Zastosowanie chromatografii cieczowej w biotechnologii środowiskowej

Transkrypt

1 Zastosowanie chromatografii cieczowej w biotechnologii środowiskowej Projekt współfinansowany przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

2 Literatura: 1. R. Rosset, H. Kołodziejczyk; Współczesna chromatografia cieczowa, ćwiczenia i zadania., PWN W-wa 2001r. 2. J.J. Kirkland; Współczesna chromatografia cieczowa., PWN W-wa 1976 r. 3. B. Walczak, J. Śliwiok; Wysokosprawna chromatografia cieczowa., Skrypt UŚ Katowice 1989 r. 4. W. Szczepaniak; Metody instrumentalne w analizie chemicznej., PWN W-wa 1996 r. 5. J. Minczewski, Z. Marczewski; Chemia analityczna, tom III., PWN W-wa 1986 r. 6. G. W. Ewing; Metody instrumentalne w analizie chemicznej., PWN W-wa 1980 r. 7. Z. Witkiewicz; Podstawy chromatografii., WNT W-wa 2005 r.

3 Chromatografia z greckiego: chromatos = barwa + grapho = pisze technika analityczna lub preparatywna słuŝąca do rozdzielania lub badania składu mieszanin związków chemicznych.

4 W zaleŝności od rodzaju eluentu czyli substancji w której rozpuszcza się badaną mieszaninę rozróŝnia się następujące techniki chromatograficzne: chromatografia cieczowa - w której eluentem jest ciekły rozpuszczalnik lub mieszanina rozpuszczalników chromatografia gazowa - w której eluentem jest gaz (zwykle hel, argon lub wodór, czasem azot) chromatografia nadkrytyczna - w której eluentem jest gaz w stanie nadkrytycznym

5

6 Eluent - czynnik wymywający, jest to płyn (gaz lub ciecz), który pełni funkcję czynnika przenoszącego analizowaną mieszaninę przez złoŝe, na którym następuje jej rozdział na poszczególne związki. Eluentami są zwykle związki chemiczne o niskiej masie cząsteczkowej, które nie reagują ze złoŝem i przechodzą przez to złoŝe przy jak najmniejszych oporach przepływu. W chromatografii cieczowej eluentem jest rozpuszczalnik lub mieszanina rozpuszczalników. Do najczęściej stosowanych eluentów ciekłych zalicza się: aceton, acetonitryl, chlorek metylenu, chloroform, etanol, THF, toluen, woda - *(o czystości LC) Eluat - roztwór zawierający substancje wymyte.

7 Rozdział substancji następuje w wyniku przepuszczenia roztworu badanej mieszaniny przez specjalnie spreparowaną fazę rozdzielczą (złoŝe), zwaną teŝ fazą stacjonarną. Fazą rozdzielczą są substancje wykazujące zdolności sorpcyjne lub zdolne do innych oddziaływań na substancje przepływające. Podczas przepływu eluentu (fazy fazy ruchomej) przez fazę rozdzielczą następuje proces wymywania zaadsorbowanych substancji. Intensywność tego procesu jest róŝna dla poszczególnych składników mieszaniny. Jedne składniki są więc zatrzymywane w fazie dłuŝej, a inne krócej, dzięki czemu moŝe następować ich separacja.

8 Chromatografia cieczowa - rodzaj chemicznej techniki analitycznej - chromatografia, w której eluentem jest ciecz, zwykle jakiś rozpuszczalnik. Istotą kaŝdej chromatografii cieczowej jest rozdział analizowanej mieszaniny na poszczególne związki chemiczne poprzez przepuszczanie roztworu tej mieszaniny przez stałe lub Ŝelowe złoŝa, co w pewnym sensie przypomina filtrację. Na skutek oddziaływań międzycząsteczkowych między związkami tworzącymi mieszaninę a złoŝem jedne z nich przechodzą przez złoŝe szybciej a inne wolniej. HPLC (ang. High Performance Liquid Chromatography wysokosprawna chromatografia cieczowa) to technika analityczna stosowana do badania czystości, oczyszczania i identyfikacji substancji chemicznych stosowana równieŝ jako preparatywna,

9 Kolumny z odpowiednim wypełnieniem: Ŝel krzemionkowy lub jego modyfikację polarnymi grupami (faza normalna, NP) Ŝel krzemionkowy modyfikowany grupami o niskiej polarności (faza odwrócona, RP), najczęściej grupami oktadecylowymi, C18 wypełnienia polimerowe bardzo odporne chemicznie, umoŝliwiają prace w całym zakresie ph, ale ustępują jak na razie moŝliwościom rozdzielczym wypełnień opartych na Ŝelu krzemionkowym

10 Aparaty HPLC składaj adają się zwykle z: zbiornika na eluenty, bufory, itp., automatycznego odgazowywacza, który usuwa gazy rozpuszczone w eluentach zaworów proporcjonujących, w których faza ruchoma osiąga zadany skład, pomp zapewniających odpowiednie parametry przepływu eluenta w układzie. iniektora umoŝliwiającego wprowadzanie analizowanych próbek bez rozszczelnienia układu (autosampler) odpowiednich filtrów, prekolumny, która usuwa z eluenta zanieczyszczenie mechaniczne. kolumny z odpowiednim wypełnieniem, termostatu kolumn, detektora którym moŝe być spektrofotometr UV-VIS lub fluorescencyjny, spektrometr mas (MS), zbiornika na zuŝyty eluent,

11

12 METODY ROZDZIELCZE W CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ Chromatografia normalnej fazy faza stacjonarna jest zazwyczaj bardzo polarna (np. Ŝel krzemionkowy), a faza mobilna jest niepolarna (np. n-heksan, tetrahydrofuran). Rozdzielane substancje im bardziej są polarne tym silniej oddziałują z polarnym nośnikiem. Chromatografia odwróconej fazy faza stacjonarna jest zazwyczaj niepolarna, hydrofobowa, a faza mobilna jest polarna (np. mieszanina wody i metanolu). Rozdzielane substancje im mniej są polarne tym silniej oddziałują z niepolarnym nośnikiem.

13 Detekcja W wysokosprawnej chromatografii cieczowej stosuje się detektory o działaniu ciągłym (przepływowe), charakteryzujące się duŝą czułością i małą objętością komórki pomiarowej. Najczęściej w metodzie chromatografii cieczowej wykorzystuje się; detektor absorpcji w nadfiolecie (UV-Vis), refraktometr róŝnicowy, detektor adsorpcyjny mikrokalorymetryczny, detektor fluorometryczny, detektor polarograficzny, detektor konduktometryczny. detektor masowy (MS) Dobry układem detekcyjnym jest połączenie dwóch detektorów.

14

15 Wypełnienia kolumn w HPLC Fazy stacjonarne (adsorbenty) Rozdział w HPLC opera się na oddziaływaniu powierzchniowym, które silnie zaleŝy od natury chemicznej centrów adsorpcyjnych. Nowoczesne adsorbenty stosowane w HPLC są małymi cząstkami o bardzo rozwiniętej powierzchni. W HPLC stosuje się praktycznie dwa typy wypełnień: - wypełnienia powierzchniowo porowate i wypełnienia mikroporowate w całej masie (o małej średnicy ziaren). - rozmiar cząstek 3-10 µm - rozmiary porów: Å; - powierzchnia: 50 to 250 m 2 /g - rodzaje centrów aktywnych: odwrócona faza (C8, C18, -fenyl), normalna faza: (-OH, -NH 2 ), jonity (NH 4 + ), (-COO-)

16

17 Schemat przekroju ziarna nośnika: a) ziarno z powierzchniową warstwą adsorpcyjną (składa się z nieprzenikliwego rdzenia oraz powierzchniowej warstwy adsorpcyjnej), b) ziarno porowate w całej masie.

18

19 Czasem retencji t R. nazywa się czas. jaki upływa między zadozowaniem próbki a pojawieniem się maksimum piku rozpatrywanego składnika próbki. Składnik nie zatrzymywany przez fazę stacjonarną pojawia się w wycieku po czasie t M. nazywanym czasem retencji substancji nie zatrzymywanej (lub zerowym czasem retencji).

20 Współczynnik retencji k jest to stosunek ilości substancji w fazie stacjonarnej do ilości substancji w fazie ruchomej. Jeśli c S i c M oznaczają, odpowiednio, równowagowe stęŝenia substancji w fazach stacjonarnej i ruchomej, a V S i V M są objętościami tych faz w kolumnie, to: S S k = = c c M V V M K V V S M Wielkość K = c S /c M nazywana jest stałą podziału substancji między dwie fazy. Czas retencji związany jest ze współczynnikiem retencji podstawową zaleŝnością w chromatografii t R = t M (1+k)

21 Współczynnik rozdzielenia Współczynnik rozdzielenia jest miarą rozdzielenia pików dwóch substancji: α = K K 2 1 = k k 2 1 = Sprawność kolumny chromatograficznej, od której zaleŝy rozdzielenie pików, mierzy się dla kaŝdej substancji liczbą półek teoretycznych, N, w kolumnie. Po przebyciu przez próbkę pewnej drogi w kolumnie rozkład jej stęŝenia w wycieku ma kształt krzywej Gaussa. Odchylenie standardowe tego piku, σ (wyraŝone w jednostkach czasu), powiązane jest z liczbą półek zaleŝnością: σ 2 = t t R2 R1 t R 2 N t t M M

22 W przypadku piku gaussowskiego jego szerokość, w na określonej wysokości jest związana z kwadratem odchylenia standardowego (wariancją) zaleŝnością w 2 = a σ w której współczynnik proporcjonalności a zaleŝy od wysokości, na jakiej mierzone jest w. Przez połączenie obu powyŝszych zaleŝności otrzymuje się 2 N = a t R w 2 Wartości t R i w powinny być mierzone na chromatogramie i wyraŝane w tych samych jednostkach - czasu lub długości.

23

24 N = t R a w PowyŜsze równanie stanowi podstawę wielu metod obliczania liczby półek. W dwu najczęściej stosowanych metodach wykorzystuje się szerokość piku przy podstawie, w b, zdefiniowaną jako część podstawy piku odciętą przez styczne wykreślone w punktach przegięcia po obu stronach piku (w b = 4σ), oraz szerokość piku w połowie wysokości (w h = 2,36σ) 2 N = 2 16 t 5,54 R tr = wb wh 2

25 Wskaźnik sprawności Wskaźnik sprawności to iloczyn liczby półek przypadających na jednostkę czasu i liczby półek przypadających na jednostkę ciśnienia: I P = t R 2 N P Jeśli ciśnienie wyraŝone jest w barach, a czas analizy w sekundach, to wskaźnik ten wynosi w przypadku kolumn dobrze napełnionych i uŝywanych we właściwych warunkach.

26

27 TECHNIKA SPE Solid Phase Extraction

28 Ekstrakcja do fazy stałej (SPE - ang. solid-phase extraction) jest jedną z najprostszych a zarazem jedną z najbardziej efektywnych i uniwersalnych metod chromatografii a zarazem sposobem na wydzielenie/zatęŝenie substancji badanej. Wykorzystywane w metodzie SPE kolumienki jednorazowego uŝytku z odpowiednim wypełnieniem są wygodne w stosowaniu i łatwe do utylizacji. W zaleŝności od rodzaju badanej substancji dobiera się stosowne wypełnienie kolumienek i odpowiednie czynniki wymywające.

29 Aparat próŝniowy do techniki SPE ATRINBIOTECH Priorytet IV POKL Szkolnictwo wyŝ wyŝsze i nauka nauka

30 Kolumienki SPE ATRINBIOTECH Priorytet IV POKL Szkolnictwo wyŝ wyŝsze i nauka nauka

31 ZASTOSOWANIE CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ

32 Nowoczesny chromatograf cieczowy charakteryzuje się wysoka sprawnością, dobrą rozdzielczością, duŝą szybkością procesu. Te korzystne parametry współczesnej chromatografii cieczowej (HPLC) osiągnięto dzięki instrumentacji metody i wprowadzeniu nowych faz stacjonarnych. Współczesna HPLC, wprowadzona w 1960 r. okazała się najbardziej pręŝnie rozwijającą się techniką chromatograficzną i znalazła szerokie zastosowanie w analizie preparatów farmaceutycznych, analizie biochemicznej, klinicznej i środowiskowej.

33 Oznaczanie śladowych ilości substancji chemicznych dodawanych jako konserwanty do produktów spoŝywczych lub kosmetyków

34

35 W Głównym Instytucie Górnictwa opracowana została nowoczesna metoda oznaczania wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych (WWA) w glebach z terenów rolniczych zlokalizowanych w pobliŝu zakładów przemysłowych z wykorzystaniem techniki HPLC. Metodyka wykorzystuje metodę technikę szybkiej ekstrakcji i zatęŝania z zastosowaniem ekstrakcji do fazy stałej (SPE) oraz techniki wysokosprawnej chromatografii cieczowej. * SPE solid phase extraction

36 Stosując chromatografię cieczową, w próbkach masła oznaczono jakościowo oraz ilościowo tokoferole(t) i tokotrienole (T3), charakterystyczne dla tłuszczów roślinnych. W przebadanych, losowo zakupionych w handlu detalicznym, kostkach masła Ekstra, Śmietankowego i Osełkowego stwierdzono, Ŝe 33% przebadanych próbek było produkowanych z dodatkiem tłuszczu roślinnego, o czym świadczy obecność tokoferoli, a w szczególności tokotrienoli, które występują jedynie w tłuszczu palmowym lub kokosowym. Cyt: śywność. Nauka. Technologia. Jakość, 2008, 3 (58), 47 56

37 Udział procentowy tych homologów w sumarycznej zawartości T i T3 kształtował się na poziomie od 40 do 82%. Taka ilość oznaczonych tokochromanoli świadczy o róŝnym dodatku tłuszczu roślinnego do tłuszczu mlecznego i wskazuje na obecność na polskim rynku nierzetelnych producentów, którzy deklarują tylko zawartość tłuszczu mlecznego (82 lub 73,5%) na opakowaniach masła.

38 Zastosowanie HPLC do wykrywanie fałszerstw. Problem fałszywego czeku: Po skasowaniu czeku opiewającego na 1100 $, jego wystawca oświadczył, Ŝe wypisał czek jedynie na 100 $. Czek z podejrzeniem fałszerstwa został przekazany do analizy do Instytutu Kryminalistyki w celu dokonania ekspertyzy. Istotną rzeczą dla ekspertów jest, by nie uszkodzić dokumentu, który moŝe się okazać niezbędny w postępowaniu sądowym. W tym więc przypadku pobrana do analizy próbka materiału musi być minimalna.

39 Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) jest techniką umoŝliwiającą rozwiązanie tego problemu. Analizę wykonujemy w następujący sposób: za pomocą mikrodziurkarki pobieramy krąŝki dokumentu o średnicy od 0,8 do 1,0 mm. Tusz ekstrahujemy organicznym rozpuszczalnikiem (np. metanolem) z krąŝków w kapilarze szklanej. Następnie otrzymany ekstrakt nastrzykujemy na kolumnę chromatografu cieczowego (HPLC) i wykonujemy analizę.

40 Otrzymujemy chromatogram tuszu pierwszej i drugiej jedynki z czeku uzyskując skład chemiczny próbek. Składnikami tuszu pierwszej (dopisanej) jedynki są chlorek tetrametylopararozaniliniowy, fiolet krystaliczny i fiolet metylowy. Tusz drugiej jedynki zawiera wyraźnie mniej fioletu krystalicznego niŝ fioletu metylowego i błękit Wiktorii.

41