyjnej. 8. Używając pipetora z nową końcówką z osłoną aerozolową dla każdej z próbek, dodaj po 250 μl odczynnika CT/NG LYS do każdej probówki. Ponownie zamknij probówki i dokładnie wymieszaj na mieszadle wibracyjnym. 9. Przez 15 minut inkubuj probówki w temperaturze pokojowej (15 30 C). 10. Używając pipetora z nową końcówką z osłoną aerozolową dla każdej z próbek, dodaj po 250 μl odczynnika CT/NG DIL do każdej probówki. Ponownie zamknij probówki i dokładnie wymieszaj na mieszadle wibracyjnym. 11. Odwirowuj probówki przez 10 minut z prędkością g. 12. Przygotowane próbki można przechowywać w temperaturze pokojowej (15 30 C) przez najwyżej 2 godziny przed przeniesieniem równych objętości do probówek K lub tacek K zawierających odczynnik Master Mix. Jeżeli próbki nie będą przenoszone do probówek K lub tacek K w ciągu 2 godzin, przygotowane próbki należy przechowywać w temperaturze 2 8 C. Przygotowane próbki, przechowywane w temperaturze 2 8 C, muszą być poddane badaniu w ciągu 7 dni. 9

10 Próbki z wymazów UWAGA: Test COBAS TaqMan CT, v2.0, poddano ocenie z wykorzystaniem transportowego podłoża hodowlanego M4RT MicroTest (Remel, Inc.). Stosowanie alternatywnych podłoży transportowych musi zostać poddane walidacji przez laboratorium. 1. Sprawdź, czy probówka z transportowym podłożem hodowlanym M4RT MicroTest (Remel, Inc.) zawiera wacik. Waciki należy pozostawić w probówce z transportowym podłożem hodowlanym M4RT MicroTest (Remel, Inc.), aby uniknąć narażenia próbki na niewłaściwe warunki. Obecność wacika w probówce z transportowym podłożem hodowlanym M4RT MicroTest (Remel, Inc.) nie gwarantuje prawidłowego pobrania próbki. 2. Na każdą próbkę chorego oznacz jedną probówkę o pojemności 2,0 ml z zakręcanym korkiem. Nie należy stosować probówek z korkiem zatrzaskowym. 3. Dodaj 100 μl odczynnika CT/NG LYS do oznakowanych probówek polipropylenowych o pojemności 2 ml. 4. Wymieszaj próbki na mieszadle wibracyjnym. Jeśli próbki były przechowywane w stanie zamrożonym, rozmroź je w temperaturze pokojowej (15 30 C) przed mieszaniem na mieszadle wibracyjnym. Ostrożnie zdejmij korki z probówek z próbkami. Zachowaj ostrożność, aby uniknąć skażenia rękawic. W przypadku zanieczyszczenia rękawic przed przystąpieniem do otwarcia następnej próbki załóż czystą parę rękawic. 5. Przy użyciu pipetora z osłoną aerozolową dodaj 100 μl dobrze wymieszanej próbki do odpowiedniej probówki zawierającej CT/NG LYS. Użyj nowej końcówki z osłoną aerozolową dla każdej próbki. Ponownie zamknij probówkę i dokładnie wymieszaj na mieszadle wibracyjnym. 6. Przez 10 minut inkubuj probówki w temperaturze pokojowej (15 30 C). 7. Używając pipetora z nową końcówką z osłoną aerozolową dla każdej z próbek, dodaj po 200 μl odczynnika CT/NG DIL do każdej probówki. Ponownie zamknij probówkę i dokładnie wymieszaj na mieszadle wibracyjnym. 8. Przez 10 minut inkubuj probówki w temperaturze pokojowej (15 30 C). 9. Przygotowane próbki można przechowywać w temperaturze pokojowej (15 30 C) przez najwyżej 2 godziny przed przeniesieniem równych objętości do probówek K lub tacek K zawierających odczynnik roboczy Master Mix. Jeżeli próbki nie będą przenoszone do probówek K lub tacek K w ciągu 2 godzin, przygotowane próbki należy przechowywać w temperaturze 2 8 C. Przygotowane próbki, przechowywane w temperaturze 2 8 C, muszą być poddane badaniu w ciągu 7 dni. B. Przygotowanie kontroli, miejsce wykonywania: obszar obróbki przedamplifikacyjnej obszar przygotowania próbki UWAGA: Przygotowuj świeże kontrole robocze (Working Controls) każdego dnia, w którym wykonywane są testy. Kontroli roboczych można używać do przygotowania wielu kontroli obrobionych (Processed Controls) w ciągu dnia, lecz należy je wyrzucić pod koniec dnia. UWAGA: Odczynniki CT (+) C, v2.0, i CT ( ) C, v2.0, dołączone do zestawu testu COBAS TaqMan CT, v2.0, są przeznaczone do maksymalnie trzykrotnego przygotowania kontroli roboczych CT (+), v2.0, i CT ( ), v2.0. UWAGA: W przypadku badania zarówno wymazów, jak i próbek moczu konieczne jest przygotowanie jednego zestawu kontroli dla każdego typu próbek. Ponieważ kontrole są przygotowywane dla każdego typu próbek, zaleca się rozdzielenie różnych rodzajów próbek między różne zasobniki na probówki K. Zostanie wtedy użyty każdy zestaw kontroli swoistych dla próbek w celu walidacji określonego rodzaju próbek. Kontrole robocze: Przygotuj następujące kontrole robocze CT (+), v2.0, i CT ( ), v Używając pipetora z jałową końcówką, dodaj 1 ml CT/NG DIL do każdej z dwóch 2-mililitrowych polipropylenowych probówek z zakrętką. Oznacz jedną probówkę napisem Kontrola robocza CT (+), v2.0, a drugą Kontrola robocza CT ( ), v Przez 5 sekund mieszaj CT (+) C, v2.0, oraz CT ( ) C, v2.0, na mieszadle wibracyjnym z maksymalną prędkością. Ostrożnie zdejmij korki z probówek. Zachowaj ostrożność, aby uniknąć skażenia rękawic. W przypadku zanieczyszczenia rękawic przed kontynuacją pracy załóż czystą parę rękawic. 3. Używając nowej końcówki do pipetora z osłoną aerozolową, dodaj 100 μl CT (+) C, v2.0, do probówki oznaczonej jako Kontrola robocza CT (+), v2.0. Zamknij i przechowuj probówkę CT (+) C, v2.0, w temperaturze 2 8 C. 10

11 4. Używając nowej końcówki do pipetora z osłoną aerozolową, dodaj 100 μl CT ( ) C, v2.0, do probówki oznaczonej jako Kontrola robocza CT ( ), v2.0. Zamknij i przechowuj probówkę CT ( ) C, v2.0, w temperaturze 2 8 C. 5. Zamknij probówki kontroli roboczych i dokładnie wymieszaj na mieszadle wibracyjnym. Przechowuj w temperaturze pokojowej (15 30 C) i wyrzuć pod koniec dnia pracy. Próbki moczu: Przygotuj następujące, poddawane obróbce kontrole: CT (+), v2.0, i CT ( ), v Używając pipetora z jałową końcówką, dodaj 250 μl CT/NG LYS do każdej z dwóch 2-mililitrowych polipropylenowych probówek z zakrętką. Oznacz jedną probówkę napisem Przygotowana kontrola robocza CT (+), v2.0, a drugą Przygotowana kontrola robocza CT ( ), v Używając nowej końcówki do pipetora z osłoną aerozolową, dodaj 250 μl kontroli roboczej CT (+), v2.0, do probówki oznaczonej Przygotowana kontrola robocza CT (+), v Używając nowej końcówki do pipetora z osłoną aerozolową, dodaj 250 μl kontroli roboczej CT ( ), v2.0, do probówki oznaczonej Przygotowana kontrola robocza CT ( ), v Ponownie zamknij probówki i dokładnie wymieszaj na mieszadle wibracyjnym. Przez 10 minut inkubuj w temperaturze pokojowej (15 30 C). Przechowuj w temperaturze pokojowej (15 30 C) i wyrzuć pod koniec dnia pracy. Próbki z wymazów: Przygotuj następujące, poddawane obróbce kontrole: CT (+), v2.0, i CT ( ), v Używając pipetora z jałową końcówką, dodaj 100 μl CT/NG LYS do każdej z dwóch 2-mililitrowych polipropylenowych probówek z zakrętką. Oznacz jedną probówkę napisem Przygotowana kontrola robocza CT (+), v2.0, a drugą Przygotowana kontrola robocza CT ( ), v Używając pipetora z jałową końcówką, dodaj 100 μl transportowego podłoża hodowlanego M4RT MicroTest (Remel, Inc.) do każdej z probówek zawierających CT/NG LYS. 3. Ponownie zamknij probówki i dokładnie wymieszaj na mieszadle wibracyjnym. 4. Używając nowej końcówki do pipetora z osłoną aerozolową, dodaj 200 μl kontroli roboczej CT (+), v2.0, do probówki oznaczonej Przygotowana kontrola robocza CT (+), v Używając nowej końcówki do pipetora z osłoną aerozolową, dodaj 200 μl kontroli roboczej CT ( ), v2.0, do probówki oznaczonej Przygotowana kontrola robocza CT ( ), v Ponownie zamknij probówki i dokładnie wymieszaj na mieszadle wibracyjnym. Przez 10 minut inkubuj w temperaturze pokojowej (15 30 C). Przechowuj w temperaturze pokojowej (15 30 C) i wyrzuć pod koniec dnia pracy. Amplifikacja i detekcja UWAGA: Zasobniki na probówki K oraz uchwyt zasobnika należy przetrzeć tkaniną nieuwalniającą włókien, zwilżoną 70% roztworem izopropanolu. A. Przygotowanie odczynnika UWAGA: Główny rozcieńczalnik COBAS TaqMan CT Master Mix, v2.0 (CT MMX, v2.0), roboczy główny rozcieńczalnik (Working MMX) oraz roboczy główny rozcieńczalnik z dodaną próbką lub kontrolą są wrażliwe na światło. Chronić wymienione odczynniki przed światłem. UWAGA: Przed przygotowaniem odczynnika roboczego Master Mix odczynnik COBAS TaqMan CT Master Mix, v2.0 (CT MMX, v2.0); roztwór manganu COBAS TaqMan CT (CT Mn 2+ ) oraz kontrolę wewnętrzną COBAS TaqMan CT (CT IC) należy pozostawić do ogrzania w temperaturze pokojowej (15 30 C) przez co najmniej 30 minut. UWAGA: Przygotować roboczy odczynnik MMX po zakończeniu przygotowywania próbek i kontroli. UWAGA: Roboczy odczynnik MMX należy zużyć w ciągu 2 godzin od jego przygotowania w przypadku przechowywania go w temperaturze pokojowej (15 30 C) lub w ciągu 16 godzin od jego przygotowania w przypadku przechowywania w temperaturze 2 8 C. UWAGA: Po dodaniu obrabianych próbek i kontroli do roboczego odczynnika MMX amplifikacja powinna rozpocząć się w ciągu 90 minut. 1. Pozostaw jedną fiolkę CT MMX, v2.0, jedną fiolkę CT IC oraz jedną fiolkę CT Mn 2+ do ogrzania w temperaturze pokojowej (15 30 C) przez co najmniej 30 minut. 2. Umieść zasobnik na probówki K w uchwycie zasobnika. Włóż nowe probówki K lub nowe tace K do zasobnika K, nie dotykając bocznych ścianek probówek ani dołków tac. UWAGA: Jeśli do przebiegu testowego mają być włączone mniej niż 24 probówki, należy wypełnić probówkami następujące pozycje zasobnika: 1, 2, 5, 20, 23 i 24, tak aby obciążenie zasobnika na probówki K po umieszczeniu w termocyklerze było równomierne. 11

12 3. Jeśli jest taka potrzeba, zdejmij korki z probówek K za pomocą urządzenia do mocowania korków. Umieść korki w podręcznym uchwycie na probówki K. 4. Przygotuj roboczy odczynnik MMX w następujący sposób: Aby przygotować 16 testów, dodaj do jednej fiolki CT MMX, v2.0, 150 μl CT Mn 2+ oraz 50 μl CT IC. Zamknij buteleczkę i dokładnie wymieszaj zawartość, odwracając 10 razy. Nie wytrząsaj roboczego odczynnika MMX na mieszadle wibracyjnym. Odczynnik roboczy MMX należy chronić przed światłem i zużyć w ciągu 2 godzin (w przypadku przechowywania w temperaturze pokojowej (15 30 C)) lub w ciągu 16 godzin (w przypadku przechowywania w temperaturze 2 8 C). 5. Przenieś pipetą 50 μl roboczego odczynnika MMX do każdej probówki K lub do studzienki tacki K. UWAGA: Jeżeli poddane obróbce próbki przed amplifikacją przechowywano zamrożone, należy je rozmrozić w temperaturze pokojowej (15 30 C) i dobrze wymieszać na mieszadle wibracyjnym. Odwiruj przygotowane próbki moczu przez 10 minut przy prędkości g. UWAGA: Podczas dozowania odczynnika roboczego MMX nie wolno dotykać końcówką pipety żadnej powierzchni innej niż zamierzona probówka K lub studzienka tacki K. Jeżeli dojdzie do zetknięcia z powierzchnią zasobnika na tackę K, końcówkę należy wyrzucić, aby uniknąć wprowadzenia inhibitorów PCR. 6. Dodaj po 50 μl każdej poddanej obróbce próbki i kontroli do odpowiednich probówek K lub studzienek tacki K zawierających roboczy odczynnik MMX, wykorzystując do tego celu mikropipetor z końcówką z barierą aerozolową lub dodatnim wypieraniem. Ostrożnie wymieszaj każdą próbkę i próbę kontrolną, trzy razy nabierając do mikropipetora i wypuszczając ponownie, nie doprowadzając przy tym do tworzenia się pęcherzyków. UWAGA: Podczas dozowania poddanych obróbce próbek badanych i próbek kontrolnych nie wolno dotykać końcówką pipety żadnej powierzchni innej niż zamierzona probówka K lub tacka K. Jeżeli dojdzie do zetknięcia z powierzchnią zasobnika na tackę K, końcówkę należy wyrzucić, aby uniknąć wprowadzenia inhibitorów PCR. 7. Powtórz czynności z etapu 6 w odniesieniu do każdej próbki i poddawanej obróbce kontroli aż do przeniesienia każdej z nich do probówki K lub tacki K. Do każdej próbki badanej i kontrolnej użyj nowej końcówki. Sprawdź wzrokowo probówki w poszukiwaniu pęcherzyków i usuń je w razie konieczności. Przykryj tackę K lub zamknij probówki K, używając urządzenia do mocowania korków. Sprawdź wzrokowo, czy dodano odpowiednie objętości próbek. 8. Amplifikację należy rozpocząć w ciągu 90 minut od czasu dodania przygotowanych próbek badanych i kontrolnych do probówek K lub studzienek tacki K zawierających roboczy odczynnik MMX. 9. Na wypadek konieczności ponownego wykonania testu pozostałości każdej z przygotowanych próbek przechowuj w temperaturze 2 8 C. Wszelkie ponowne testy należy wykonać w ciągu 7 dni od przygotowania próbek. B. Ładowanie i obsługa analizatora COBAS TaqMan Włącz komputer stacji roboczej i zaloguj się do systemu operacyjnego Microsoft Windows, używając odpowiedniej nazwy użytkownika i hasła. 2. Włącz analizator COBAS TaqMan 48. Upewnij się, że urządzenie uruchamia się i jest gotowe do użytku. Jeśli nośniki K z poprzednich przebiegów testowych znajdują się nadal w którymkolwiek z termocyklerów, wyjmij je za pomocą przenośnika. 3. Uruchom na komputerze program AMPLILINK. Zaloguj się, używając odpowiedniej nazwy użytkownika i hasła. 4. Aby wprowadzić numerację próbek przeznaczonych do analizy w zasobniku na probówki K, kliknij ikonę z napisem Orders. Wybierz zakładkę z napisem Sample, następnie kliknij przycisk z napisem New i za pomocą klawiatury lub czytnika kodów kreskowych wprowadź numer porządkowy każdej próbki. Wybierz plik z definicją testu dla testu COBAS TaqMan CT, v2.0. Czynność powtórz dla każdej próbki. Kliknij przycisk Save. UWAGA: Jeśli do przebiegu testowego mają być włączone mniej niż 24 probówki, należy wypełnić probówkami następujące pozycje zasobnika: 1, 2, 5, 20, 23 i 24, tak aby obciążenie zasobnika na probówki K po umieszczeniu w termocyklerze było równomierne. 5. Wprowadzić dane dotyczące kontroli jakości, wybierając zakładkę Quality Control w oknie Orders. Kliknąć przycisk New i przy użyciu klawiatury lub czytnika kodów kreskowych wprowadzić dołączone do zestawu dane dla testu COBAS TaqMan CT, v2.0. Wprowadzić numer serii oraz datę ważności testu COBAS TaqMan CT, v2.0. Kliknąć przycisk OK. 12

13 6. Przypisz numer zasobnika na probówki K do przebiegu testu, klikając zakładkę K-Carrier w oknie Orders. W oknie K-Carrier kliknij przycisk New. W okienku na prawo od napisu K-Carrier ID wprowadź numer zasobnika zamieszczony na jego kodzie kreskowym, używając klawiatury lub czytnika kodów kreskowych. Wymagane jest zaakceptowanie wyników poprzedniego przebiegu testowego, dokonanego przy wprowadzonym tym samym numerze identyfikacyjnym (ID) zasobnika na probówki K. Po dwukrotnym użyciu na jednym analizatorze tego samego kodu kreskowego zasobnika wyniki uzyskane przy użyciu obu serii testów należy zaakceptować, zarchiwizować i usunąć, zanim będzie można ponownie wykorzystać ten sam kod kreskowy. Z panelu testowego w dolnej części okna wybrać definicję testu dla testu COBAS TaqMan CT, v2.0. Nazwy i numery wersji plików definicji testu znajdują się na karcie informacyjnej produktu, dołączonej do opakowania zestawu. 7. Na liście roboczej Worklist wybrać pierwszy wiersz w kolumnie Type (T). Zaznaczyć to pole w celu uzyskania dostępu do menu rozwijanego i wybrać wymagany typ kontroli. Następnie dwukrotnie kliknąć pole z numerem identyfikacyjnym próbki w tym samym wierszu. Wyświetli się okno LookUp Control ze wszystkimi dostępnymi kontrolami. Po wybraniu kontroli w dolnej części panelu Information po prawej stronie zostanie wyświetlony odpowiedni numer serii oraz data ważności. Powtórzyć opisaną procedurę w odniesieniu do wszystkich wymaganych kontroli. 8. W celu wprowadzenia próbek na listę roboczą Worklist dwukrotnie kliknij pierwszą pozycję (wiersz) okna informacyjnego danej próbki. Spowoduje to wyświetlenie okna Lookup Sample, zawierającego numerację przypisaną danej próbce. W celu zaznaczenia więcej niż jednego numeru porządkowego użyj klawiszy Shift + strzałek. Upewnij się, że wszystkie polecenia zostały przypisane definicji testu dla testu COBAS TaqMan CT, v Kliknij przycisk Save, aby zapisać zlecenie dla danego zasobnika probówek K. C. Amplifikacja i detekcja 1. Wybierz ikonę Systems w zakładce System; kliknij przycisk Open, aby otworzyć termocykler. Gdy w oknie Systems pokrywa termocyklera jest całkowicie uchylona i widoczny jest napis Ready to Load, przyciągnij i przytrzymaj pokrywę termocyklera w celu otwarcia urządzenia. Za pomocą przenośnika zasobników na probówki K umieść w termocyklerze załadowany zasobnik zawierający zamknięte probówki K lub tackę K z roboczym odczynnikiem Master Mix, próbkami i kontrolami. Zamknij pokrywę termocyklera. 2. Kliknij przycisk Start w oknie Systems poniżej ikony TC w celu zamknięcia pokrywy termocyklera i uruchomienia aparatu. 3. Analizator COBAS TaqMan 48 automatycznie wykonuje amplifikację i detekcję. WYNIKI (oprogramowanie AMPLILINK w wersji serii 3.3 i 3.4) Obliczanie wyników Analizator COBAS TaqMan 48 automatycznie określa, czy w próbce lub kontroli wykryto DNA CT. Analizator COBAS TaqMan 48: Określa wartość progową liczby cykli (Ct) dla DNA CT oraz DNA kontroli wewnętrznej CT. Określa, czy wykryto obecność DNA CT na podstawie wartości Ct dla DNA CT oraz DNA kontroli wewnętrznej CT. 13

14 Walidacja przebiegu testowego w oprogramowanie AMPLILINK w wersji serii 3.3 i 3.4 Sprawdź okno wyników programu AMPLILINK w wersji serii 3.3 i 3.4 lub wydruk w poszukiwaniu znaczników i komentarzy świadczących o tym, że dany przebieg testowy jest ważny. Przebieg testowy jest ważny, jeżeli kontrole testu COBAS TaqMan CT, v2.0 nie są opatrzone znacznikami. Poniższe wyniki uzyskano dla ważnego przebiegu testowego. Kontrola Wynik Interpretacja Kontrola ujemna NC Negative Wynik kontroli w zakresie Kontrola dodatnia PC Positive Wynik kontroli w zakresie Przebieg jest nieważny, jeżeli kontrole testu COBAS TaqMan CT, v2.0 są opatrzone którymkolwiek z poniższych znaczników: Kontrola ujemna CT, v2.0: Znacznik Wynik Interpretacja NC_INVALID Invalid Kontrola dodatnia, brak sygnału kontroli wewnętrznej lub sygnał poza zakresem. Kontrola dodatnia CT, v2.0: Znacznik Wynik Interpretacja PC_INVALID Invalid Kontrola ujemna lub poza zakresem, brak sygnału kontroli wewnętrznej lub sygnał poza zakresem. Jeśli przebieg testowy jest nieważny, należy powtórzyć go w całości, wraz z przygotowaniem próbek i kontrolą, amplifikacją oraz detekcją. Interpretacja wyników: Aby ocenić ważność przebiegu, należy sprawdzić na wydruku wyniki dla poszczególnych próbek w poszukiwaniu znaczników lub komentarzy. Wyniki należy zinterpretować następująco: UWAGA: Ważny przebieg może zawierać zarówno ważne, jak i nieważne próbki, zależnie od tego, jakimi znacznikami i/lub komentarzami są one opatrzone. Wyniki badania próbek interpretuje się w następujący sposób: Znacznik Wynik Interpretacja Brak znacznika CT Not Detected Nie wykryto DNA C. trachomatis. Wynik badania próbki w kierunku C. trachomatis jest prawdopodobnie ujemny. Wynik ujemny nie wyklucza zakażenia C. trachomatis, gdyż wyniki zależne są od odpowiedniego pobrania próbki, braku inhibitorów oraz obecności DNA w ilości wystarczającej do detekcji. Brak znacznika CT Detected Wykryto DNA C. trachomatis. Próbka jest dodatnia dla C. trachomatis. CNTRL_FAIL INVALID Kontrola(e) nieważna(e). Przygotować inną próbkę oryginalnie pobranego materiału i powtórzyć przebieg testowy. S_INVALID Invalid Wynik badania próbki jest nieważny. Aby wyświetlić szczegóły oznaczenia, kliknąć prawym przyciskiem myszy komentarz oznaczenia. Przygotować jeszcze jedną próbkę z oryginalnie pobranego materiału i powtórzyć test. Jeżeli oryginalna próbka nie jest dostępna, należy pobrać nową. (1) (1) Więcej informacji na temat komentarzy znaczników i szczegółowych znaczników można znaleźć w rozdziale Znaczniki Podręcznika oprogramowania AMPLILINK w wersji serii 3.3 lub

15 KONTROLA JAKOŚCI Każda seria testowa musi zawierać co najmniej po jednej kontroli ( ) COBAS TaqMan CT, v2.0, i kontroli (+) COBAS TaqMan CT, v2.0, umieszczonych w każdym zasobniku na probówki K. Tak jak w przypadku każdej nowej procedury laboratoryjnej, nowy operator powinien rozważyć zastosowanie dodatkowych kontroli za każdym razem, kiedy przeprowadzany jest test, do czasu osiągnięcia dużego stopnia zaufania dotyczącego poprawności przeprowadzania testu. Nie ma wymagań co do położenia kontroli w zasobniku na probówki K. Sprawdzić wydruk wyników serii w poszukiwaniu oflagowań i komentarzy świadczących o tym, że dana seria jest ważna. Kontrola ujemna Kontrola CT ( ) C, v2.0, musi dać wynik NC Negative. W przeciwnym razie cała seria jest nieważna. Należy powtórzyć cały proces (przygotowanie próbek i kontroli, amplifikację i detekcję). Jeśli wyniki kontroli CT ( ) C, v2.0, nadal są nieważne, należy skontaktować się z miejscowym przedstawicielstwem firmy Roche w celu uzyskania pomocy technicznej. Kontrola dodatnia Kontrola CT (+) C, v2.0, musi dać wynik PC Positive. W przeciwnym razie cała seria jest nieważna. Należy powtórzyć cały proces (przygotowanie próbek i kontroli, amplifikację i detekcję). Jeśli wyniki kontroli CT (+) C, v2.0, znajdują się nadal poza przypisanym zakresem, należy skontaktować się z miejscowym biurem firmy Roche w celu uzyskania pomocy technicznej. Kontrola CT (+), v2.0, zawiera około 20 kopii/test sekwencji plazmidowego DNA C. trachomatis. Jest to blisko czterokrotnie większa ilość niż minimalny poziom detekcji dla stosowanego testu, który określono za pomocą analizy Poissona. Amplifikacja i detekcja kontroli CT (+), v2.0, potwierdza dokonanie procesu amplifikacji. Kontrola CT (+), v2.0, nie monitoruje wydajności amplifikacji ani poziomu detekcji stosowanego testu. Kontrola wewnętrzna Kontrola wewnętrzna ma za zadanie identyfikować próbki zawierające inhibitory polimerazy. Stosowanie kontroli wewnętrznej nie eliminuje całkowicie występowania wyników fałszywie ujemnych. ŚRODKI OSTROŻNOŚCI DOTYCZĄCE PROCEDURY Jak w przypadku każdej procedury testowej, dla prawidłowego przeprowadzenia badania kluczowe znaczenie ma zachowanie zasad dobrej praktyki laboratoryjnej. Z uwagi na wysoką czułość analityczną niniejszego testu należy zachować wyjątkową ostrożność, aby zapewnić czystość zestawów odczynników oraz mieszanin do amplifikacji. Należy ściśle monitorować czystość wszystkich odczynników. Należy usunąć wszystkie podejrzane odczynniki. OGRANICZENIA METODY 1. Do badań należy używać tylko określonych rodzajów próbek. Test COBAS TaqMan CT, v2.0, poddano ocenie z użyciem próbek wymazów z kanału szyjki macicy, pobranych na transportowe podłoże hodowlane M4RT MicroTest (Remel, Inc.) oraz próbek moczu kobiet i mężczyzn, który pobrano bez zastosowania środków konserwujących. Nie oceniano stosowania testu w przypadku innych rodzajów próbek, a ich użycie może powodować wyniki fałszywie ujemne lub fałszywie dodatnie. 2. Detekcja C. trachomatis jest zależna od liczby mikroorganizmów obecnych w próbce. Wpływ na nią mogą mieć metody pobrania próbek, czynniki zależne od pacjenta (tj. wiek, wywiad w kierunku chorób przenoszonych drogą płciową, obecność objawów), stadium zakażenia i/lub szczep wywołującej zakażenie C. trachomatis. 3. Wyniki fałszywie ujemne mogą się pojawiać na skutek hamowania polimerazy. Test COBAS TaqMan CT, v2.0, uzupełniono o kontrolę wewnętrzną CT, aby umożliwić identyfikację poddanych obróbce próbek zawierających substancje, które mogą zakłócać amplifikację PCR w stopniu większym niż 20 kopii/test. 4. Częstość występowania zakażenia chlamydiami w populacji może wpływać na skuteczność testu. Dodatnie wartości predykcyjne ulegają zmniejszeniu przy badaniu populacji z niską częstością zachorowań lub osób, u których nie występuje ryzyko zakażenia. Ponieważ częstość występowania C. trachomatis w niektórych populacjach lub grupach pacjentów może być niewielka, odsetek wyników fałszywie dodatnich, wynoszący 4 5%, może przekraczać odsetek wyników rzeczywiście dodatnich, co sprawia, że wartość predykcyjna dodatniego wyniku badania jest bardzo mała. Niektórzy pacjenci rzeczywiście zakażeni nie zostaną zidentyfikowani na podstawie oznaczenia pojedynczej próbki, dlatego też nie można określić ani domniemać na podstawie danych klinicznych odsetka wyników fałszywie dodatnich. Odsetek wyników fałszywie dodatnich może zależeć od przeszkolenia personelu, umiejętności laboranta, obchodzenia się z odczynnikami i próbkami oraz innych podobnych czynników, występujących w danym laboratorium. 5. Wiarygodność wyników zależy od sposobu pobrania, transportu, przechowywania i przygotowania próbek. Nie zdefiniowano w pełni czynników wynikających z przechowywania próbek. 15

16 6. Dodanie do Master Mixu enzymu AmpErase umożliwia selektywną amplifikację docelowego DNA; jednak aby uniknąć skażenia odczynników, konieczne jest stosowanie dobrej praktyki laboratoryjnej i dokładne przestrzeganie procedur wyszczególnionych w niniejszej instrukcji. 7. Niniejszego testu nie wolno używać do oceny skuteczności leczenia lub jej braku. 8. Jak w przypadku każdego testu diagnostycznego, wyniki testu COBAS TaqMan CT, v2.0, należy inter - pretować, biorąc pod uwagę wszystkie dostępne wyniki badania klinicznego i badań laboratoryjnych. 9. Produktu tego powinny używać wyłącznie osoby wykwalifikowane w technikach PCR. 10. Odpowiedniość próbek (w przypadku wymazów) potwierdzić można tylko na drodze wizualizacji pod mikroskopem komórek nabłonka walcowatego w próbkach. 11. Nie zaleca się stosowania testu COBAS TaqMan CT, v2.0, do oceny podejrzenia nadużyć seksualnych ani w innych wskazaniach sądowo-lekarskich. 12. W każdym przypadku gdy wynik fałszywie dodatni lub fałszywie ujemny może prowadzić do niekorzystnych następstw medycznych, socjalnych lub psychologicznych, zaleca się wykonanie dodatkowych badań. 13. Wyniki testu COBAS TaqMan CT, v2.0, mają charakter jakościowy. Nie stwierdzono korelacji między wielkością piku wyniku dodatniego testu COBAS TaqMan CT, v2.0, a liczbą komórek C. trachomatis w zakażonej próbce. Niniejszy test wykrywa wyłącznie C. trachomatis, nie wykrywa natomiast C. psittaci, C. pneumoniae ani C. pecorum. 14. Zaleca się wykonywanie oznaczeń próbek moczu mężczyzn i kobiet w teście COBAS TaqMan CT, v2.0, przy użyciu losowo pobranych próbek pierwszej porcji moczu (określanej jako pierwsze ml strumienia moczu). Nie oceniano wpływu innych zmiennych, takich jak pierwsza porcja moczu w porównaniu ze środkową, próbki pobrane po kąpieli itd. 15. Nie oceniano również wpływu innych potencjalnych zmiennych, takich jak upławy, stosowanie tamponów, irygacje itd., ani zmiennych związanych z pobieraniem wymazu. 16. Test COBAS TaqMan CT, v2.0, nie zastępuje badania szyjki macicy ani pobierania próbek z kanału szyjki macicy w diagnostyce zakażeń moczowo-płciowych. Występujące u chorych zapalenie szyjki macicy, zapalenie cewki moczowej, zakażenia dróg moczowych lub pochwy może mieć inne przyczyny lub może być wywoływane przez równoczesne zakażenie innymi patogenami. 17. Niniejszego produktu można używać tylko łącznie z analizatorem COBAS TaqMan Obecność inhibitorów PCR może prowadzić do uzyskiwania wyników fałszywie ujemnych lub nieważnych. 19. Poniżej zamieszczono listę niektórych substancji wpływających na wynik testu. Obecność śluzu w próbkach pobranych z szyjki macicy może hamować PCR i prowadzić do fałszywie ujemnych wyników testu. Aby zapewnić optymalną skuteczność testu, zaleca się stosowanie próbek wolnych od śluzu. Przed pobraniem próbki należy użyć gąbki lub dużego gazika, aby usunąć wydzielinę szyjki macicy i upławy 16. Próbki zawierające powyżej 7% (v/v) krwi mogą dawać wyniki fałszywie dodatnie. 20. Mutacje w obrębie wysoce konserwatywnych regionów DNA plazmidu utajonego lub chromo - somalnego DNA C. trachomatis, z którymi łączą się primery i/lub sonda używane w teście, choć rzadkie, mogą spowodować niewykrycie obecności bakterii w tym przypadku. 21. Z uwagi na różnice pomiędzy technologiami zaleca się, aby przed zmianą stosowanych metod użytkownik przeprowadził w laboratorium badanie korelacji stosowanych metod w celu określenia jakościowych różnic występujących pomiędzy nimi. OCENA DZIAŁANIA W BADANIACH NIEKLINICZNYCH Swoistość analityczna: Swoistość testu COBAS TaqMan CT, v2.0, poddano ocenie, dodając DNA komórek z hodowli, hodowli wirusowych lub plazmidowych konstruktów do odczynników do przygotowania próbek CT/NG. Próbki następnie testowano za pomocą procedury testu COBAS TaqMan CT, v2.0. Badano mikroorganizmy izolowane z dróg moczowych. W przypadku żadnego spośród poniższych drobnoustrojów czy wirusów nie stwierdzono dodatniego wyniku badania przy użyciu testu COBAS TaqMan CT, v2.0: Achromobacter xerosis Lactobacillus acidophillus Acinetobacter Iwoffi Lactobacillus brevis Acinetobacter calcoaceticus Lactobacillus crisptus Acinetobacter sp. genospecies 3 Lactobacillus lactis lactis Actinomyces isrealii Lactobacillus oris 16

17 Aerococcus viridans Aeromonas hydrophila Agrobacterium radiobacter Alcaligenes faecalis Bacillus thuringiensis Bacillus subtilis Bacteriodes fragilis Bacteriodes caccae Bifidobacillus longum Bifidobacterium adolescentis Branhamella catarrhalis Brevibacterium linens Candida albicans Chlamydia psittaci Chlamydia pneumoniae Chromobacter violaceum Citrobacter freundii Clostridium innocuum Clostridium perfringens Corynebacterium genitalium Corynebacterium xerosis Cryptococcus neoformans Deinococcus radiopugnans Derxia gummosa Wirus Epstein-Barr Eikenella corrodens Enterobacter cloacae Enterococcus avium Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Erysipelothrix rhusiopathiae Escherichia coli Ewingella americana Flavobacterium meningosepticum Gardnerella vaginalis Gemella haemolysans Gemella morbillorum Haemophilus influenzae Haemophilus ducreyi Wirus Herpes simplex 1 Wirus Herpes simplex 2 Ludzki wirus brodawczaka typu 16 Ludzki wirus brodawczaka typu 18 Kingella kingae Klebsiella pneumoniae ss ozaenae Lactobacillus parabuchnerri Lactobacillus vaginalis Lactococcus lactis cremoris Legionella bozemanii Legionella pneumophila Leuconostoc paramesenteroides Micrococcus luteus Moraxella osloensis Morganella morganii Mycobacterium smegmatis Mycoplasma hominis Neisseria elongata Neisseria gonorrhoea Neisseria mucosa Neisseria perflava Neisseria polysaccharea Pasteurella maltocida Pediococcus acidilactica Peptostreptococcus magnus Peptostreptococcus productus Prevotella bivia Prevotella corporis Prevotella intermedia Propionibacterium acnes Proteus mirabilis Providencia stuartii Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas putida Rahnella aquatilis Salmonella minnesota Salmonella typhimurium Serratia denitrificans Serratia marcescens Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Streptococcus agalactiae Streptococcus anginosus Streptococcus bovis Streptococcus dysgalatia Streptococcus equinis Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes Streptococcus salivarius Treponema pallidum Vibrio parahaemolyticus Yersinia enterocolitica Czułość analityczna: Oczyszczone DNA W przypadku określania czułości analitycznej oczyszczonego DNA test COBAS TaqMan CT, v2.0, cechuje się możliwością detekcji w sposób powtarzalny ( 95% wyników dodatnich) 5 lub więcej kopii oczyszczonego DNA C. trachomatis na reakcję PCR. Liczbę wykorzystanych w tym eksperymencie kopii DNA C. trachomatis oszacowano za pomocą analizy Poissona. Granica wykrywalności: Komórki C. trachomatis nienależące do odmian Granicę wykrywalności testu COBAS TaqMan CT, v2.0 określono przez analizę rozcieńczeń komórek C. trachomatis hodowanych na transportowym podłożu hodowlanym M4RT MicroTest (Remel, Inc.) oraz w prawidłowym ludzkim moczu. Analizowano sześć członów paneli dla każdego typu matrycy. Ogółem przeprowadzono 144 równoległe oznaczenia na stężenie dla każdego typu matrycy. Wartości graniczne dla wyników ujemnych przeanalizowano przy liczbie powtórzeń wynoszącej

18 Wyniki tego badania, przedstawione w tabeli 1, wskazują, że za pomocą analizy probitowej test COBAS TaqMan CT, v2.0 umożliwiał wykrycie C. trachomatis w spodziewanych stężeniach 2,1 IFU/ml w przypadku transportowego podłoża hodowlanego M4RT MicroTest (Remel, Inc.) i 1,2 IFU/ml w przypadku moczu. Ze względu na zmienność liczby ciał wtrętowych w hodowli C. trachomatis liczba żywych bakterii C. trachomatis nie jest bezpośrednio związana z ilością nadającego się do amplifikacji docelowego materiału CT. Tabela 1 Granica wykrywalności testu COBAS TaqMan CT, v2.0, dla komórek C. trachomatis nienależących do odmian Matryca Stężenie panelu (IFU/ml) Stężenie panelu (IFU/PCR) Średnia piku CT Średnia piku IC Całkowita liczba N wyników ważnych Trafienia dodatnie % dodatnich M4RT 8 0,1 37,7 36, ,0 M4RT 4 0,05 38,8 36, ,0 M4RT 2 0,025 40,2 36, ,7 M4RT 1 0,012 40,7 36, ,6 M4RT 0,5 0,006 40,9 36, ,7 M4RT 0 0 brak danych 36, ,0 Matryca Stężenie panelu (IFU/ml) Stężenie panelu (IFU/PCR) Średnia piku CT Średnia piku IC 95% wartość probitowa: 2,1 IFU/ml 95% przedział ufności: 1,8 2,7 Całkowita liczba N wyników ważnych Trafienia dodatnie % dodatnich Mocz ,6 36, ,0 Mocz 4 0,2 37,8 36, ,3 Mocz 2 0,1 38,6 36, ,0 Mocz 0,5 0,025 40,3 35, ,9 Mocz 0,25 0, ,4 36, ,4 Mocz 0 0 brak danych 35, ,0 95% wartość probitowa: 1,2 IFU/ml 95% przedział ufności: 0,9 1,7 Granica wykrywalności: Komórki C. trachomatis nvct (odmiana szwedzka) Granicę wykrywalności testu COBAS TaqMan CT, v2.0 określono przez analizę rozcieńczeń komórek C. trachomatis nvct hodowanych na transportowym podłożu hodowlanym M4RT MicroTest (Remel, Inc.) oraz w prawidłowym ludzkim moczu. Analizowano sześć poziomów paneli dla każdego typu matrycy. Ogółem przeprowadzono 144 równoległe oznaczenia na stężenie dla każdego typu matrycy. Wartości graniczne dla wyników ujemnych przeanalizowano przy liczbie powtórzeń wynoszącej 72. Zastosowano 7 10-krotny wskaźnik korekcji w celu dostosowania końcowego wyniku analizy probitowej dla skompensowania różnic w kopiach docelowych między genem ompa (1 kopia na komórkę) i plazmidem utajonym (od 7 do 10 kopii na komórkę). Wyniki tego badania, przedstawione w tabeli 2, wskazują, że za pomocą analizy probitowej test COBAS TaqMan CT, v2.0 umożliwiał wykrycie C. trachomatis nvct (odmiana szwedzka) w stężeniach od 35,7 do 51,0 IFU/ml w przypadku transportowego podłoża hodowlanego M4RT MicroTest (Remel, Inc.) (średnio 43,3 IFU/ml) oraz od 14,7 do 21 IFU/ml w przypadku moczu (średnio 17,9 IFU/ml). Ze względu na zmienność liczby ciał wtrętowych w hodowli C. trachomatis liczba żywych bakterii nie jest bezpośrednio związana z ilością nadającego się do amplifikacji docelowego materiału CT. 18

19 Matryca Stężenie panelu (IFU/ml) Tabela 2 Granica wykrywalności testu COBAS TaqMan CT, v2.0, dla komórek C. trachomatis nvct (odmiana szwedzka) Stężenie panelu (IFU/PCR) Średnia piku CT Średnia piku IC Całkowita liczba N wyników ważnych Trafienia dodatnie % dodatnich M4RT 8 0,1 38,4 36, ,9 M4RT 4 0,05 39,8 36, ,4 M4RT 1 0,125 40,1 36, ,7 M4RT 0,5 0,006 40,6 36, ,6 M4RT 0,25 0,003 40,8 36, ,8 M4RT 0 0 brak danych 36, ,0 Wartość probitowa 95% (nieskorygowana) Wartość probitowa 95% (nr kopii docelowej z użyciem 7-krotnego wskaźnika korekcji) Wartość probitowa 95% (nr kopii docelowej z użyciem 10-krotnego wskaźnika korekcji) Wartość probitowa 95% (nr kopii docelowej z użyciem uśrednionego wskaźnika korekcji) Matryca Stężenie panelu (IFU/ml) Stężenie panelu (IFU/PCR) 5,1 IFU/ml 95% przedział ufności 3,9 7,2 35,7 IFU/ml 95% przedział ufności 27,3 50,4 51 IFU/ml 95% przedział ufności ,3 IFU/ml 95% przedział ufności 33,2 61,2 Średnia piku CT Średnia piku IC Całkowita liczba N wyników ważnych Trafienia dodatnie % dodatnich Mocz 20 1,0 35,6 36, ,0 Mocz 4 0,2 37,3 36, ,3 Mocz 1 0,05 39,9 36, ,3 Mocz 0,25 0, ,6 36, ,3 Mocz 0,125 0, ,9 36, ,1 Mocz 0 0 brak danych 35, ,0 Wartość probitowa 95% (nieskorygowana) Wartość probitowa 95% (nr kopii docelowej z użyciem 7-krotnego wskaźnika korekcji) Wartość probitowa 95% (nr kopii docelowej z użyciem 10-krotnego wskaźnika korekcji) Wartość probitowa 95% (nr kopii docelowej z użyciem uśrednionego wskaźnika korekcji) 2,1 IFU/ml 95% przedział ufności 1,5 3,0 14,7 IFU/ml 95% przedział ufności 10,5 21,0 21,0 IFU/ml 95% przedział ufności 15,0 30,0 17,9 IFU/ml 95% przedział ufności 12,8 25,5 19

20 Reprezentatywność Test COBAS TaqMan CT, v2.0, może wykrywać pojedynczą IFU na reakcję PCR dla wszystkich serowarów C. trachomatis. Oznaczone w sposób ilościowy hodowle ATCC 15 różnych serowarów C. trachomatis rozcieńczono w transportowym podłożu hodowlanym M4RT MicroTest (Remel, Inc.) i prawidłowym moczu ludzkim do stężeń odpowiednio 80 IFU/ml i 20 IFU/ml. Stężenia te odpowiadają wejściowej wartości równej 1 IFU/PCR dla obu typów matrycy. Za pomocą testu COBAS TaqMan CT, v2.0, poddano obróbce dwadzieścia dwa (22) powtórzenia każdego z typów matrycy dla każdego serowaru. Wszystkie 15 serowarów wykryto z odsetkiem wyników dodatnich równym 100% dla każdego typu matrycy. Odtwarzalność Aby ocenić odtwarzalność testu COBAS TaqMan CT, v2.0, badano dwa panele czteroelementowe: jeden przygotowany na transportowym podłożu hodowlanym M4RT MicroTest (Remel, Inc.), a drugi w prawidłowym moczu ludzkim. Panele przygotowano z oznaczonej ilościowo hodowli ATCC C. trachomatis i przechowywano w stanie zamrożenia do temperatury 80 C. Człony paneli przygotowano dla stężeń CT wynoszących 0, 40, 80 i 120 IFU/ml w przypadku próbek na transportowym podłożu hodowlanym M4RT MicroTest (Remel, Inc.) i dla stężeń 0, 10, 20 i 40 IFU/ml w przypadku próbek moczu. Odtwarzalność oceniano dla różnych serii odczynników i różnych przebiegów aparatu (zmian obsługi). Każdy operator wykonywał badania przez okres 5 dni przy użyciu każdej z trzech serii odczynników. W tabeli 3 zestawiono 2700 wyników z tego badania dla poddanych obróbce próbek na transportowym podłożu hodowlanym M4RT MicroTest (Remel, Inc.), natomiast wyniki poddanych obróbce próbek moczu są przedstawione w tabeli 4. Wyniki ujemne uzyskano dla 100% ze 270 CT-ujemnych próbek każdej macierzy. Całkowitą odtwarzalność dla transportowego podłoża hodowlanego M4RT MicroTest (Remel, Inc.) i próbek moczu zestawiono odpowiednio w tabelach 3 i 4. Dla obu matryc wszystkie CT-dodatnie elementy panelu w 100% uzyskały w badaniu wyniki dodatnie. Wartości współczynników zmienności dla pików CT były mniejsze lub równe 2,3% dla próbek na transportowym podłożu hodowlanym M4RT MicroTest (Remel, Inc.) oraz mniejsze lub równe 4,2% w przypadku próbek moczu, co wskazuje na dobrą odtwarzalność jakościowych wyników testu. Tabela 3 Całkowita odtwarzalność wyników dla komórek C. trachomatis na transportowym podłożu hodowlanym M4RT MicroTest (Remel, Inc.) Liczba kopii badanych CT IFU/ml Całkowita liczba ważnych oznaczeń 0 IFU/ml 40 IFU/ml 80 IFU/ml 120 IFU/ml % wyników dodatnich 0% 100% 100% 100% Średnia piku CT 0 35,3 34,3 33,7 Wartość minimalna 0 32,5 31,3 31,4 Wartość maksymalna 0 39,1 37,1 37,8 Odchylenie standardowe 0 0,79 0,74 0,79 Współczynnik zmienności 0 2,2% 2,2% 2,3% 20