Normy ilościowe i jakościowe dotyczące zawartości drobnoustrojów w produktach spożywczych. KATEDRA I ZAKŁAD MIKROBIOLOGII LEKARSKIEJ WUM W WARSZAWIE Dominika Lachowicz
Źródła zanieczyszczenia mikrobiologicznego żywności. O Gleba: rezerwuar laseczek tlenowych (Bacillus spp.), beztlenowych (Clostridium spp.) oraz grzybów ale także bakterii z rodziny Enterobacteriaceae: Escherichia coli, Proteus, chorobotwórczych Salmonella, Shigella oraz innych pałeczek - Pseudomonas, Alcaligenes, O Woda: naturalna mikroflora wody nie stanowi zagrożenia dla zdrowia, ale może być zanieczyszczona przez np. Yersinia enterocolitica, Vibrio parahaemolyticus, florę kałową, O Surowiec, O Człowiek: drobnoustroje stanowiące florę stałą lub przejściową zasiedlające skórę, błony śluzowe, drogi oddechowe i przewód pokarmowy.
Prawo żywnościowe. O Rozporządzenie nr 178/2002/WE z dnia 28 stycznia 2002 r. ustanowiło ogólne zasady i wymagania prawa żywnościowego, powołało Europejski Urząd ds. bezpieczeństwa żywności oraz ustanowiło procedury w zakresie bezpieczeństwa żywności. O Zgodnie z definicją Międzynarodowej Komisji ds. Wymagań Mikrobiologicznych dla Żywności zagrożenie mikrobiologiczne to nieakceptowanie zanieczyszczenie, wzrost lub przeżywalność drobnoustrojów w żywności, które mogłyby spowodować jej zepsucie lub wytwarzanie i utrzymywanie się w niej toksyn, enzymów, amin biogennych lub innych produktów ich metabolizmu.
Badanie mikrobiologiczne żywności. O Dla celów profilaktycznych - ochrona zdrowia konsumenta przez niedopuszczenie do spożycia produktów zawierających drobnoustroje chorobotwórcze i ich metabolity lub nadmiernie zanieczyszczonych drobnoustrojami saprofitycznymi. O W dochodzeniu epidemiologicznym - w sytuacji zatrucia pokarmowego.
Cel badania mikrobiologicznego żywności. 1. ustalenie poziomu ogólnej liczby drobnoustrojów saprofitycznych 2. określenie stanu sanitarnego żywności za pomocą wskaźnikowych bakterii typu fekalnego (miano coli) 3. badanie obecności bakterii chorobotwórczych w celu orzeczenia czy dana żywność nie zagraża zdrowiu konsumentów O bakterie grupy coli: grupa tlenowych i beztlenowych bakterii, patogennych, nie tworzących przetrwalników, zasiedlających zwykle jelito grube człowieka i zwierząt, jako wskaźnikowa traktowana jest pałeczka E. coli
Zasady pobierania próbek do badań mikrobiologicznych. 1. próbki do badań pobiera osoba upoważniona 2. próbki pobierane są losowo (próbki reprezentatywne dla całej partii towaru) 3. pobranie odpowiedniej liczby próbek, o liczbie próbek decyduje: częstość występowania w niej drobnoustrojów chorobotwórczych, jednolitość partii w przypadku jednorazowego produktu, dobrze wymieszanego w procesie produkcyjnym
Urządzenie do ekstrakcji, mieszania, homogenizacji lub dyspersji. służy do przygotowywania próbek żywności do analizy (pojemność 80 do 400 ml) próbki i rozcieńczalnik wkładane są do urządzenia w szczelnych plastikowych torebkach do przygotowania większości próbek wystarczy 30 sek. próbka do badania pobierana jest z torby po sedymentacji osadu torby typu Stomacher Stomacher 400
Badanie poszczególnych grup drobnoustrojów z uwzględnieniem wymagań wzrostowych. 1. Temperatura wzrostu: O bakterie mezofilne (30-37 C) O bakterie psychrofilne (0-10 C) żywność pochodzenia morskiego (ryby, mięczaki), a także przechowywana w warunkach chłodniczych O bakterie termofilne (55-65 C) 2. Wymagania tlenowe O bakterie tlenowe lub względnie beztlenowe O bakterie bezwzględnie beztlenowe (Clostridium spp.) 3. Substrat O bakterie lipolityczne (tłuszcze masło) podłoże z tributyryną lub Tween 80 O bakterie proteolityczne (białka mleko, mięso, ryby) podłoże Fraziera z kazeiną lub żelatyną O bakterie amylolityczne ( skrobia mąka) podłoże Waksmana ze skrobią
Ogólne metody badania mikrobiologicznego żywności. 1. Ocena w preparacie mikroskopowym: sporządza się preparaty odciskowe barwione (ryby, wędliny) bezpośrednio z produktu lub z osadu po odwirowaniu 2. Oznaczanie ogólnej liczby drobnoustrojów saprofitycznych: metoda płytkowa na agarze odżywczym, agarze z glukozą, agarze z mlekiem. Posiewy w dwóch powtórzeniach z każdego rozcieńczenia. 3. Oznaczanie bakterii z grupy coli i E. coli: do oceny sanitarnej żywności. Pożywki zawierające laktozę- pożywka BLB z zielenią brylantową lub pożywka EC z żółcią i laktozą a także pożywka z wodą peptonową do oznaczania indolu. 4. Wykrywanie gronkowców: na pożywce Baird-Parkera wykrywa się czarno zabarwione kolonie gronkowców (redukcja telurynu potasu do wolnego telurynu). Potwierdza się następnie w teście na katalazę i koagulazę. 5. Wykrywanie beztlenowych laseczek przetrwalnikujących redukujących siarczany (IV): hodowlę prowadzi się na pożywce Wrzoska zalanej parafiną. Wykonuje się kontrolę tlenową i badanie na redukcję siarczanu sodu (na podłożu Wilson-Blaira). 6. Wykrywanie bakterii z rodzaju Salmonella: wykrycie pałeczek wymaga przednamnożenia, następnie wykonuje się posiew na podłoża różnicujące (SS, HEKTOKEN)
Zakażenia i zatrucia pokarmowe. Według Światowej Organizacji Zdrowia zakażenia i zatrucia pokarmowe są ostrymi zachorowaniami o charakterze zakaźnym, inwazyjnym lub toksycznym, którym towarzyszą najczęściej objawy żołądkowo-jelitowe (nudności, wymioty, bóle brzucha i biegunki). Podział: O intoksykacje choroby wywoływane działaniem toksyn (w żywności może już nie być żywych drobnoustrojów) O infekcje wynik dostania się do organizmu żywych komórek drobnoustrojów i ich rozwoju w organizmie człowieka, O toksykoinfekcje infekcje, podczas których patogeny uwalniają w organizmie gospodarza toksyny O infekcje inwazyjne infekcje, podczas których czynniki infekcyjne przedostają się do tkanek, narządów lub całych układów organizmu.
MID MINIMAL INFECTIOUS DOSE (minimalna dawka infekcyjna). Liczba komórek drobnoustrojów, która wywołuje objawy chorobowe.
Najważniejsze czynniki wywołujące u ludzi zatrucia i zakażenia pokarmowe. Drobnoustrój Okres inkubacji Okres choroby MID Salmonella spp. 12-48 h 1-7dni 10 2-10 6 Escherichia coli 12-72h 3-19 dni 10 6-10 7 Shigella spp. 3-5 dni 2 tygodnie 10-10 3 Vibrio parahaemolyticus 2-48h 1-4 dni 10 5-10 7 Staphylococcus aureus 2-6 h 6-24 h enterotoksyna gronkowcowa 1-25μg Clostridium botulinum Typ A, B, E, F 12-96 h zgon po 1-8 dniach lub rekonwalescencja od 6-8 miesięcy 0,005-1 μg toksyny Clostridium perfringens 8-24h 12-24 h 10 5-10 7 Bacillus cereus 1-18 h 12-24 h >10 6 Campylobacter 2-5dni 2-10 dni 10 2-10 5 Yersinia enterocolitica 5-10 dni kilkanaście dni 10 8-10 9 Enterococcus 3-22 h 24-48 h 10 9
Najważniejsze czynniki wywołujące u ludzi zatrucia i zakażenia pokarmowe cd. Gatunek Najczęściej zakażane Dawka infekcyjna Uwagi Bacillus cereus mięso, mleko, warzywa, ryby dorośli > 10 6 komórek dzieci > 10 5 komórek Powoduje zatrucia pokarmowe dwiema różnymi enterotoksynami. Objawy zatrucia zwykle nie są groźne. Campylobacter jejuni drób, mleko, woda 10 2-10 3 komórek Najczęstsza przyczyna zakażeń pokarmowych w Stanach Zjednoczonych. Clostridium botulinum kiełbasa, mięso, konserwy warzywne nanogramy toksyny Groźne dla życia zatrucia wywołuje wytworzona przez bakterie neurotoksyna jad kiełbasiany. Toksyna jest inaktywowana w wysokiej temperaturze. Escherichia coli (szczepy enterokrwotoczne) niedosmażone, mielone mięso wołowe, mleko 10-10 2 komórek Produkują toksynę SLT bardzo podobną do toksyny Shiga. Zatrucia mogą prowadzić też do poważnych uszkodzeń nerek. Listeria monocytogenes mleko, sery, lody, surowe warzywa, kiełbasa, drób, mięso, ryby 10 2-10 5 komórek Może namnażać się w warunkach chłodniczych. Może powodować niebezpieczne zakażenia płodu, zwykle śmiertelne.
Najważniejsze czynniki wywołujące u ludzi zatrucia i zakażenia pokarmowe cd. Gatunek Najczęściej zakażane Dawka infekcyjna Uwagi Salmonella enterica subsp.enterica (różne serowary) Shigella sp. surowe mięso, drób, jajka, mleko, nabiał, ryby, soki owocowe sałatki, surowe warzywa, mleko i nabiał, drób, woda 10 5-10 7 komórek ok. 10 komórek Jedne z najczęstszych przyczyn toksykoinfekcji pokarmowych na całym świecie. Jest przyczyną poważnych toksykoinfekcji -czerwonki bakteryjnej. Produkuje dwa rodzaje toksyn: enterotoksynę i tzw. toksynę Shiga. Staphylococcus aureus mięso, drób, ciastka z kremem, jajka, sałatki, mleko i nabiał mikrogram enterotoksyny Zatrucia powodują wytworzone przez gronkowce enterotoksyny, które nie są inaktywowane w wysokich temperaturach. Vibrio cholerae zanieczyszczona woda, owoce morza ok. 10 6 komórek Wywołuje cholerę. Związana jest z niskim poziomem higieny. Obecnie występuje głównie w krajach Trzeciego Świata. Yersinia enterocolitica Yersinia pseudotuberculosis mięso, ostrygi, ryby, surowe mleko 10 8-10 9 komórek Potrafią się namnażać w niskich temperaturach. Objawy choroby są czasami bardzo podobne do zapalenia wyrostka robaczkowego, który jest w związku z tym niepotrzebnie nieznana usuwany.
Zalecana literatura dotycząca tematu Mikrobiologia techniczna tom 2, Redakcja naukowa: Zdzisława Libudzisz, Krystyna Kowal, Zofia Żakowska, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2008, Teoria i ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej i technicznej, Wanda Duszkiweicz-Reinhard, Roman Grzybowski, Eugeniusz Sobczak, Wydawnictwo SGGW, Warszawa 2003, Wybrane zagadnienia z mikrobiologii żywności, pod redakcją Stanisława Błażejaka i Iwony Gientki, Wydawnictwo SGGW, Warszawa 2010.