Wstęp: ZASTOSOWANIE CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ W BIOTECHNOLOGII ŚRODOWISKOWEJ Chromatografią cieczową nazywamy chromatografię, w której eluentem jest ciecz, zwykle rozpuszczalnik organiczny. HPLC (ang. High Performance Liquid Chromatography wysokosprawna chromatografia cieczowa) technika stosowana do badania czystości, oczyszczania i identyfikacji substancji chemicznych. HPLC jest to rodzaj cieczowej chromatografii kolumnowej. Rolę cieczy nośnej (fazy ruchomej) pełni odpowiednio dobrana mieszanina (tzw. eluent). Na skutek oddziaływań międzycząsteczkowych między związkami chemicznymi będącymi składnikami analizowanej próbki a wypełnieniem kolumny następuje ich rozdział. HPLC różni się od zwykłej chromatografii cieczowej ciśnieniem przekraczającym 100 atm, pod jakim podawany jest eluent na kolumny. Polarność faz w HPLC ma duże znaczenie dla procesu rozdziału. W analizie stosuje się normalny układ faz (NP), w którym faza stacjonarna jest znacznie bardziej polarna niż faza ruchoma (żel krzemionkowy heksan). Jednak najczęściej stosuje się odwrócony układ faz (RP), w którym faza stacjonarna jest mniej polarna niż faza ruchoma (żel krzemionkowy z chemicznie modyfikowaną powierzchnią [grupy oktadecylosilanowe, oktylosilanowe, diole, podstawniki modyfikowane i inne, bardziej złożone] mieszanina metanolu, acetonitrylu, wody). Analiza jednej próbki, w typowym chromatografie HPLC, trwa od kilku do kilkudziesięciu minut. Kolumny mają przeciętnie długość od 3 do 25 cm i przekrój wewnętrzny rzędu kilku milimetrów (preparatywne mogą być o wiele większe). W czasie jednej analizy zużywa się od kilku do kilkudziesięciu mililitrów eluenta. Jako eluent stosuje rozmaite rozpuszczalniki tj.: metanol, chlorek metylenu, THF, toluen, etanol, acetonitryl, woda, wodne bufory i inne. Analizowana próbka ma zwykle objętość od 1 do 200 µl, a w preparatywnej do kilkudziesięciu mililitrów. Ekstrakcja do fazy stałej SPE polega na przeniesieniu analizowanej substancji znajdującej się w badanej próbce ciekłej do fazy stałej (nośnika). Rozdzielanie związków zachodzi w oparciu o współczynnik podziału związków organicznych między fazę ruchomą i stały sorbent. Proces adsorpcji można przeprowadzać przy zastosowaniu kolumienek wypełnionych sorbentem. Poszczególne etapy izolacji metodą SPE: 1. Przemycie złoża rozpuszczalnikiem 2. Kondycjonowanie złoża sorbentu poprzez przemycie go takim rozpuszczalnikiem, który jest jak najbardziej zbliżony właściwościami do próbki 3. Wprowadzenie próbki do złoża 4. Przemycie złoża w celu usunięcia matrycy i ewentualnych substancji przeszkadzających. Projekt współfinansowany przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego 1
5. Elucja właściwych analitów. SPE stosujemy między innymi do: Wzbogacania/zatężania próbek Oczyszczania próbek Frakcjonowania analitów Przechowywania próbek Projekt współfinansowany przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego 2
ĆWICZENIE 1. Oznaczanie kwasu benzoesowego lub jego soli jako konserwantu w produktach mlecznych (cz. A) Kwas benzoesowy Wykorzystywany jako konserwant, zapobiega rozwojowi drożdży i bakterii w wielu produktach spożywczych, np.: warzonych napojach bezalkoholowych, bezmlecznych dipach, ciastach, gumach do żucia, sokach owocowych, margarynach oraz lodach. W nadmiernych ilościach kwas benzoesowy może powodować astmę, pokrzywkę oraz problemy behawioralne. W niektórych przypadkach wpływa również niekorzystnie na płuca, a także podrażnia oczy i skórę. Jest toksyczny dla układu nerwowego. W związku, iż jego pochodną jest aspiryna, powinny go unikać osoby uczulone na ten lek. Cel: Celem ćwiczenia jest ekstrakcja kwasu benzoesowego lub jego soli z próbki produktu mleczarskiego za pomocą mieszaniny woda/metanol. Zatężenie próbki metodą SPE. Analiza chromatograficzna HPLC, w połączeniu z detektorem spektrofotometrycznym UV. Oznaczenie zawartości kwasu benzoesowego w produktach mleczarskich. Materiał do analizy: Próbki mleka, śmietany kefiru, jogurtu naturalnego. Wykonanie: Etap I przygotowanie roztworu wzorcowego: W kolbie miarowej o poj. 50 ml umieszczamy 100,0 mg kwasu benzoesowego lub soli sodowej tego kwasu i uzupełniamy do kreski mieszaniną acetonitryl - woda (7:3 v/v) (roztwór 1ml = 1mg KWB lub NaKWB) Pobrać 1,00 ml sporządzonego roztworu i rozcieńczyć go w kolbie miarowej na 100 ml (roztwór wzorcowy roboczy: 1ml =..mg KWB lub NaKWB) Etap II przygotowanie próbki: Do plastikowej próbówki wirówkowej o poj. 50ml wlać 50 ml mleka, 1 ml 5% roztworu NaOH, probówkę zamknąć wstrząsnąć i odwirować przy prędkości 4-5 tyś obr./min przez 15 min. Po odwirowaniu delikatnie ściągnąć warstwę tłuszczu i ponownie odwirować. Jeżeli uzbiera się Projekt współfinansowany przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego 3
warstwa tłuszczu ponownie ściągnąć. Odwirowane mleko przelać do kolby miarowej na 100 ml dodać 2 ml 5% roztworu kwasu solnego i uzupełnić metanolem (cz.d.a). Kolbę wytrząsać ręcznie przez 2 minuty a następnie roztwór przesączyć na lejku przez bibułę do zlewki. kondycjonowanie kolumienki (kolumienka C-18/3 ml/500 mg): po zamocowaniu kolumienki w aparacie do sączenia próżniowego, przemyć kolumienkę 3 ml metanolu (czystość do HPLC), następnie 3 ml mieszaniny woda - metanol (50:50 v/v); rozdział: powoli przepuścić 15 ml otrzymanego roztworu badanej próbki przez kolumienkę, regulując przepływ próżnią; przemycie kolumienki: przemyć 1 ml wody (czystość do HPLC), suszyć 7 min pod próżnią; Ważne: Należy pamiętać, iż od chwili rozpoczęcia etapu kondycjonowania złoża sorbentu nie można dopuścić do jego wyschnięcia. W przeciwnym przypadku procedurę należy rozpocząć od nowa. Przed ostatnim etapem elucji analitów ze złoża należy upewnić się, czy jest ono suche, jeśli nie - wysuszyć. elucja: przemyć 4x1 ml mieszaniną acetonitryl - woda (8:2 v/v), przesącz zbierać do małego naczynka (probówki na 5ml). Pobrać 1,5 ml próbki do naczynka chromatograficznego, szczelnie zamknąć, opisać próbkę i pozostawić w chłodnym miejscu (np. lodówce) do następnych ćwiczeń. Na zajęcia należy przynieść próbki mleka, śmietany kefiru lub jogurtu naturalnego. Ważne, aby produkty te nie miały żadnych dodatków typu owoce itp. Projekt współfinansowany przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego 4
ĆWICZENIE 1. Oznaczanie kwasu benzoesowego lub jego soli jako konserwantu w produktach mlecznych (cz. B) Materiał do analizy: zatężony ekstrakt uzyskany z części A. Wykonanie: Warunki rozdzielania, detekcji i kalibracji HPLC Ustawić skład eluent: acetonitryl:metanol:1% kwas octowy (35:5:60%), natężenie przepływu fazy ruchomej -1ml/min. Ustabilizować warunki rozdzielania (stabilna linia podstawowa detektora UV-VIS długość fali 220 nm, powierzchnia sorpcyjna kolumny zrównoważona ze stosowanym eluentem). Po ustabilizowaniu warunków rozdzielania wprowadzić do pętli zaworu dozującego co najmniej 50 mikrolitrów próbki. Po stwierdzeniu gotowości systemu rejestracji i przetwarzania danych wprowadzić próbkę do kolumny. Obserwować przebieg rozdzielania, kontrolować prawidłowość pracy aparatu, zanotować warunki rozdzielania i detekcji a także wyjaśnić z prowadzącym ewentualne wątpliwości. Po zarejestrowaniu chromatogramu, odczytać czas retencji i powierzchnie piku dla badanego związku. W wyżej opisany sposób wykonać analizę chromatograficzną dla sporządzonego roztworu kalibracyjnego (wzorzec zewnętrzny pobrać 50 μl roztworu wzorcowego roboczego). Zarejestrować chromatogramy i wyznaczyć czas retencji dla substancji z roztworu kalibracyjnego. Opracowanie wyników: Sprawozdanie przygotowuje się według osobnego załącznika do ćwiczeń z HPLC. UWAGA: sprawozdanie powinno być już wydrukowane na zajęcia gdyż będzie ono wypełniane w trakcie trwania ćwiczeń części B i oddawane po jego zakończeniu. Projekt współfinansowany przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego 5