Techniki zakładania i prowadzenia hodowli. Andrzej Wójcik awojcik@gmx.net

Transkrypt

1 Techniki zakładania i prowadzenia hodowli Andrzej Wójcik awojcik@gmx.net

2 Zakładanie hodowli Hodowla narządu Hodowla wycinka tkanki Hodowla komórek dysocjowanych Hodowla narządopodobna Zachowanie struktury histologicznej Komórki wyrastają z pierwotnego eksplantatu tworząc rozrosty Komórki osiadają na powierzchni płytki tworząc kolonie Komórki hodowane na zrębie imitującym macierz zewnątrzkomórkową Według: R.I. Freshney, Culture of animal cells: a manual of basic techniques, 5th edition

3 Zakładanie hodowli i rozrost komórek (według Hayflick i Moorhead 1961)

4 Źródła: Zakładanie hodowli Komórki limfatyczne Krew obwodowa (limfocyty) Krew pępowinowa (komórki macierzyste) Szpik kostny Nowotwory układu limfatycznego Komórki rosnące jako monowarstwa (fibroblasty) Komórki rosnące w zawiesinie (HL-60) Wysięk u myszy

5 Zakładanie hodowli Narząd / wycinek tkanki Siekanie na drobne kawałki Pierwotny eksplantant Dysagregacja mechaniczna np. sitko, strzykawka ostre pipetowanie Zimna trypsyna (izolacja oszędzająca) Dysagregacja enzymatyczna Ciepła trypsyna (izolacja ostra) inaktywacja w surowicy Kolagenaza (izolacja oszczędzająca) Hodowla pierwotna Odzysk komórek przez wirowanie Hodowla wtórna Rozrost pasażowanie Wtórny eksplantant Linia komórkowa

6 Zakładanie hodowli Rozrost komórek z eksplantatu czerniaka ludzkiego 3 dni po eksplantacji 7 dni po eksplantacji Miejsce po eksplantacie Źródło: R.I. Freshney, Culture of animal cells: a manual of basic techniques, 5th edition

7 Zakładanie hodowli Dysagregacja enzymatyczna Kadheryny Integryny Zależne od obecności wapnia Dysagregacja przy pomocy EDTA (chelator metali, np. wapnia) Glikoproteiny błon komórkowych Fibronektyna, laminy Trypsyna Dyspaza Kolagenaza EDTA: ethylenediaminetetraacetic acid = kwas wersenowy Inaktywowana przez surowicę płodową Trypsyna: proteaza ludzka wytwarzana przez trzustkę Dyspaza: niespecyficzna proteaza bakteryjna Kolagenaza: specyficzna proteaza bakteryjna rozkładająca kolagen

8 Hodowanie komórek pasażowanie Wylać pożwykę Dodać trypsynę rozpuszczoną w ciepłym PBS Potrząsać aż komórki się odkleją Dodać surowicę PBS: Phosphate buffered saline = buforowany fozjologiczny roztwór soli Przenieść do próbówki Wirować kilka razy, myjąc pożywką Policzyć w hemacytometrze Wysiać w odpowiedniej gęstości

9 pasażowanie Źródło: R.I. Freshney, Culture of animal cells: a manual of basic techniques, 5th edition

10 Pompa Elektrody Ω Pasażowanie Jak liczyć komórki? Pomiar oporności Otwór dyszy Podstawa szkła nakrywkowego Hemocytometr Szkło nakrywkowe Komora głębokość 0,1 mm Komórki martwe nie dają sygnału Błękit trypanu barwi komórki martwe! 1 mm Dysza Licznik Coultera Pojemnik z zawiesiną komórek C = N V C = gęstość N = liczba V = objętość 1 mm V = 0,1 mm 3

11 Pasażowanie Jak liczyć komórki? C1 = / ml h = 24 C1 = / ml T D = 13,65 h

12 Skład pożywki Sole nieorganiczne Węglowodany Aminokwasy Witaminy oraz lipidy Kwasytłuszczowe Peptydy i proteiny Surowica Hodowla komórek pożywka i stężenie ph Odpowiednie ciśnienie osmotyczne i ph Optymalne ph = 7,4 inkubator 5% CO 2 Bufor chemiczny: HEPES 2- - CO HCO 3 3 Czerwień fenolowa wskaźnik ph ph = 7,4 6,8 7,4 8,0 CO 2 ph

13 Hodowla komórek pożywki i buforowane roztwory solne Skład pożywki Sole nieorganiczne Węglowodany Aminokwasy Witaminy oraz lipidy Kwasytłuszczowe Peptydy i proteiny Surowica Skład soli buforowanej Sole nieorganiczne Glukoza (Surowica) Najczęściej używane pożywki: MEM Minimal Essential Medium DMEM Dulbecco s Minimal Essential Medium F12 RPMI 1640 McCoy s Fisher s Ham's F-10 Najczęściej używane roztwory sole BSS = balanced salt solution: Earl s BSS Dulbecco s BSS Różne wersje, np. dodatek L-glutaminy bufor HEPES Wybór na podstawie doświadczenia Dostępne jako: Roztwory gotowe Roztwory stężone Proszek Używane do mycia komórek lub eksperymentów nie wymagających hodowli. Trzymać w +4 0 C

14 Wyjaławianie pożywki przez filtrację (niezbędne po rozpuszczeniu sproszkowanej pożywki w wodzie) Sączki. średnica porów: 0,22 µm

15 Hodowla komórek - surowica Surowica bydlęca calf serum/ bovine serum - BS Surowica płodowa fetal bovine serum FBS Surowica końska Horse serum HoS Trzymać w C jak najrzadziej rozmrażać Zawiera niezbędne do hodowli: Białka (albumina) Czynniki wzrostu (zwłaszcza FBS!) Hormony Inaktywacja Heat inactivation Polega na trzymaniu surowicy przez 30 min w temperaturze 56 0 C (łaźnia wodna) Cel: inaktywacja układu dopełniacza osłabienie virusów i mykoplasmy Bo zawsze się tak robiło

16 Hodowla komórek limfoidalnych hodowla w miękkiej agarozie Metoda używana do klonowani komórek limfoidalnych. Metoda alternatywna: hodowla w mikropłytkach wyciąganie klonów z pojedynczych komórek Kolonie komórek TK6 hodowanych w miękkiej agarozie

17 Hodowla komórek pożywki bez surowicy Wady związane z używaniem surowicy: Zmienność między płodami Stosunkowo krótki okres ważności: ~ roku Koszt Wady związane z używaniem pożywki bez surowicy: Nie działa tak dobrze jak pożywka z surowicą

18 Hodowla komórek transformacja i immortalizacja komórek Co to znaczy transformacja komórkowa? Komórki transformowane mogą posiadać wybrane lub wszystkie cechy: Cecha komórek macierzystych Immortalizacja (nieograniczona zdolność do podziałów komórkowych) Upośledzony rozrost: utrata zahamowania kontaktowego w hodowli lub tkance Złośliwość (malignancy): zdolność wytwarzania przerzutów Niestabilność genetyczna: Wzmożone występowanie aberracji chromosomowych co prowadzi do akumulacji mutacji i zmiany ploidalności (ilości DNA) Cecha komórek zarodka w fazie preimplantacyjnej

19 Hodowla komórek transformacja i immortalizacja komórek Indukcja transformacji przez traktowanie: Mutagenem Onkowirusem Uzyskanie komórek transformowanych jest długim procesem Komórka transformowana

20 Hodowla komórek transformacja i immortalizacja komórek Transformacja wywołana mutagenem MSJ Crane. Mutagenesis and cell transformation in culture Metods in Cell Science 29: , 1999 Zależność między przeżywalnością komórek a częstością mutacji po traktowaniu mutagenem Względna częstość mutacji po traktowaniu komórek różnymi mutagenami

21 Transformacja przez wirusy Wirusy używane do transformacji komórek (Wszystkie: wirusy dsdna - zawierające podwójnoniciowe DNA) SV40: Simian virus 40, gen LT Adenowirus gen E1a HPV: Human papilloma virus, wirus brodawczaka ludzkiego, geny E6 i E7 EBV: Epstein Barr virus, Wirus Epsteina-Barr cały wirus Geny odpowiedzialne za transformację prawdopodobnie znoszą blokadę cyklu komórkowego przez inhibicję genów: CIP-1 WAF-1 p21 Rb p53 p16 Wydajność transformacji wyższa od mutagenów

22 Mechanizm transformacji przez wirusy dsdna

23 Hodowla komórek nowotworowych Zakładanie hodowli: podobnie jak hodowle komórek prawidłowych Problem 1: komórki nowotworowe często nie dzielą się w warunkach hodowli in vitro. Możliwe przyczyny: brak czynników stymulujących (czynniki wzrostu, zrąb ) Problem 2: Guz nowotwory jest zlepkiem komórek nowotworowych i prawidłowych komórek tkanki łącznej jak fibroblasty, komórek śródbłonkowych itp.

24 Hodowle 3D

25 Podłoże dla hodowli 3D Symulacja in vitro: ECM macierzy międzykomórkowej - główne składniki: kolagen (żelatyna) laminy Żel Filtr