WPŁYW KOMÓREK HODOWLI NAMALWA NA REPLIKACJĘ HSV-1

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2009, 61: 197-202 Magdalena Wieczorek, Bogumiła Litwińska WPŁYW KOMÓREK HODOWLI NAMALWA NA REPLIKACJĘ HSV-1 Zakład Wirusologii NIZP-PZH w Warszawie Kierownik: doc. dr hab. B. Litwińska Określono wpływ limfoblastoidalnych komórek Namalwa na hamowanie replikacji wirusa opryszczki typu 1 (HSV-1) w hodowli in vitro. Stwierdzono, że nawarstwienie komórek Namalwa, na hodowlę komórek CV-1 i MDBK tuż przed zakażeniem HSV-1 zwiększa liczbę komórek przeżywających po zakażeniu. Wpływ komórek Namalwa na przeżycie komórek po zakażeniu HSV-1 zależy od liczby dodanych komórek oraz ich czasu podania (przed zakażeniem czy po zakażeniu). Zakażenia wirusem opryszczki typu 1 (herpes simplex virus 1-HSV-1) należą do najczęściej występujących wśród populacji ludzkiej i charakteryzują się dużą różnorodnością. Mogą to być pospolite zmiany skórno-śluzowe, ale także zagrażające życiu zakażenia ośrodkowego układu nerwowego. Wirus dostaje się do organizmu człowieka najczęściej przez błonę śluzową jamy ustnej wywołując zakażenie pierwotne, które zwykle kończy się ustaleniem latencji w komórkach zwojów nerwowych. W późniejszych okresach, pod wpływem różnych czynników, wirus może ulegać reaktywacji i drogą aksonów przenosić się do miejsca pierwotnego zakażenia, gdzie dochodzi do zakażenia produktywnego. Komórki w odpowiedzi na zakażenie wirusowe (także wirusem HSV-1) produkują interferon alfa (IFN alfa). Jest on wydzielany przez większość komórek organizmu, jego połączenie się z receptorem prowadzi do aktywacji ścieżki sygnału Jak/Stat i indukcji w komórce stanu przeciwwirusowego. Brak wrażliwości komórki na zakażenie związane jest z ekspresją takich białek jak: kinaza białkowa R, syntetaza oligoizoadeninowa, czy RNaza L. HSV-1 nie zostaje bierny wobec obronnych mechanizmów organizmu i w czasie zakażenia produktywnego koduje białka, które hamują działanie IFN (3, 5, 6, 7) W komórkach hodowanych in vitro HSV-1 namnaża się, powodując powstawanie komórek wielojądrzastych i ostatecznie lizę zakażonej hodowli, co wiąże się z uwolnieniem następnego pokolenia cząstek zakaźnych. Zakres wrażliwości linii komórkowych i hodowli pierwotnych na HSV-1 jest rozległy. Nie we wszystkich hodowlach komórkowych zakażenie kończy się lizą, w hodowli komórek linii MDBK (hodowla komórek nerki bydlęcej) po lizie komórek pierwotnie zakażonych, hodowla z czasem odbudowuje się. HSV efektywnie stymuluje komórki linii MDBK do syntezy IFN, który powoduje zahamowanie replikacji wirusa (1, 2) Podobnie zakażenie komórek linii Namalwa (limfocyty B unieśmiertelnione wirusem Epstaina-Barr), linii która po stymulacji produkuje IFN alfa w bardzo dużych ilościach,

198 M. Wieczorek, B. Litwińska Nr 2 prowadzi do szybkiego wzrostu miana wirusa w hodowli, a następnie do jego gwałtownego spadku, wiąże się to ze szczytem w produkcji IFN, który gwałtownie hamuje rozwój zakażenia (11) Celem niniejszej pracy było zbadanie wpływu komórek Namalwa na rozwój zakażenia HSV-1 w hodowli komórek CV-1 (hodowla komórek nerki małpy zielonej), hodowli standardowo używanej do namnażania wirusa opryszczki, która łatwo ulega zakażeniu i podlega całkowitej lizie prowadzącej do uwolnienia wirusa o wysokim mianie, oraz w hodowli komórek MDBK wrażliwej na działanie IFN alfa. MATERIAŁ I METODY Szczep wirusa: W badaniach użyto trzeciego pasażu szczepu McIntyre wirusa HSV-1 (ATTC) namnożonego i mianowanego na hodowli CV-1. Hodowle komórkowe. CV-1, hodowla ciągła komórek nerki małpy zielonej, prowadzona była w podłożu Eagleۥa (MEM) z dodatkiem płodowej surowicy bydlęcej 10%, penicyliny 100 U/ml i streptomycyny - 100 µg/ml, w temperaturze 37ºC i w atmosferze 5% CO 2 ; MDBK, hodowla ciągła komórek nerki bydlęcej, prowadzona była w podłożu Eagleۥa z dodatkiem pirogronianu sodu 1mM oraz aminokwasów 0,1 mm (EMEM) z dodatkiem płodowej surowicy bydlęcej 10%, penicyliny 100U/ml i streptomycyny - 100 µg/ml, w temperaturze 37ºC i w atmosferze 5% CO 2 ; Namalwa, hodowla ciągła ludzkich limfocytów B unieśmiertelnionych EBV, prowadzona była w podłożu RPMI 1640 z dodatkiem płodowej surowicy bydlęcej 10%, penicyliny 100U/ml i streptomycyny - 100 µg/ml, w temperaturze 37ºC i w atmosferze 5% CO 2. Wpływ liczby komórek Namalwa na zahamowanie replikacji HSV-1. Komórki CV-1 i MDBK trypsynowano i wysiewano na mikropłytki (2 x 10 4 komórek/dołek Ryc. 1. Wpływ stężenia kokultury komórek hodowli Namalwa na zahamowanie replikacji HSV-1 w hodowli komórek CV-1 i MDBK.

Nr 2 Komórki Namalwa w replikacji HSV-1 199 Procent zahamowania (%) Ryc.2. Czas dodania kom. hodowli Namalwa w stosunku do momentu zakaŝenia (godz.) Wpływ czasu dodania komórek hodowli Namalwa na zahamowanie replikacji HSV-1 w hodowli komórek CV-1 i MDBK. w 100 µl) a następnie inkubowano 24 godz. Po inkubacji na hodowlę nawarstwiano 100 µl zawiesinowej hodowli komórek Namalwa w odpowiedniej gęstości, a następnie dodawano 50µl zawiesiny wirusa HSV-1 o mianie 10 5,6 TCID 50 /ml. Po 48 godz. inkubacji odpłukiwano nawarstwioną hodowlę komórek Namalwa i następnie przy użyciu testu MTT określano wpływ komórek Namalwa na zahamowanie replikacji. Procent zahamowania został obliczano na podstawie wzoru: (OD x -OD wirus )/(OD kom -OD wirus )x100%, gdzie OD x to wartość absorbancji hodowli zakażonej HSV-1 i nawarstwionej komórkami Namalwa, OD kom to wartość absorbancji hodowli komórek niezakażonych, a OD wirus to wartość absorbancji hodowli zakażonej HSV-1 kontrola wirusa. Wpływ czasu podania komórek Namalwa na zahamowanie replikacji HSV-1. Komórki CV-1 i MDBK trypsynowano i wysiewano na mikropłytki (2 x 10 4 komórek/dołek w 100 µl) a następnie inkubowano 24 godz. Po inkubacji hodowlę zakażano 50 µl zawiesiny wirusa o mianie 10 5,6 TCID 50 /ml oraz na hodowlę nawarstwiano 100 µl zawiesinowej hodowli komórek Namalwa w stężeniu 8 x 10 4 komórek/dołek. Zawiesinę komórek Namalwa dodawano według następującego schematu: jedną godz. przed zakażeniem, w czasie zero (tuż przed zakażeniem), jedną, dwie i trzy godz. po zakażeniu. Po 48 godz. inkubacji odpłukiwano nawarstwioną hodowlę komórek Namalwa i następnie przy użyciu testu MTT określano wpływ komórek Namalwa na zahamowanie replikacji, procent zahamowania obliczano analogicznie jak w doświadczeniu powyżej. Test MTT. Do hodowli zakażonych komórek na mikropłytkach, po okresie inkubacji z zawiesiną komórek Namalwa i odpłukaniu nawarstwionych komórek, do dołków płytki dodawano 100 µl podłoża MEM z MTT w stężeniu 0,5 mg/ml. Po inkubacji (2 godz. w 37ºC, 5%CO 2 ) dodawano 100 µl 0,5M SDS w 45% wodnym roztworze DMF. Po wymieszaniu i 2 godz. inkubacji odczytywano absorbancję (OD) przy długości fali 570 nm.

200 M. Wieczorek, B. Litwińska Nr 2 WYNIKI Wyniki przedstawiono na dwóch rycinach. Rycina 1 przedstawia zależność pomiędzy ilością dodanych komórek hodowli Namalwa a zahamowaniem replikacji wirusa. Po 48- godzinnej inkubacji komórek zakażonych wirusem opryszczki z hodowlą komórek Namalwa szacowano zahamowanie replikacji HSV-1 na podstawie wyników testu MTT. Hamujący wpływ komórek hodowli Namalwa zależał od gęstości nawarstwionych komórek. Istotne statystycznie zahamowanie replikacji wirusa obserwowano tylko w przypadku stężenia nawarstwionych komórek powyżej 10 4 kom. na dołek, czyli w przypadku stężenia: 8 x 10 4 kom./dołek i 4 x 10 4 kom/dołek. Niezależnie od rodzaju hodowli komórkowej (MDBK, CV-1) zastosowanej do namnożenia wirusa obserwowano podobny efekt. Rycina 2 przedstawia zależność pomiędzy momentem dodania komórek hodowli Namalwa do hodowli CV-1 lub MDBK a zahamowaniem replikacji HSV-1. Komórki hodowli Namalwa dodawano przed zakażeniem, w momencie zakażenia oraz po zakażeniu. Analogicznie jak w powyższym doświadczeniu po 48-godzinnej inkubacji określano zahamowanie replikacji na podstawie wyników testu MTT. Hamujący wpływ komórek hodowli Namalwa obserwowano gdy komórki te były dodane na jedną godzinę przed zakażeniem, a także w momencie zakażenia, natomiast nie obserwowano statystycznie istotnej inhibicji replikacji gdy hodowlę komórek Namalwa nawarstwiano 2 lub 3 godz. po zakażeniu, czyli po czasie gdy większość cząstek wirusa wniknęła do komórek. Bardzo podobne wyniki uzyskano dla hodowli komórek CV-1 i MDBK. DYSKUSJA Przedstawione wyniki wykazały, że obecność komórek hodowli limfablastoidalnej Namalwa wpływa na zahamowanie replikacji wirusa opryszczki typu 1. Nawarstwienie komórek Namalwa, na hodowlę komórek CV-1 i MDBK tuż przed zakażeniem HSV-1 zwiększa liczbę komórek przeżywających po zakażeniu. Wpływ komórek Namalwa na zahamowanie replikacji HSV-1 zależy od liczby dodanych komórek oraz ich czasu podania (przed zakażeniem czy po zakażeniu). Im wcześniej zostaną podane komórki hodowli Namalwa oraz im będzie ich więcej tym zahamowanie replikacji jest większe. Przebieg zakażenia wirusem opryszczki kontrolowany jest przez główne elementy układu immunologicznego tj.: interferon, komórki NK oraz limfocyty T i B. W pierwszych dniach po zakażeniu działa IFN alfa/beta bez udziału limfocytów T i B czy komórek NK. IFN alfa/beta i IFN gamma współdziałają w procesie eliminacji wirusa bez udziału limfocytów. W przeciwieństwie do zakażenia pierwotnego zakażenie utrzymujące się podlega kontroli przez limfocyty B i T oraz komórki NK (10) Komórki hodowli Namalwa to limfocyty B unieśmiertelnione wirusem Epstaina-Barr, które po stymulacji produkują IFN alfa w dużych ilościach (8). Wielokrotnie opisywano właściwości przeciwwirusowe IFN alfa w stosunku do HSV-1 (6). Nasze wcześniejsze prace wykazały jednak, że komórki hodowli Namalwa są także miejscem namnażania się wirusa opryszczki. Miano wirusa opryszczki rośnie w kolejnych dniach po zakażeniu do momentu kiedy poziom IFN alfa w płynie znad hodowli nie osiągnie najwyższej wartości (czwarta doba po zakażeniu). Następnie miano wirusa raptownie spada co wydaje się być skorelowane z syntezą IFN alfa (11)

Nr 2 Komórki Namalwa w replikacji HSV-1 201 Dość popularne są prace opisujące antywirusowe właściwości wielu substancji pochodzenia naturalnego lub otrzymanych na drodze syntezy chemicznej, ostatnio także shrna i sirna. Modelowym wirusem względem którego określa się działanie tych substancji jest wirus opryszczki typu 1. Natomiast jest bardzo niewiele informacji dotyczących zahamowania replikacji HSV-1 in vitro pod wpływem komórek i opisane przypadki donoszą jedynie o hamującym wpływie komórek NK oraz limfocytów T (9). Ciekawe wydają się obserwacje, które wykazały, że inkubacja limfocytów T a także limfocytów B z fibroblastami zakażonymi HSV-1 prowadzi do apoptozy limfocytów (4). Badając wpływ zakażonych fibroblastów na limfocyty B zastosowano hodowlę komórek Ramos, do unieśmiertelnienia której nie użyto wirusa EBV, a tym samym nie zawierającą genomu EBV. Wirus ten jak wiadomo ma właściwości antyapoptyczne. Kokultura komórek zakażonych HSV-1 z komórkami hodowli Namalwa symuluje użycie limfocytów B nie podlegającym procesom apoptozy. WNIOSKI 1. Komórki hodowli limfablastoidalnej Namalwa, nawarstwione na hodowlę komórek CV-1 lub MDBK zakażoną HSV-1, hamują replikację wirusa w tychże komórkach. 2. Wpływ komórek Namalwa na zahamowanie replikacji HSV-1 zależy od ilości dodanych komórek oraz ich czasu podania (przed zakażeniem czy po zakażeniu). M. Wieczorek, B. Litwińska THE INFLUENCE OF NAMALWA CELLS ON INHIBITION OF HSV-1 REPLICATION SUMMARY The main immunological elements that control infection with herpes simplex virus type 1 include interferon, NK cells, and specific T and B cells. The aim of his study was to determine the influence of Namalwa cells (B cell immortalized by EBV) which produce IFN alpha in large amount on inhibition of HSV-1 replication in CV-1 and MDBK cells. Inhibition of HSV-1 replication was measured by MTT assay. Addition Namalwa cells to CV-1 or MDBK cells infected HSV-1 inhibited virus replication. Degree of inhibition was connected with amount of added cells and with time of addition (before infection or after infection). The highest inhibition of HSV-1 replication showed Namalwa cells added one hour before infection (72% for CV-1 infected HSV-1 and 68% for MDBK infected HSV-1). PIŚMIENNICTWO 1. Barreca C, O`Hare P. Characterization of a potent refractory state and persistence of herpes simplex virus 1 in cell culture. J Virol 2006; 80: 9171-80. 2. Barreca C, O`Hare P. Suppression of herpes simplex virus in MDBK cells via the interferon pathway. J Virol 2004; 78: 8641-53. 3. Chee AV, Roizman B. Herpes simplex virus 1 gene products occlude the interferon signaling pathway at multiple sites. J Virol. 2004; 78: 4185-96. 4. Han J-Y, Sloan DD, Aubert M i inni: Apoptosis and antigen receptor function in T and B cells following exposure to herpes simplex virus. Virology 2007; 359: 253-63.

202 M. Wieczorek, B. Litwińska Nr 2 5. Melroe GT, DeLuca NA, Knipe DM. Herpes simplex virus 1 has multiple mechanisms for blocking virus-induced interferon production. J Virol 2004; 78: 8411-20. 6. Samuel CE. Antiviral actions of interferons. Clin Microbiol Rev 2001; 14: 778-809. 7. Sen GC. Viruses and interferons. Annu Rev Microbiol 2001; 55: 255-81. 8. Shuttleworth J, Morser J, Burke DC. Treatment of Namalwa cells with butyrate or 5`-bromodeoxyuridine (BedUrd) before induction with Sendai virus caused an increase in the production of both interferon. J Gen Virol 1982; 58: 25-35. 9. Yasukawa M, Kobayashi Y. Inhibition of herpes simplex virus replication in vitro by human cytotoxic T cell clones and natural killer cell clones. J Gen Virol 1985; 66: 2225-9. 10. Vollstedt S, Arnold S, Schwerdel C i inni: Interplay between alpha/beta and gamma interferons with B, T, and natural killer cells in the defense agains herpes simplex virus type 1. J Virol 2004; 78: 3846-50. 11. Wieczorek M, Litwińska B. Synthesis of interferon alpha in culture of Namalwa cells after infection of herpes simplex virus type 1. Annales UMCS Sectio DDD 2008, 28: 163-7. Otrzymano: 26 V 2009 r. Adres Autora: 00-791 Warszawa, ul. Chocimska 24, Zakład Wirusologii NIZP-PZH, e-mail: mrechnio@pzh.gov.pl