Wirus krowianki (MVA) jako model wirusowy w badaniu wirusobójczej aktywności środków dezynfekcyjnych wobec wirusów osłonkowych

Transkrypt

1 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2017, 69: Wirus krowianki (MVA) jako model wirusowy w badaniu wirusobójczej aktywności środków dezynfekcyjnych wobec wirusów osłonkowych Vaccinia virus (MVA) as a virus model in the study of virucidal activity of disinfectants against enveloped viruses Agnieszka Trzcińska, Agnieszka Częścik, Barbara Łagosz, Joanna Siennicka Zakład Wirusologii, Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego Państwowy Zakład Higieny, Warszawa Fundamentem w zapobieganiu zakażeniom związanymi z usługami medycznymi, głównie zakażeniami szpitalnymi, jest właściwa higiena rąk przy użyciu środków dezynfekcyjnych o precyzyjnie określonym zakresie działania, co wymaga zastosowania prawidłowej metodyki ich badania. Celem badania była weryfikacja nowego zakresu badań wirusobójczej aktywności produktów przeznaczonych do dezynfekcji rąk metodą wcierania i do higienicznego mycia rąk. Słowa kluczowe: wirus krowianki, aktywność wirusobójcza, PN-EN14476, wirusy osłonkowe ABSTRACT Introduction: The basis for preventing infection associated with the medical area, including hospital infections is proper hand hygiene using disinfectants with a precisely defined range of action. It requires the proper methodology of their examination. The aim of the study was to verify the new scope of virucidal activity testing of products for hygienic handrub and handwash - virucidal activity against enveloped viruses. Material and Methods: Procedures for testing the virucidal activity of the products for hygienic handrub and handwash (including the reference test) described in the standard PN-EN 14476:2013+A1:2015 were used. Results: The appropriate ranges of reduction of the infectious MVA titre in the reference test with 0,004% glutaraldehyde was obtained. The mean reduction of vaccinia virus titre was 0,815 ± 0,563 log after 5 minute contact time and 2,065 ± 0,555 log after 15 minute contact time. Also, the virucidal activity of ethanol and isopropanol in different concentration were tested. In case of 50% concentration of both alcohols, a titer reduction of at least 5,25 logs was achieved

2 134 A.Trzcińska i inni Nr 1 Conclusions: Obtained results confirmed the correctness of the work of the test system, which aims to assess the virucidal activity of the hygienic handrub and handwash products in the range virucidal activity against enveloped viruses test system meets all the criteria required by the standard. Key words: vaccinia virus, virucidal activity, PN-EN14476, enveloped viruses WSTĘP Dezynfekcja to działania prowadzone za pomocą środków chemicznych lub fizycznych, polegające na niszczeniu drobnoustrojów chorobotwórczych z wyłączeniem spor bakteryjnych. Dotyczy ona przede wszystkim środowiska zewnętrznego (narzędzi, powierzchni, tekstyliów, itd.), ale może dotyczyć również powłok ciała. Celem dezynfekcji jest zredukowanie liczby drobnoustrojów do takiego poziomu, aby zdezynfekowany przedmiot nie był już źródłem infekcji, dlatego też proces dezynfekcji jest istotnym elementem w profilaktyce i zwalczaniu zakażeń oraz niezbędnym elementem utrzymania higieny w zakładach opieki zdrowotnej. Podstawą w zapobieganiu zakażeniom związanym z obszarem medycznym, w tym zakażeniom szpitalnym, jest właściwa higiena rąk przy użyciu preparatów dezynfekcyjnych spełniających odpowiednie kryteria (2, 18). Idealny środek dezynfekcyjny, poza m.in. szybkim działaniem, trwałością, nietoksycznością, nie podleganiem wpływom środowiska, powinien przede wszystkim charakteryzować się jak najszerszym spektrum działania biobójczego, obejmującego bakterie, wirusy, grzyby i prątki (16). Wrażliwość drobnoustrojów na działanie chemicznych środków dezynfekcyjnych jest zróżnicowana od najbardziej opornych prionów po najbardziej wrażliwe wirusy osłonkowe. Precyzyjne określenie zakresu działania środka dezynfekcyjnego wiąże się z zastosowaniem prawidłowej metodyki badania, ponieważ błędne oznaczenie parametrów aktywności (stężenie, czas kontaktu, zakres) może prowadzić do nieodpowiedniego stosowania produktu. W Unii Europejskiej metodyka badania aktywności biobójczej preparatów dezynfekcyjnych jest znormalizowana. Obecnie metodyka określania aktywności wirusobójczej produktów stosowanych w obszarze medycznym jest opisana w normie PN-EN (13). Jest to norma Fazy 2, Etapu 1 stosująca metodę zawiesinową do ustalenia czy dany chemiczny środek dezynfekcyjny ma działanie wirusobójcze. Wymagania i wytyczne dotyczące warunków badania opisane w normie są uzależnione od przeznaczenia badanego preparatu. Norma wyróżnia 4 grupy badanych produktów: 1) preparaty do dezynfekcji narzędzi; 2) preparaty do dezynfekcji powierzchni; 3) preparaty do dezynfekcji tekstyliów i 4) preparaty do higienicznej dezynfekcji rąk metodą wcierania oraz preparaty do higienicznego mycia rąk. W ramach tej ostatniej grupy produkty mogą być badane pod kątem pełnego zakresu aktywności wirusobójczej, ograniczonego zakresu aktywności wirusobójczej oraz wprowadzonego w ostatniej edycji normy poprawką A1 określenia aktywności wirusobójczej tylko wobec wirusów osłonkowych (Tabela I). Celem badania było wprowadzenie i weryfikacja metodyki badania aktywności wirusobójczej produktów przeznaczonych do higienicznej dezynfekcji rąk metodą wcierania i do higienicznego mycia rąk w ramach nowego zakresu badań działanie wirusobójcze na wirusy osłonkowe.

3 Nr 1 MVA w badaniu aktywności środków dezynfekcyjnych 135 Tabela I. PN-EN 14476:2013+A1: Wymagania dotyczące badania preparatów do higienicznej dezynfekcji rąk metodą wcierania i higienicznego mycia rąk. Minimalny zakres badanych wirusów (obligatoryjny) Dodatkowy zakres Temperatura badania Czas kontaktu Substancja obciążająca W przypadku preparatów do higienicznej dezynfekcji rąk metodą wcierania należy wykonać badanie przynajmniej w warunkach czystych. W przypadku preparatów do higienicznego mycia rąk należy wykonać badanie przynajmniej w warunkach brudnych. Pełny zakres aktywności wirusobójczej: Wirus polio Wirus adeno Mysi norowirus Ograniczony zakres aktywności wirusobójczej: Wirus adeno Mysi norowirus Działanie wirusobójcze na wirusy osłonkowe: Wirus krowianki Każdy istotny, stosowny model wirusowy 20 o C Zgodnie z rekomendacją wytwórcy, ale pomiędzy 30 i 120 sekund Warunki czyste badania: 0,3 g/l roztwór albuminy bydlęcej Warunki brudne badania: 3,0 g/l roztwór albuminy bydlęcej plus 3,0 ml/l erytrocytów baranich MATERIAŁ I METODY Wirus. Wirus krowianki, modyfikowany szczep Ankara MVA (ATCC-VR-1508). MVA to posiadający osłonkę DNA wirus należący do rodziny Poxviridae, podrodziny Chordopoxvirinae, rodzaju Orthopoxvirus. Po namnożeniu wirusa porcjowano i do dalszych badań przechowywano w temperaturze -70 o C. Badania prowadzono z wirusem na poziomie 1 i 2 pasażu. Hodowla komórkowa. Fibroblastyczna linia ciągła BHK-21 (ATCC-CCL-10) wyprowadzona z nerki chomika Mesocricetus auratus. Hodowlę komórkową namnożono zgodnie z procedurą podaną przez producenta, rozporcjowano i do dalszych badań przechowywano w ciekłym azocie, w temperaturze -188 o C. Badania prowadzono z hodowlą na poziomie 5 i 6 pasażu. Podłoża hodowlane. Podłoże wzrostowe podłoże Eagle a (EMEM) wzbogacone 10% płodowej surowicy cielęcej i 3% L-glutaminy, zawierające 100 jednostek/ml penicyliny i 100 µg/ml streptomycyny oraz podłoże utrzymujące podłoże Eagle a (EMEM) wzbogacone 2% płodowej surowicy cielęcej i 3% L-glutaminy, zawierające 100 jednostek/ ml penicyliny i 100 µg/ml streptomycyny. Preparaty chemiczne. 1) 25% roztwór aldehydu glutarowego f-my Sigma (G-6257); 2) 96% (V/V) alkohol etylowy (etanol) f-my POCH; 3) 99,7% (w/w) 2-propanol

4 136 A.Trzcińska i inni Nr 1 (izopropanol) f-my POCH. W badaniu zastosowano 20%, 30% i 50% stężenie alkoholi przygotowane w stosunku objętościowym. Oznaczanie miana zakaźnego wirusa. Miano wirusa krowianki określano w mikropłytce metodą obecności/braku efektu cytopatycznego (quantal test) w zawiesinie komórek BHK-21. Po sporządzeniu szeregu rozcieńczeń wirusa w stosunku 1:10 (co 1 log), do ośmiu dołków w mikropłytce, zawierających 100 µl zawiesiny komórek BHK-21 o odpowiedniej gęstości (8-10 tys.komórek / dołek), dodawano po 100 µl każdego rozcieńczenia wirusa. Kontrolę stanowiły dołki tylko z hodowlą komórkową, bez zawiesiny wirusowej. Mikropłytki inkubowano w temperaturze 37 o C± 1 o C, w atmosferze 5% CO 2 przez okres 7 dni, a zmiany w hodowli komórkowej obserwowano w mikroskopie świetlnym. Miano zakaźne wirusa krowianki (wraz z oceną biometryczną) obliczano według metody Spaermana-Kärbera (13, 15). Określenie cytotoksyczności badanych preparatów chemicznych dla hodowli komórkowej. W celu sprawdzenia możliwości wystąpienia zmian morfologicznych wywołanych w komórkach hodowli BHK-21 przez stosowane preparaty chemiczne (aldehyd glutarowy, etanol, izopropanol) mogących mieć wpływ na wynik badania przygotowano serię rozcieńczeń preparatów w stosunku 1:10 w podłożu hodowlanym i dodawano do hodowli komórkowej. Wystąpienie ewentualnych zmian obserwowano w mikroskopie świetlnym. Określenie zdolności preparatów (alkoholi) do inaktywacji wirusa krowianki zgodnie z PN-EN Zasada badania opierała się na określeniu zdolności badanego produktu do inaktywacji wirusa krowianki na podstawie spadku miana zakaźnego wirusa na skutek działania produktu. Jako kryterium posiadania w/w zdolności przez badany produkt przyjęto spadek miana zakaźnego wirusa o co najmniej 4 w dziesiętnej skali logarytmicznej (4 log) różnica pomiędzy mianem zakaźnym wirusa krowianki w mieszaninie kontrolnej a mianem zakaźnym wirusa krowianki w mieszaninie do badania zawierającej określone stężenie badanego produktu. Miaszanina do badania zawierała: 1 ml zawiesiny wirusa krowianki (MVA); 1 ml substancji obciążającej; 8 ml badanego roztworu produktu (etanol lub izopropanol) w odpowiednim stężeniu. Końcowe stężenie alkoholi wynosiło 20%, 30% lub 50%. Mieszanina kontrolna zawierała: 1 ml zawiesiny wirusa krowianki (MVA); 1 ml substancji obciążającej; 8 ml sterylnej wody. Po przygotowaniu mieszaniny inkubowano w temperaturze 20 o C± 1 o C, przez czas kontaktu 1 minuta, mieszczący się w obowiązkowym zakresie podanym w normie oraz dodatkowy czas 3 minuty. Po upływie wybranego czasu kontaktu 0,5 ml każdej mieszaniny przenoszono do 4,5 ml oziębionego na lodzie podłoża utrzymującego, wykonywano serię rozcieńczeń (co 1 log) i oznaczano miano zakaźne wirusa krowianki. Test referencyjny. Prawidłowość działania systemu badawczego sprawdzono wykonując w powtórzeniu test inaktywacji wirusa krowianki ze związkiem chemicznym o uznanym działaniu wirusobójczym aldehydem glutarowym. Zdolność aldehydu glutarowego do inaktywacji wirusa krowianki określono w następujących warunkach: stężenie aldehydu glutarowego: 0,004% czasy kontaktu: 5 i 15 minut temperatura badania: 20 o C± 1 o C substancja obciążająca: buforowany fosforanem roztwór soli fizjologicznej (PBS).

5 Nr 1 MVA w badaniu aktywności środków dezynfekcyjnych 137 Po upływie założonych czasów kontaktu określano miano zakaźne wirusa krowianki w mieszaninie do badania zawierającej 0,004% aldehydu glutarowego i porównywano do miana wirusa w mieszaninie kontrolnej. WYNIKI I ICH OMÓWIENIE Zgodnie z wymaganiami obowiązującej obecnie edycji normy PN-EN 14476:2013+A1:2015 wirusobójcza aktywność produktów przeznaczonych do higienicznej dezynfekcji rąk metodą wcierania oraz higienicznego mycia rąk po raz pierwszy może być oceniana aż w 3 zakresach: pełne działanie wirusobójcze, ograniczone spektrum działania wirusobójczego, działanie wirusobójcze na wirusy osłonkowe. W przypadku każdego z wymienionych zakresów badanie wykonywane jest na innym zestawie obligatoryjnych modeli wirusowych. Jeżeli produkt przejdzie z pozytywnym skutkiem badanie na 3 modelach wirusowych wirusie polio i adeno oraz mysim norowirusie można uznać, że posiada on pełny zakres aktywności wirusobójczej, w takim stężeniu i czasie kontaktu, w którym inaktywowane są wszystkie 3 wymienione modele wirusowe. W przypadku ogranicznego spektrum aktywności wirusobojczej badanie wykonywane jest obowiązkowo z 2 modelami wirusowymi: wirusem adeno i mysim norowirusem. Posiadanie przez produkt ograniczonego zakresu działania wirusobójczego (w czasie i stężeniu, w którym inaktywowane są oba badane modele wirusowe) oznacza, że ma on aktywność wirusobójczą wobec wszystkich wirusów osłonkowych i badanych wirusów. Nowością w tej edycji normy PN-EN jest wprowadzenie 3 zakresu, czyli badania pod kątem działania wirusobójczego tylko na wirusy osłonkowe, w którym wirusowym modelem testowym jest modyfikowany szczep Ankara wirusa krowianki (MVA). Inaktywacja tego wirusa w danym czasie kontaktu przez produkt o określonym stężeniu oznacza, że w tych parametrach posiada on aktywność wirusobójczą wobec wirusow osłonkowych. Wybór modyfikowanego szczepu Ankara wirusa krowianki jako modelu badawczego w normie jest wynikiem wielu czynników. Przede wszystkim szczep Ankara (MVA) jest bardzo silnie atenuowanym szczepem wirusa krowianki, który w toku wielu badań został wykazany jako bezpieczny dla ludzi. Ze względu na wysoki profil bezpieczeństwa ten szczep wirusa krowianki jest uważany za szczep z wyboru do prowadzenia badań klinicznych (19). Poza tym jest on doskonałym kandydatem do użycia jako system wektorowy w szczepionkach rekombinowanych (5, 12, 17, 20). Atenuacja szczepu jest wynikiem kilkusetkrotnego pasażowania w hodowli komórkowej (10, 11), czego wynikiem była utrata ok. 15% genomu wyjściowego, w tym specyficznych genów regulujących zakres gospodarzy wirusa oraz tych odpowiedzialnych za unikanie układu odpornościowego gospodarza (1, 3). Wynikiem procesu atenuacji jest również ekstremalne ograniczenie zdolności replikacji MVA w komórkach ssaków (4, 6), co ze względów bezpieczeństwa jest również niezwykle istotne. Ponadto, w wielu laboratoriach przeprowadzono porównawcze badania modyfikowanego szczepu Ankara i szczepu Elstree wirusa krowianki, które wykazały brak znaczących różnic we wrażliwości tych szczepów na środki dezynfekcyjne zawierające różne substancje aktywne, co potwierdza, że MVA jest dobrym modelem badawczym, który daje porównywalne wyniki ze szczepem Elstree (9, 14). Zastosowany w naszych badaniach modyfikowany szczep wirusa Ankara (ATCC) charakteryzował się stabilną wartością miana zakaźnego na poziomie jednego pasażu i pomiędzy dwoma pasażami (Ryc.1), ze średnim logtcid 50 równym 6,815 ± 0,223. Uzyskane miano zakaźne wirusa było wystarczająco wy-

6 138 A.Trzcińska i inni Nr 1 sokie, aby pozwolić na określenie redukcji miana o 4 log w badaniu działania wirusobójczego środka dezynfekcyjnego, co jest jednym z kryteriów pozytywnej weryfikacji opisanej w normie metodyki badania. Drugim istotnym kryterium są wyniki testu referencyjnego, które muszą zawierać się w określonych zakresach. Zgodnie z wytycznymi normy PN-EN w czasie badania aktywności wirusobójczej danego środka dezynfekcyjnego jednocześnie powinien być wykonany test referencyjny ze związkiem chemicznym o uznanym działaniu wirusobójczym. Test referencyjny ma na celu kontrolę prawidłowości działania systemu badawczego na który składają się przede wszystkim wirus testowy, hodowla komórkowa, dokładność warunków inkubacji (temperatura i czas kontaktu). Badanie referencyjne inaktywacji wirusa krowianki (MVA) zostało wykonane z 0,004% roztworem aldehydu glutarowego. Uzyskane wyniki redukcji miana zakaźnego wirusa (Tabela II) mieściły się w założonych zakresach podanych w normie, zarówno dla czasu kontaktu 5, jak i 15 minut. 6,5 6,7 6,9 7,1 7,3 log TCID 50 Rycina 1. Stabilność miana wirusa krowianki (MVA) Tabela II. Test referencyjny z 0,004% aldehydem glutarowym Czas kontaktu (w min.) Miano MVA (log TCID 50 ) Błąd standardowy (S) Redukcja (R) miana MVA 95% przedział ufności dla R Średnia (R śr ) redukcja miana MVA 95% przedział ufności dla R śr 0 7,25 0, ,13 0,183 nd nd nd nd 5 6,38 0,206 0,75 0, ,25 0,221 0,88 0,574 0,815 0, ,00 0,189 2,13 0, ,13 0,226 2,00 0,582 2,065 0,555 nd nie dotyczy; MVA wirus krowianki, modyfikowany szczep Ankara Zakresy te wynoszą 0,75-3,50 log w przypadku czasu kontaktu 5 minut oraz 2,0-4,0 log dla czasu kontaktu 15 minut. Średnia redukcja miana wirusa krowianki w przeprowadzonym badaniu referencyjnym wynosiła 0,815 ± 0,563 log po 5 minutowym czasie kontaktu oraz 2,065 ± 0,555 log po 15 minutowym czasie kontaktu. Co najmniej 4 log redukcję miana zakaźnego MVA uzyskano w kilku laboratoriach w ramach badań międzylaboratoryjnych po

7 Nr 1 MVA w badaniu aktywności środków dezynfekcyjnych minutowej inkubacji z 0,05% i 0,1% aldehydem glutarowym (14). Przetestowano również wrażliwość MVA na działanie różnych stężeń etanolu oraz izopropanolu, stosując 2 czasy kontaktu: 1 minutę i 3 minuty (Ryc.2). W przypadku 20% stężenia obu alkoholi zarówno po czasie kontaktu 1 minuta, jak i 3 minuty uzyskano redukcję miana zakaźnego MVA 1,38 log. logtcid Stężenie 20% E (1) E (3) Izo (1) Izo (3) K0-1 K0-2 logtcid Stężenie 30% E (1) E (3) Izo (1) Izo (3) K0-1 K0-2 logtcid Stężenie 50% E (1) E (3) Izo (1) Izo (3) K0-1 K0-2 Ryc. 2. Aktywność wirusobójcza etanolu (E) i izopropanolu (Izo) wobec wirusa krowianki po czasie kontaktu 1 minuta (1) i 3 minuty (3). K0-1 i K02 kontrola wirusa po czasie kontaktu 0 minut. Wynik ten wskazuje, że 20% etanol i izopropanol nie wykazują aktywności wirusobojczej wobec wirusa krowianki. W przypadku 50% stężenia etanolu i izopropanolu uzyskano redukcję miana na poziomie co najmniej 5,25 log, co wskazuje na posiadanie przez badane alkohole w tym stężeniu działania wirusobójczego wobec wirusa krowianki i zgodnie z wytycznymi normy PN-EN również wobec innych wirusów osłonkowych. Podobne wyniki dla w/w stężeń etanolu i izopropanolu w czasie kontaktu 1 minuta uzyskano w 3 różnych laboratoriach w ramach badań porównawczych (14). Wymagana 4 log redukcja miana

8 140 A.Trzcińska i inni Nr 1 wirusa krowianki nie została uzyskana po 1 minucie w przypadku 30% etanolu, natomiast 30% izopropanol powodował redukcję na poziomie co najmniej 5 log. Wyniki dla izopropanolu w tym stężeniu były zróznicowane w przypadku badań w innych laboratoriach od 0,5 ± 0,44 log do 3,69 ± 0,53 log (14). Modyfikowany szczep Ankara wirusa krowianki jeszcze przed oficjalnym umieszczeniem go jako model testowy w normie PN-EN był przez wiele laboratoriów charakteryzowany i porównywany z innymi wirusami osłonkowymi (np. wirusem Ebola, MERS-CoV) pod kątem swojej wrażliwości na działanie różnych środków dezynfekcyjnych lub wybranych substancji aktywnych (7, 8, 9), co potwierdziło skuteczność jego wyboru jako model testowy w normie. Artykuł jest wynikiem realizacji zadania badawczego (8/EM/2016) w planie naukowym NIZP-PZH (projekt badawczy ). PIŚMIENNICTWO 1. Antoine G, Scheiflinger F, Dorner F, Falkner FG. The complete genomic sequence of the modified vaccinia Ankara strain: comparison with other orthopoxviruses. Virology 1998; 244: Bingham J, Abell G, Kienast L i inni. Health care worker hand contamination at critical moments in outpatient care settings. Am J Infect Control 2016; 44: Blanchard TJ, Alcami A, Andrea P, Smith GL. Modified vaccinia virus Ankara undergoes limited replication in human cells and lacks several immunomodulatory proteins: implications for use as a human vaccine. J Gen Virol 1998; 79: Carroll MW, Moss B. Host range and cytopathogenicity of the highly attenuated MVA strain of vaccinia virus: propagation and generation of recombinant viruses in a nonhuman mammalian cell line. Virology 1997; 238: Di Mario G, Sciaraffia E, Facchini M i inni. Protective immunity against influenza in HLA-A2 transgenic mice by modified vaccinia virus Ankara vectored vaccines containing internal influenza proteins. Pathog Glob Health 2017; 111: Drexler I, Heller K, Wahren B i inni. Highly attenuated modified vaccinia virus Ankara replicates in baby hamster kidney cells, a potential host for virus propagation, but not in various human transformed and primary cells. J Gen Virol 1998; 79: Eggers M, Eickmann M, Kowalski K i inni. Povidone-iodine hand wash and hand rub products demonstrated excellent in vitro virucidal efficacy against Ebola virus and modified vaccinia virus Ankara, the new European test virus for enveloped viruses. BMC Infect Dis 2015; 15: Eggers M, Eickmann M, Zorn J. Rapid and effective virucidal activity of povidone- -iodine products against middle east respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) and modified vaccinia virus Ankara (MVA). Infect Dis Ther 2015; 4: Hartnack S, Essbauer S, Truyen U. Substitution of vaccinia virus Elstree by modified vaccinia virus Ankara to test the virucidal efficacy of chemical disinfectants. Zoonoses Public Health. 2008; 55: Mayr A, Hochstein-Mintzel V, Stickl H. Passage history, properties, and applicability of the attenuated vaccinia virus strain MVA. Infection 1975; 3: 6-14.

9 Nr 1 MVA w badaniu aktywności środków dezynfekcyjnych McCurdy LH, Larkin BD, Martin JE i inni. Modified vaccinia Ankara: potential as an alternative smallpox vaccine. Clin Infect Dis 2004; 38: Pavot V, Sebastian S, Turner AV i inni. Generation and production of modified vaccinia virus Ankara (MVA) as a vaccine vector. Methods Mol Biol 2017; 1581: PN-EN 14476:2013+A1:2015. Chemiczne środki dezynfekcyjne i antyseptyczne - Ilościowa zawiesinowa metoda określania wirusobójczego działania w obszarze medycznym - Metoda badania i wymagania (Faza 2/Etap 1). Data publikacji: Rabenau HF, Rapp I, Steinmann J. Can vaccinia virus be replaced by MVA virus for testing virucidal activity of chemical disinfectants? BMC Infect Dis 2010; 10: Ramakrishnan MA. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World J Virol 2016; 5: Rutala WA, Weber DJ. Selection of the ideal disinfectant. Infect Control Hosp Epidemiol 2014; 35: Schweneker M, Laimbacher AS, Zimmer G i inni. Recombinant Modified Vaccinia Virus Ankara Generating Ebola Virus-Like Particles. J Virol 2017; 91: e doi: /JVI Siddharta A, Pfaender S, Vielle NJ i inni. Virucidal activity of World Health Organization-recommended formulations against enveloped viruses, including Zika, Ebola, and emerging coronaviruses. J Infect Dis 2017; 215: Verheust C, Goossens M, Pauwels K, Breyer D. Biosafety aspects of modified vaccinia virus Ankara (MVA)-based vectors used for gene therapy or vaccination. Vaccine 2012; 30: Volz A, Sutter G. Modified vaccinia virus Ankara: history, value in basic research, and current perspectives for vaccine development. Adv Virus Res 2017; 97: Otrzymano: 14 VI 2017 r. Adres Autora: Warszawa, ul. Chocimska 24, Zakład Wirusologii, Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego Państwowy Zakład Higieny w Warszawie