ĆWICZENIE III Temat I: Wpływ czynników fizycznych i chemicznych na drobnoustroje c.d. 1. Wpływ temperatury na bakterie obserwacja hodowli Escherichia coli i Bacillus subtilis założonych na poprzednim ćwiczeniu. Część praktyczna Obserwacja hodowli E. coli i B. subtilis założonych na poprzednich ćwiczeniach. Oznaczenie intensywności wzrostu hodowli pasteryzowanych i nie pasteryzowanych badanych szczepów na podstawie oceny stopnia zmętnienia hodowli w porównaniu do kontrolnej pożywki jałowej. Ocenę intensywności wzrostu hodowli wpisać do poniższej tabeli.. wzrost + brak wzrostu - Pasteryzowane Intensywność wzrostu Nie pasteryzowane E. coli B. subtilis 2. Skuteczność działania środków dezynfekcyjnych i detergentów odczytanie doświadczenia założonego na poprzednim ćwiczeniu. Część praktyczna Porównanie wzrostu kolonii wyrosłych na płytkach Petriego po wykonaniu odcisków palca. Zwrócić uwagę na liczbę kolonii i ich różnorodność (barwę, wielkość, wypukłość powierzchni, linia brzegów). Na podstawie obserwacji makroskopowej określić skuteczność działania mydła i alkoholu. Narysować i opisać płytkę z odciskami palców, zanotować wnioski. Ocena morfologii kolonii - cechy kolonii. Przy ocenie morfologii kolonii bierze się pod uwagę następujące cechy: 1. Wzrost kolonii: powierzchniowy, podpowierzchniowy, wgłębny,
2. Wielkość kolonii: mała - o średnicy do 1 mm, średnia - o średnicy 1-3 mm, duża - o średnicy powyżej 3 mm. 3. Kształt kolonii: 4. Profil kolonii: a). punktowa, b). okrągła, c). rizoidalna, d). nieregularna, e). strzępiasta. a). płaski, b). lekko wypukły, c). silnie wypukły, d). stożkowaty, e). wypukły z powierzchnią brodawkowatą, f). wrastający w podłoże, g). kraterowaty. 5. Brzeg kolonii: 6. Przejrzystość kolonii: przejrzysta, nieprzejrzysta, półprzejrzysta a). regularny, b). falisty, c), d), e), j). nieregularny, f), g), h), i). rozlany, strzępiasty
7. Fluorescencja kolonii - obecna lub brak. 8. Barwa kolonii - obejmuje obecność pigmentu lub jego brak (kolonia bezbarwna), intensywność zabarwienia, zabarwienie otoczenia kolonii związane z dyfuzją barwnika do podłoża; 9. Struktura kolonii ziarnista (przy dotknięciu wyczuwalna ziarnistość), krucha, pylista (przy dotknięciu rozpada się), włóknista (przy podnoszeniu widoczne włókna), skórzasta (zwarta i trudna do rozmazania) mazisto-kremowa (ciągnąca się) 10. Zapach kolonii - obecny lub kolonia bez zapachu, określa się intensywność zapachu i czy jest charakterystyczny Temat II: Wybrane metody stosowane do prowadzenia hodowli drobnoustrojów. Tlen stanowi jeden z czynników selekcjonujących zespoły drobnoustrojów i aktywujących, bądź też hamujących rozwój określonych ich grup. Ma on oczywiście wpływ na przebieg procesów biochemicznych, prowadzonych przez fizjologicznie różne grupy drobnoustrojów w środowiskach naturalnych lub sztucznie wytworzonych. Biorąc pod uwagę wpływ tlenu na drobnoustroje, można je podzielić na kilka grup (wg. Gołębiowskiej). Bezwzględne tlenowce drobnoustroje, dla których tlen jest czynnikiem niezbędnym nie tylko dla wzrostu i rozwoju, lecz także dla utrzymania się przy życiu. Do takich drobnoustrojów należą np. autotroficzne bakterie utleniające amoniak do azotanów. Do bezwzględnych tlenowców zalicza się jednak i takie organizmy, które wprawdzie nie mogą rosnąć i rozwijać się bez udziału tlenu, ale zachowując żywotność mogą przetrwać pewien okres w środowisku o niskiej zawartości tlenu. Do takich organizmów należy większość drobnoustrojów glebowych. Mikroaerofile czyli względne tlenowce, stanowią grupę pokrewną tlenowcom bezwzględnym. Są one bardzo rozpowszechnione w przyrodzie, a zwłaszcza w glebie. Rosną i rozwijają się najlepiej wtedy, gdy stężenie tlenu w środowisku jest niskie. Względne beztlenowce drobnoustroje, które mogą żyć w obecności lub przy braku tlenu wykorzystując do procesów utleniania tlen wolny lub inny substrat energetyczny. Do tej grupy zalicza się takie organizmy jak drożdże, które mogą oddychać zarówno tlenowo, jak i w warunkach beztlenowych fermentując wtedy cukry. Względnymi beztlenowcami są też niektóre gatunki bakterii fotosyntetyzujących. Bezwzględne beztlenowce drobnoustroje, których wzrost jest hamowany nawet przez małe ilości tlenu, prawdopodobnie ze względu na nieodwracalne utlenienie przenośników elektronów i wytwarzanie się toksycznych nadtlenków np. H 2 O 2. Do tej grupy należą niektóre gatunki Clostridium. Jest oczywiste, że tak jak przy innych podziałach drobnoustrojów na grupy fizjologiczne i w tym przypadku trudno wyraźnie je rozgraniczyć. Tlenowce bezwzględne i względne, mikroaerofile i beztlenowce
mogą bytować i rozwijać się w dość różnych warunkach w zależności nie tylko od stopnia natlenienia, środowiska, lecz także od innych czynników ekologicznych. 1. Hodowle prowadzone w warunkach tlenowych pokaz płynnych hodowli stacjonarnych i wytrząsanych Penicillium sp. lub Aspergillius sp. Bardzo liczna grupa drobnoustrojów wymaga do wzrostu i rozwoju dostępu tlenu (lub powietrza). Hodowle takich drobnoustrojów prowadzi się na wytrząsarkach w celu napowietrzania hodowli. Wytrząsarka wyróżnia się dwa typy: o ruchu posuwisto-zwrotnym z regulowaną amplitudą drgań (na zdjęciu obok) rotacyjne, z regulowanym skokiem drgań Aerator jest to aparat do hodowli tlenowców. Działanie jego polega na doprowadzeniu tlenu z zewnątrz przez zestaw filtrów bakteriologicznych zapobiegających zakażeniu hodowli. Metody hodowli drobnoustrojów tlenowych dzieli się na: powierzchniowe: na podłożach płynnych (np. hodowla na brzeczce, bulionie) i podłożach stałych (np. hodowla drobnoustrojów na skosie i na płytce Petriego). wgłębne tylko na podłożach płynnych. 2. Metody stosowane do prowadzenia hodowli drobnoustrojów w warunkach beztlenowych. Drobnoustroje beztlenowe, dla których obecność tlenu jest szkodliwa należy hodować w środowisku pozbawionym powietrza. Warunki beztlenowe możemy uzyskać następującymi metodami: fizycznymi biologicznymi chemicznymi mieszanymi Metody fizyczne Bakterie beztlenowe można hodować w urządzeniach zwanych anaerostatami, gdzie powietrze zastępuje się gazem obojętnym, np. dwutlenkiem węgla lub azotem. Inną metodą jest hodowla na podłożu Wilsona-Blaira, gdzie na zestalone podłoże Wilsona-Blaira, z zaszczepionym uprzednio materiałem, wylewa się cienką warstwę agaru wodnego, odcinającego dostęp tlenu. W metodach probówkowych jako warstwę odcinającą
dostęp tlenu można zastosować również płynną, jałową parafinę, po uprzednim usunięciu tlenu z pożywki przez 15-20-minutowe gotowanie jej na łaźni wodnej. Anaerostaty są to urządzenia w których powietrze zastępuje się mieszaniną różnych gazów lub wytwarza się w nich próżnię. Zamiast gazu w anaerostatach można również stosować mieszaninę pochłaniającą tlen złożoną z ziemi okrzemkowej, węglanu potasowego. Metody chemiczne Najczęściej są stosowane w hodowlach probówkowych z użyciem związków chemicznych pochłaniających tlen: pyrogallolu, węglanu potasu, ziemi okrzemkowej. Po wykonaniu wysiewu drobnoustrojów na skosie, część korka z waty wystającą nad brzeg probówki należy odciąć, wcisnąć na ok. l cm w głąb probówki i nasączyć 0,5 cm 3 20% kwasu pyrogallolowego i 0,5 cm 3 nasyconego roztworu węglanu sodu lub wapnia. Następnie probówkę natychmiast zamknąć korkiem gumowym, by odciąć dopływ powietrza z zewnątrz. Pyrogallol w warunkach alkalicznych pochłania tlen zawarty w probówce, stwarzając w ten sposób warunki beztlenowe. Metody biologiczne Wymienić tu można metodę płytek Fortnera, polegającą na zaszczepieniu pożywki w płytce (obok siebie) szczepami bakterii tlenowych i beztlenowych, np. rodzajów Pseudomonas i Clostridium. Po posiewie brzegi płytki uszczelnia się plasteliną, odcinając dostęp tlenu do wnętrza płytki. Drobnoustroje tlenowe, wykorzystując do swojego rozwoju tlen, stwarzają sprzyjające warunki do rozwoju bakterii beztlenowych. Metody mieszane Są połączeniem wymienionych wcześniej metod. Wśród nich można wyróżnić hodowlę na pożywce wg. Wrzoska, w której tlen zawarty w podłożu jest absorbowany przez kawałki wątroby, a od tlenu pożywka jest oddzielona warstwą płynnej, jałowej parafiny. Część praktyczna a). Hodowle w probówkach w wysokim słupie pożywki zalanej warstwą parafiny demonstracja. Jest to metoda fizyczna hodowli drobnoustrojów beztlenowych. Warunki beztlenowe uzyskuje się zakładając hodowle w probówkach przy wysokim słupie pożywki i odcina się dodatkowo dostęp tlenu przez wprowadzenie na pożywkę płynnej warstwy jałowej parafiny. b). Hodowle płynne z tkankami roślinnymi zastosowanymi jako absorbenty tlenu demonstracja. Dodatek tkanek roślinnych w podłożu powoduje absorpcje tlenu z podłoża. Można dodawać również do podłoży tkanki zwierzęce. Przykładem podłoża z tkankami zwierzęcymi jest podłoże wg. Wrzoska. c). Płytki Fortnera demonstracja.
Jest to metoda biologiczna hodowli drobnoustrojów beztlenowych. Polegająca na zaszczepieniu (na jednej płytce) szczepu drobnoustrojów tlenowych i beztlenowych. Pożywkę na płytce dzieli się na połowę, wysiewając na jedną część szczep beztlenowy, a na drugą szczep tlenowy. Po posiewie brzegi płytki zalepia się plasteliną odcinając dopływ tlenu. Drobnoustroje tlenowe rozwijając się zużywają tlen zawarty wewnątrz płytki i stwarzają tym samym korzystne warunki dla rozwoju beztlenowców. d). Zastosowanie anaerostatów do prowadzenia hodowli w warunkach beztlenowych demonstracja. e). Zastosowanie metody roll tube do otrzymywania czystych szczepów drobnoustrojów beztlenowych demonstracja. Metoda ta służy do otrzymywania czystych szczepów drobnoustrojów beztlenowych. Do jałowych probówek wlewamy niewielką ilość jałowego podłoża (ok. 2-3 ml.) następnie zaszczepiamy drobnoustrojami. Probówkę wprowadzamy w ruch obrotowy aż podłożę zestali się na ściankach. Do wnętrza probówki wprowadzamy gaz obojętny np. azot zastępując nim powietrze.