4-5. Opracowanie metody oznaczania patuliny w soku jabłkowym PRACOWNIA DYPLOMOWAIII ROK AGROCHEMII. Ćwiczenie

Transkrypt

1 Ćwiczenie 4-5 Opracowanie metody oznaczania patuliny w soku jabłkowym PRACOWNIA DYPLOMOWAIII ROK AGROCHEMII Zakład Analizy Środowiska, Wydział Chemii, Uniwersytet Gdański 1

2 I. Wstęp teoretyczny 1. Mikotoksyny Patulina zaliczana jest do jednych z najlepiej poznanych grup mikotoksyn. Zaliczane są one do naturalnych zanieczyszczeń żywności i surowców wykorzystywanych do jej produkcji. Są one silnie toksycznymi produktami wtórnego metabolizmu grzybów (pleśni) należących do rodzajów: Aspergillus, Penicillinum i Fusarium. Tworzą się w okresie wegetacji lub zbioru, a także w wyniku nieprawidłowego przechowywania licznych produktów żywnościowych. Zanieczyszczenia mikotoksynami występują głównie w zbożu i jego przetworach, orzechach, przyprawach, kukurydzy, kawie, kakao, herbacie, owocach suszonych, piwie, winie i mleku. Patulina natomiast najczęściej wykrywana jest w jabłkach i soku jabłkowym, a w mniejszym stopniu w owocach z objawami brązowej zgnilizny jak np. banany, ananasy, winogrona, brzoskwinie, morele i pomidory czy w spleśniałych kompotach i soku gruszkowym. Ze względu na zróżnicowany charakter toksycznego oddziaływania mikotoksyn na organizmy wyższe podzielono je na 6 grup: aflatoksyny, ochratoksyna A, patulina, fumonizyny, deoksyniwalenol i zearalenon. Najbardziej toksyczna spośród wszystkich rodzajów mikotoksyn jest aflatoksyna B1 (Rys. 1). patulina Rysunek 1. Struktura chemiczna wybranych mikotoksyn Mikotoksyny, które znajdują się w żywności mogą być powodem mikotoksykoz. Dlatego żywność powinna być wytwarzana, transportowana i przechowywana w odpowiednich warunkach, tak aby zabezpieczyć ją przed wilgocią oraz niekorzystną temperaturą. Efekt toksyczny mikotoksyn zależy od rodzaju oraz ilości toksyny, która została spożyta wraz z produktami żywnościowymi. Długotrwałe narażenie organizmu na mikotoksyny może powodować różne przewlekłe choroby, np. nowotwory wątroby i nerek. Istnieją również ostre zatrucia po pobraniu jednorazowo dużej dawki mikotoksyn. 2

3 Wiele mikotoksyn jest niewrażliwych na obróbkę cieplną, co sprawia że są one stabilne podczas standardowych procesów przygotowania żywności i mogą pozostać w produkcie długo nawet po zaniku pleśni. Z tych względów jak i także w związku z wszechobecnością grzybów strzępkowych, skażenia tymi substancjami nie można całkowicie wyeliminować. Stąd też konieczne jest z jednej strony przedsięwzięcie odpowiednich działań mających na celu zapobieganie ich powstawaniu jak i także z drugiej strony monitorowanie ich występowania w artykułach spożywczych. Zapobieganie powstawania mikotoksyn polega na zapewnieniu odpowiednich warunków produkcji pasz i żywności. Dodatkowo, w produkcji pasz stosowane są grzybobójcze środki chemiczne. W zapobieganiu wytwarzania mikotoksyn biorą udział także naturalne mechanizmy obronne roślin poprzez wytwarzanie związków antygrzybowych. W chwili obecnej w Polsce obowiązuje rozporządzenie Komisji (WE) nr 1881/2006 z dnia r. ustalające najwyższe dopuszczalne poziomy niektórych zanieczyszczeń w środkach spożywczych (Dz. Urz. WE L 364 z ). 2. Oznaczanie mikotoksyn w żywności W oznaczaniu mikotoksyn bardzo ważny jest dobór odpowiedniej techniki izolacji i wzbogacania analitu z badanych próbek żywności oraz techniki oznaczeń końcowych. We współczesnej analizie śladowej mamy do czynienia z wykrywaniem substancji na poziomie ppm i ppb. Aby oznaczyć tak małe ilości substancji chemicznych w skomplikowanej matrycy, jaką są próbki żywności jak i środowiskowe, niezbędne jest przygotowanie procedury składającej się z kilku etapów: pobieranie próbki, przechowywanie, wstępne przygotowanie obejmujące wyodrębnienie od matrycy, zatężanie czy przekształcanie analitu w postać bardziej trwałą lub dogodną dla końcowego oznaczania, analiza właściwa, obróbka danych. Większość metod analitycznych jest niedostatecznie czuła do bezpośredniego oznaczania śladowych zanieczyszczeń. W większości stosowanych metod analitycznych używa się próbek ciekłych co wymaga wprowadzenia częściowego lub całkowitego oddzielenia ich od 3

4 matrycy przed przystąpieniem do analizy właściwej. Takie czynności jak frakcjonowanie, wydzielanie oznaczanych składników oraz ich zagęszczanie mają na celu wzbogacenie (zatężenie) analitu powyżej granicy oznaczalności stosowanego układu analitycznego oraz uproszczenie matrycy przez zastąpienie matrycy pierwotnej wybranym rozpuszczalnikiem lub gazem. Uwalniamy w ten sposób analit od substancji interferujących w trakcie pomiaru. Przy stosowaniu w analizie właściwej metod chromatograficznych upraszczanie matrycy ma również na celu usunięcie z próbki składników silnie adsorbowanych na kolumnie chromatograficznej, powodujących jej szybkie zużycie oraz substancji eluujących się powoli, co znacznie wydłuża czas trwania rozdziału analitycznego a tym samym zwiększa zużycie odczynników. Do najczęściej stosowanych technik ekstrakcji należy zaliczyć technikę ekstrakcji w układzie ciecz- ciecz (ang. Liquid Liquid Extraction, LLE) oraz technikę ekstrakcji ciecz ciało stałe (ang. Solid Phase Extraction, SPE). Natomiast na do ilościowej analizy mikotoksyn wykorzystuje się przede wszystkim techniki chromatograficzne: chromatografię cienkowarstwową (TLC), chromatografię gazową (GC) i wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC) oraz metody immunologiczne: radioimmunologiczne i immunoenzymatyczne. Do analiz jakościowych często wykorzystywana jest spektrometria mas i połączenia spektrometrii mas z chromatografią gazową i cieczową. 3. Technika ekstrakcji w układzie ciecz-ciecz Ekstrakcja rozpuszczalnikiem organicznym jest często stosowaną metodą izolacji śladowych zanieczyszczeń z wody. Ekstrakcja w układzie ciecz-ciecz może być stosowana w temperaturze pokojowej lub niższej przez co nadaje się do izolacji substancji nietrwałych. W doborze rozpuszczalnika do ekstrakcji najważniejsza jest jego zdolność ekstrahowania danej substancji w określonych warunkach. W ekstrakcji w układzie ciecz ciecz o podziale substancji między dwie fazy decyduje współczynnik podziału. Znajomość jego wartości pozwala wybrać warunki ekstrakcji, jednostopniową (K c >>1) lub wielostopniową, jeśli wartość K c jest znacznie mniejsza. Podstawową niedogodnością ekstrakcji jest duże zużycie rozpuszczalnika co daje zbyt dużą objętość ekstraktu w stosunku do potrzeb analizy. Ekstrakt trzeba zatężać przez odparowanie rozpuszczalnika, co oprócz pracochłonności może być powodem strat analitu. Zatężony rozpuszczalnik może być źródłem zanieczyszczeń próbki końcowej - minimalna obecność 4

5 interferenta w rozpuszczalniku (a istnieje niewiele substancji nierozpuszczalnych w rozpuszczalnikach organicznych na poziomie ppb) powoduje po jego zatężeniu (np. stukrotnym) pojawienie się sygnału mogącego zdecydowanie zmienić interpretację wyników oznaczeń. 4. Technika ekstrakcji do fazy stałej W celu uniknięcia lub zminimalizowania problemów powstających przy stosowaniu ekstrakcji w układzie ciecz-ciecz opracowano metodę ekstrakcji w układzie ciecz -ciało stałe, tzw. ekstrakcja do fazy stałej. Termin ekstrakcja do fazy stałej (Solid Phase Extraction, SPE) oznacza sposób izolowania analitu w układzie ciecz - ciało stałe oparty na chromatografii przy użyciu zmodyfikowanych powierzchniowo materiałów krzemionkowych czy polimerowych, podobnych do tych, które są szeroko stosowane w HPLC. Są to adsorbenty takie jak żel krzemionkowy, florisil, tlenek glinowy, krzemionka modyfikowana grupami alkilowym (np. C-18), fenylowymi, cyjanowymi, propyloaminowymi i in. lub fazy stacjonarne stosowane w chromatografii jonowymiennej (SCX, SAX) czy różnego rodzaju modyfikacje polimeru diwinylobenzenu (DVB). Zasada rozdziału metodą SPE zalezy głównie od natury sorbentu. Siłami warunkującymi oddziaływania między analitem a stałym adsorbentem polarnym (np. żel krzemionkowy, tlenek glinu) są wiązania wodorowe, oddziaływania dipol-dipol, dipol indukowany-dipol oraz siły dyspersyjne (van der Waalsa). Ten typ ekstrakcji oparty jest na takich samych zasadach jak chromatografia adsorpcyjna. Gdy zastosowanym sorbentem jest krzemionka z chemicznie związaną grupą polarną, np. aminową (układ faz normalnych) lub niepolarną, np. oktadecylową (układ faz odwróconych) zasada rozdziału jest taka, jak w chromatografii podziałowej. Należy pamiętać, że w każdym rodzaju chromatografii istnieje możliwość różnych oddziaływań między grupami funkcyjnymi analitu a powierzchnią sorbentu i mimo, że mechanizm rozdziału na fazach związanych jest podziałowy, w rzeczywistości przebiega w dużym stopniu przy udziale procesów adsorpcyjnych. Celem rozdziału metodą SPE jest przygotowanie próbki do analizy właściwej czyli wyizolowanie analitu z matrycy w maksymalnie czystej i skoncentrowanej postaci. Może być to osiągnięte na dwa sposoby: można wyeluować analit, podczas gdy zanieczyszczenia są zatrzymywane lub odwrotnie, żądany analit jest zatrzymywany na kolumnie, podczas gdy zanieczyszczenia są usuwane z kolumny. Ekstrakcja do fazy stałej zachodzi tylko wówczas, gdy wiązanie pomiędzy sorbentem a analitem jest silniejsze niż oddziaływanie wywierane przez rozpuszczalnik lub matrycę próbki. Anality zatrzymane na złożu można odzyskiwać 5

6 przez mineralizację złoża, ekstrakcję rozpuszczalnikami organicznymi i rozdział przy użyciu metod chromatograficznych czy desorpcję termiczną. Do najczęstszych metod należy jednak ekstrakcja rozpuszczalnikami organicznymi. W procesie wymywania eluent musi posiadać silniejsze powinowactwo do analitu niż sorbent. Zwykle stosuje się: metanol, aceton, izopropanol, dichlorometan, pentan, mieszaniny tych rozpuszczalników. Należy pamiętać, że stosowane w kolumienkach SPE fazy stacjonarne wykonane na bazie materiałów krzemionkowych są stabilne w zakresie ph 2-7,5; powyżej tej wartości żel krzemionkowy może się rozpuścić a poniżej mogą ulec hydrolizie wiązania między grupami silanolowymi a podstawnikami modyfikującymi żel krzemionkowy. Chemicznie związane fazy stacjonarne posiadają znaczną (od 1 do 5% masy sorbentu) zdolność umiarkowanie selektywnego wychwytu różnorodnych substancji, co umożliwia zminiaturyzowanie procesu ekstrakcji. W praktyce używa się najczęściej komercyjnie przygotowane szklane lub polipropylenowe kolumienki zawierające od 100 mg do 2 g sorbentu zawartego między dwoma porowatymi filtrami oraz system próżniowy ze statywem na odbieralniki, manometrem kontrolnym i zaworem regulującym (Rys. 2). Ponadto w skład systemu wchodzą złącza i zawory umożliwiające łączenie kilku kolumienek tej samej lub różnej wielkości. Ziarna wypełnienia w kolumienkach SPE mają średnicę 40 µm (większą niż stosowane w HPLC) a także nieregularny kształt, co umożliwia szybki przepływ fazy ruchomej. Rys. 2. Schemat rozdziału na pojedynczej kolumience SPE (A) i zestawie podłączonym do próżni (B). 6

7 Ekstrakcja do fazy stałej obejmuje kilka niezbędnych etapów (Rys. 3). Pierwszy etap to przemycie kolumienki wraz z wypełnieniem rozpuszczalnikami mającymi wartość eluotropową większą niż stosowane eluenty. Usuwa się w ten sposób substancje (alkeny C16-C24, alkiloftalany, alkany, silanole, siloksany), które mogą się wyekstrahować z gotowych kolumienek, a ilość ich zależy od producenta. Objętość rozpuszczalników służących do przemywania kolumienek należy ustalić doświadczalnie, najczęściej zaleca się wstępne przemywanie rozpuszczalnikami stosowanymi do elucji w objętości 5-10 razy większej od masy wypełnienia. Następnym etapem jest kondycjonowanie wypełnienia kolumienki (złoża sorbentu), polegające na przygotowaniu powierzchni sorbentu do efektywnej izolacji i wzbogacania analitów z wody. Żel krzemionkowy modyfikowany fazą oktadecylową ma własności lipofilowe (fazy RP nie są zwilżane wodą), dlatego złoże najpierw przemywa się metanolem lub 2-propanolem a następnie mieszaniną wody i 2- propanolu. Do kondycjonowania stosuje się zwykle 5 10 objętości pustych używanej kolumienki (1 objętość pusta = 1,0 1,2 µl/mg sorbentu). W trakcie kondycjonowania łańcuchy węglowodorowe ulegają wyprostowaniu oddalając się od powierzchni sorbentu, tworząc tzw. szczotkę o znacznie powiększonej powierzchni aktywnej. Ważne jest użycie do kondycjonowania rozpuszczalnika o właściwościach najbardziej zbliżonych do właściwości matrycy badanej próbki (wody dejonizowanej dla próbek wodnych) oraz utrzymywanie sorbentu w pełni pokrytego rozpuszczalnikiem do momentu naniesienia próbki (zawsze pierwszą porcję rozpuszczalnika wprowadza się bez użycia podciśnienia, pozwalając jej wsiąknąć w złoże). Kolejnym etapem jest naniesienie na kolumienkę próbki. Jeśli próbka zawiera zawiesinę, przed naniesieniem należy ją odwirować lub przesączyć, aby uniknąć zatkania filtru wlotowego kolumienki. Roztwory wodne zawierające analit przepuszcza się przez kolumienkę z szybkością 1 25 cm3/min przy stosowaniu odpowiedniego podciśnienia (pompka wodna) lub nadciśnienia (sprężony gaz obojętny). Następny etap obejmuje usunięcie z przestrzeni między cząstkami sorbentu oraz z wnętrza jego porów substancji niezwiązanych przez przemycie czystym rozpuszczalnikiem, w którym znajdował się analit. Można zastosować inne rozpuszczalniki, o sile eluotropowej większej, jeśli nie spowodują wymycia analitu. W ten sposób usuwa się ewentualne interferenty pochodzące z matrycy, co zwiększa 7

8 czystość frakcji analizowanej. Resztki rozpuszczalnika przemywającego usuwa się przez suszenie strumieniem powietrza (zasysanym przez pompkę wodną). Czas suszenia zależy od lotności rozpuszczalnika i masy sorbentu i wynosi od 1 20 minut. Ostatnim etapem jest wymycie zatrzymanych na kolumience analitów małą porcją (zależna od wielkości złoża, zwykle µl) odpowiedniego rozpuszczalnika. Rys. 3. Etapy pracy techniką SPE Kolumienki SPE mają następujące zalety: szybkość - kilkukrotnie większa niż w układzie ciecz -ciecz, odtwarzalność - duża, dzięki zmniejszeniu ilości manipulacji z próbką, ekonomiczność zmniejszone zużycie szkła, odczynników i nakładu pracy, możliwość wielokrotnego użycia sorbentu, prostota wyposażenia, bezpieczeństwo znacznie zwiększone na skutek mniejszego zużycia łatwopalnych rozpuszczalników. Niestety metoda ta posiada też wady, a do najistotniejszym możemy zaliczyć: tło pozostawione przez użyty rozpuszczalnik, zatykanie złoża poprzez zawiesiny obecne w próbce, czasami słaba odtwarzalność spowodowana różnicami między kolejnymi partiami sorbentu. II. Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest porównanie dwóch metod oznaczania patuliny w soku jabłokowym z wykorzystaniem techniki wysokosprawnej chromatografii cieczowej do oznaczeń końcowych. Celem ćwiczenia jest także zapoznanie studentów z techniką ekstrakcji w układzie ciecz-ciecz oraz techniką ekstrakcji SPE, jako podstawowych metod przygotowania próbek ciekłych do analizy. 8

9 III. Wykonanie ćwiczenia Studenci pracować będą w dwóch grupach. Każda z grup przygotuje próbki soku jabłkowego do oznaczenia końcowego zgodnie z dwiema opisanymi poniżej procedurami A i B. Następnie (kolejnym tygodniu) przygotowane ekstrakty zostaną poddane analizie z wykorzystaniem techniki HPLC-UV w układzie faz odwróconych, metodą krzywej kalibracyjnej. Na tej podstawie wyznaczony zostanie odzysk analitu z próbek (zgodnie z równaniem 1), co stanowić będzie podstawię do wybrania najbardziej odpowiedniej metody oznaczania patuliny w soku jabłkowym. Odzysk =[(stężenie patuliny w otrzymanym ekstrakcie)/ stężenie patuliny w ekstrakcie przy założeniu 100% odzysku] *100 % (1) Przygotowanie próbek do analiz Każda z grup przygotowuje dwie próbki soku jabłkowego. W tym celu sok, jeśli nie jest klarowny, należy odwirować przez 10 min, 4000 rpm. Następnie przygotować po dwie 5 ml próbki soku i postępować zgodnie z opisem przedstawionym poniżej: PROCEDURA A 1. Do 5 ml próbki soku należy dodać 10 ml octanu etylu i wytrząsać intensywnie przez 1 min, wykorzystując to tego celu wytrząsarkę vortex; warstwę organiczną przenieść do kolby sercówki i proces ekstrakcji powtórzyć. 2. Do połączonych ekstraktów dodać 2 ml wodnego 1,5 % roztworu węglanu sodu i wytrząsać przez 1 min. 3. Poczekać na oddzielenie się faz, a następnie warstwę organiczną przenieść do innej kolby. Pozostałą w kolbie warstwę wodną ponownie ekstrahować 5 ml octanu etylu poprzez intensywne wytrząsanie przez 1 min. 4. Zebrane ekstrakty należy osuszyć poprzez dodanie 2,5 g bezwodnego siarczanu sodu. 5. Ekstrakt przesączyć do kolby sercówki i zatężyć ekstrakt do obj. ok. 0,5 ml. 6. Przenieść do naczynka chromatograficznego i pod delikatnym strumieniem azotu odparować do sucha. 7. Tak przygotowany ekstrakt można przechowywać w zamrażalniku do czasu analiz. 9

10 PROCEDURA B 1. Należy przygotować kolumienkę SPE typu OASIS HLB (firmy Waters S.A.) do izolacji i wzbogacania patuliny z soku jabłkowego. W tym celu należy nie dopuścić do wysuszenia złoża i wszelkie czynności wykonywać sprawnie. W pierwszej kolejności należy przemyć złoże 5 ml metanolu. 2. W celu przygotowania złoża efektywnej izolacji analitów należy nanieść na kolumienkę 5 ml wody. 3. W dalszej części nanosimy na złoże 5 ml soku jabłkowego. 4. Gdy próbka całkowicie wniknęła w złoże, kolumienkę należy przemyć 1 ml 1 % roztworu wodorowęglanu sodu, a następnie 1 ml 1 % kwasu octowego. 5. Po tym zabiegu włączyć pompę wodną i poczekać 10 min celem wysuszenia zloża. 6. Kolumienkę należy umieścić nad naczynkiem chromatograficznym o objętości 4 ml i nanieść na nią 3 ml mieszaniny acetonitryl: eter dietylowy (2+98) w celu wyeluowania patuliny ze złoża. 7. Zebrany ekstrakt należy odparować pod strumieniem azotu do sucha i następnie przechowywać w zamrażalniku do czasu analizy. Analizy uzyskanych ekstraktów (kolejne ćwiczenia) Pomiary wykonane zostaną za pomocą techniki HPLC-UV. Warunki analiz chromatograficznych: oktadecylowa faza stacjonarna C18 detektor UV, długość fali 276 nm faza ruchoma - ACN:woda zakwaszona kwasem octowym do ph 3,5 (10:90, v/v) natężenie strumenie przepływu fazy ruchomej 0,7 ml/min objętość dozowanej próbki - 50 µl Każda z grup zanim przystąpi do analizy przygotowanych wcześniej ekstraktów musi: 1. Przygotować rozwory wzorcowe patuliny w mieszaninie rozpuszczalników odpowiadającym składowi fazy ruchomej o stężeniu: 5 ml/l; 2 mg/l; 1 mg/l; 0,5 mg/l; 0,25 mg/l; Roztwory te należy przygotować w naczynkach chromatograficznych o objętości 2 ml, wychodząc z roztworu wyjściowego patuliny o stężeniu 25 mg/l. 10

11 Tak przygotowane roztwory należy poddać dwukrotnej analizie HPLC-UV. Na podstawie uzyskanych wyników należy sporządzić wykres krzywej kalibracyjnej. 2. Przygotować ekstrakty do analizy poprzez rozpuszczenie suchej pozostałości w 250 ul fazy ruchomej. 3. Tak przygotowane ekstrakty należy poddać 3-krotnej analizie HPLC-UV 4. Ostatecznie należy wyznaczyć odzysk patuliny w obu przetestowanych procedurach zgodnie z równaniem (1) oraz ocenić, która z nich jest bardziej wydajna. Literatura: Kumirska J. i wspołpr., Skrypt elektroniczny Analiza żywności, Gdańsk Stepnowski P. I współpr.., Skrypt elektroniczny Techniki separacyjne, Gdańsk Trucksess M.W., Tang Y., Solid-Phase Extraction Method for Patulin in Apple Juice and Unfiltered Apple Juice, Journal of AOAC International, 82, 1999, Gashlan H. M., High performance liquid chromatographic determination of patulin in apple juice: Investigation of its contamination levels in Saudi Arabia, Scientific Research and Essay, 4, 2009, ZAKRES WYMAGANYCH WIADOMOŚCI Podstawowe pojęcia z wysokosprawnej chromatografii cieczowej oraz analizy miareczkowej. 11