Analiza syntetycznych dopalaczy metodami FT-IR, Raman i GC-IR Autorzy: S. Lowry, M. Bradley i W. Jalenak Kontrola prawna opiera się na listach substancji kontrolowanych. W celu obejścia prawa pokątne laboratoria produkują syntetyczne dopalacze, które są chemicznie powiązane ze związkami o kontrolowanym obrocie, ale są chemicznie na tyle różne żeby stworzyć problemy z ich prawnym zwalczaniem i ściganiem ich dystrybucji. Identyfikacja substancji w celach dowodowych wymaga dokładnej informacji, łącznie ze specyficznością izomeryczną i stereochemiczną. W artykule pokazujemy przykłady, w których spektroskopia FTIR (łącznie z techniką łączoną GC-IR) i spektroskopia Raman w połączeniu z bibliotekami widm referencyjnych mogą dostarczyć informacji o niezbędnej specyficzności z dodatkową zaletą szybkiej analizy. Instytucje na całym świecie podają informacje o rosnącej dystrybucji syntetycznych dopalaczy, łącznie z tak zwanymi "solami kąpielowymi" i kannabinoidami. Amerykańska agencja zwalczania narkotyków (DEA) i inne instytucje rozpoczęły niedawno szeroko zakrojoną akcję rozpoznania wszystkich poziomów globalnego rynku dopalaczy (1). Niewielkie modyfikacje chemiczne, którymi poddawane są znane narkotyki, dają w rezultacie nowe sybstancje o działaniu odurzającym, które nie są na listach stanowych i federalnych substancji zakazanych. Pod względem prawnym słowa takie jak "analogi" pozostawiają miejsce do interpretacji dla sądów. Wyniki procesów mogą zależeć od dokładnego rozumienia znaczenia izomerów pozycyjnych i stereochemicznych, a sądy czy ławy przysięgłych mogą nie mieć kompetencji technicznych do ich oceny. Przy zacieśnianiu prawa możliwość uzyskania wyroków skazujących zależy od wnikliwej analizy kryminalistycznej. Grupa naukowa do analizy przechwytywanych substancji narkotycznych (SWGDRUG, www.swgdrug.org) definiuje spektroskopię w podczerwieni i Raman jako dwie z ograniczonej listy technik analitycznych kategorii A zapewniających potencjalnie nawyższą selektywność (2). Do identyfikacji przechwytywanych narkotyków jest najbardziej pożądane, by użyć techniki kategorii A w połączeniu z przynajmniej jedną inną techniką (kategorii A, B lub C). By wspomóc laboratoria kryminalistyczne w procesie identyfikacji substancji odurzających naukowcy z Cayman Chemical Company, Tennessee Bureau of Investigation (TBI) i Thermo Fisher Scientific podjęli współpracę w celu przygotowania wysokiej jakości referencyjnych bibliotek widm (FTIR metodą ATR, Raman i FTIR par substancji dla dostępnych dopalaczy. W tym artykule chcemy przedyskutować znaczenie spektroskopii FTIR i Raman przy użyciu tych bibliotek w celu identyfikacji dopalaczy w przechwytywanych materiałach (3). Pokazujemy również jak chromatografia gazowa z detekcją IR (GC-IR) umożliwia identyfikację specyficznych izomerów syntetycznych narkotyków w materiałach o złożonym składzie jak np. materiał roślinny. Część eksperymentalna Widma referencyjne FT-IR i Ramana zostały zebrane z pomiarów związków otrzymanych z firmy Cayman Chemical Company. Widma FT-IR zostały zmierzone przy rozdzielczości 2 cm -1 przy użyciu zintegrowanej diamentowej przystawki ATR wbudowanej w spektrometr FTIR Thermo Scientific Nicolet is50. Widma Ramana zostały zmierzone na spektrometrze Thermo Scientific DXR Raman przy wzbudzeniu laserem 532nm, przy siatce 900-linii/mm i szczelinie 25μm. Widma Ramana i FTIR zmierzone dla próbki mefedronu zostały pokazane na rysunku 1, by
zademonstrować komplementarną naturę tych dwóch technik, uwypuklających różne grupy funkcyjne w cząsteczce (4). Rysunek 1: Porównanie widm FT-IR i Ramana mefedronu, substancji psychoaktywnej znanej jako "miau, miau" W tym przykładzie zaznaczyliśmy położenia pasm w celu łatwego porównania z widmami w monografiach SWGDRUG. Widma fazy gazowej GC IR zostały zmierzone w TBI. Wzorce kannabinoidów, "soli kąpielowych" i innych narkotyków zostały rozpuszczone w rozpuszczalnikach (na ogół w metanolu) by uzyskać roztwory 1 mg/ml. Została użyta kolumna kwarcowa 5m o średnicy 0.30mm pokryta związaną fazą poly(1% diphenyl, 99% dimethylsiloxane). Program temperaturowy był następujący: 80 C przez 1min, następnie 70 C/min od 80 C do 270 C i 270 C przez 20 min. Ta kombinacja krótkiej kolumny i szybkiego narostu temperatury została użyta, ponieważ narkotyki mają niską lotność, która może prowadzić do długich czasów retencji. W tych warunkach przechwytywane materiały mogą wykazywać niepełny rozdział (ekstrakty roślinne i obecne zanieczyszczenia), powodując konieczność dalszej analizy jak podano poniżej. Uzyskane widma zostały zgrupowane w bibliotece widm gazowych TBI. Rysunek 2 pokazuje wyniki GC IR dla 3 związków ilustrujących różnice spektralne dla izomerów o wysokim podobieństwie.
Rysunek 2: Porównanie widm w fazie gazowej trzech zbliżonych kannabinoidów Zdolność rozróżniania izomerów jest jedną z głównych zalet zarówno spektroskopii IR jak Ramana Wyniki i dyskusja Fundamentalnym wyzwaniem w laboratoriach kryminalistycznych jest przeprowadzenie kompletnej i pewnej identyfikacji przechwyconych materiałów. W tym celu często jest wykonywane przeszukiwanie spektralne przy wykorzystaniu komercyjnych lub lokalnie sporządzonych blbliotek widm. Przeszukiwanie spektralne obejmuje dopasowanie widma próbki do widma z biblioteki. Najczęściej podawana jest wartość określająca współczynnik podobieństwa w skali 0 1 lub 0 100. Na wartość współczynnika podobieństwa mogą wpływać różnice w technice pomiarowej dla widm w bibliotece i widma próbki. Pokazujemy zarówno specyficzność (to jest odróżnianie izomeru od izomeru) jak niezawodność (w sytuacji kiedy techniki pomiaru się różnią) metody pod kątem identyfikacji syntetycznych dopalaczy. Ponieważ laboratoria mogą wymieniać się danymi i używać bibliotek komercyjnych niezawodność jest krytyczna przy ustaleniu użyteczności metody jako narzędzia dowodowego. Użycie bibliotek referencyjnych dyspersyjnej spektroskopii Ramana z widmami FT- Raman Spektroskopia Ramana dyspersyjna i z transformacją Fouriera (FT) mają swoje zalety i słabości. W tym przypadku sprawdzimy czy biblioteki widm zmierzonych przy pomocy dyspersyjnego spektrometru Ramana mogą być użyte do dopasowania widm z analizy FT- Raman. Z natury rzeczy obie odmiany techniki są czułe na te same drgania cząsteczek ale są w nich subtelne różnice w odstępie danych, rozdzielczości i intensywności pasm, które mogą wpływać na na identyfikację.
Przeszukiwanie widma FT-Raman przy użyciu biblioteki widm Ramana zmierzonych na spektrometrze dyspersyjnym daje wyniki pokazane na rysunku 3. Rysunek 3: Wyniki wyszukiwania dla widma FT-Raman (laser 1064nm). Widma w bibliotece zostały zmierzone przy wzbudzeniu laserem 532nm (Raman dyspersyjny). Algorytm wyszukiwania podaje wartość 96 dla harmalinu. Chociaż musi być zachowany rozsądek tak by ślepo nie sugerować się wartościami dopasowań, wartość 96 jest generalnie uznawana za bardzo dobre dopasowanie. Potwierdza to wiarygodność analizy za pomocą biblioteki widm Ramana zebranych przy użyciu różnych długości fali lasera wzbudzającego. Zidentyfikowana substancja, harmalin, jest psychoaktywnym indolem, które jest spotykany w naturze w niektórych roślinach. Harmalin został zidentyfikowany jako środek rozcieńczający w mieszankach ziołowych zawierających syntetyczne kannabinoidy i może prowadzić do zatrucia w połączeniu z halucynogenną tryptaminą. Harmalin jest kontrolowany m.in. w Australii, Kanadzie i Francji, ale nie jest kontrolowany w USA (z wyjątkiem uregulowań dla użycia go jako dodatku w lekach i żywności). Użycie biblioteki referencyjnej ATR z widmami transmisyjnymi Pomiar techniką ATR w spektroskopii w podczerwieni staje się preferowaną metodą pomiarową ze względu na szybkość i brak pracochłonnego przygotowania próbki. Dzięki minimalnemu (lub wręcz żadnemu) przygotowaniu próbki i szybkiemu pomiarowi ATR może być pierwszą analizą przesiewową kiedy próbki trafiają do laboratorium. Mimo tego wiele laboratoriów kryminalistyczne wciąż preferuje (albo takie ma zatwierdzone procedury) tradycyjne techniki transmisyjne oparte na pomiarze tabletek w KBr lub zawiesin w oleju mineralnym (nujolu) (5). Widmo transmisyjne pokazane na górze na rysunku 4 zostało uzyskane z pomiaru harmalinu w nujolu.
Rysunek 4: Wyniki wyszukiwania dla próbki zmierzonej jako zawiesina w nujolu (oleju mineralnym) wobec biblioteki referencyjnej utworzonej z widm zmierzonych techniką ATR po poddaniu ich zaawansowanej korekcji ATR. Silne pasma C-H pochodzące od nujolu zostały usunięte (wycięte a nie odjęte) przed przeszukiwaniem. Widma w bibliotece referencyjnej zmierzone przy użyciu diamentowej przystawki ATR zostały poddane przetwarzaniu przy użyciu algorytmu zaawansowanej korekcji ATR, który normalizuje intensywność i kształt pasm tak by odpowiadały one widmom transmisyjnym (6). Próbka została prawidłowo zidnetyfikowana jako harmalin ze współczynnikiem podobieństwa 93. Podobne wyniki otrzymuje się w odwrotnej sytuacji kiedy widma ATR są korygowane i porównywane z istniejącymi bibliotekami widm opartymi na pomiarach transmisyjnych, które historycznie były najczęstszą bazą przy tworzeniu bibliotek. Ta wzajemna wymienność pozwala laboratoriom na używanie cały czas starszych bibliotek widm (transmisyjnych). Używanie referencyjnej blblioteki widm ATR z widmami mierzonymi przy użyciu przenośnych spektrometrów FTIR Praca w terenie wymagająca natychmiastowej identyfikacji staje się coraz bardziej powszechna. Pomiar danych na miejscu zdarzenia dostarcza zarówno materiałów dowodowych jak też zapewnia bezpieczeństwo osobom pracującym narażonym na działanie znalezionych substancji. Rysunek 5 pokazuje zmierzone przy pomocy aparatu przenośnego widmo IR białego proszku znalezionego w pokątnym laboratorium.
Rysunek 5: Wyniki przeszukiwania dla widma zmierzonego w terenie przy pomocy przenośnego spektrometru FTIR Wyniki przeszukiwania off-line przy użyciu zewnętrznej refrencyjnej bibliotek widm ATR dały najlepsze dopasowanie dla chlorowodorku 3-metylmetkatynonu (3-MMC) ze współczynnikiem podobieństwa 93. Wynik: bardzo dobre dopasowanie zostało uzyskane w terenie dla próbki o wątpliwej czystości w warunkach dalekich od idealnych (7,8). Substancja 3-MMC jest psychoaktywnym syntetycznym katynonem, który został zidentyfikowany w "solach kąpielowych". W większości krajów ten związek został uznany za nielegalny, zarówno explicite jak też jako analog struktualny mefedronu (4-MMC), dla którego istnieje dłuższa historia ograniczeń prawnych. Używanie referencyjnej biblioteki widm ATR staje wobec wyzwania kiedy ma się do czynienia z mieszaninami z pokątnych laboratoriów gdzie rzadko są surowe zasady kontroli jakości, co prowadzi do powstania produktu, który może być mieszaniną dwóch lub więcej aktywnych składników oraz prekursorów i zanieczyszczeń. Ponadto proces ścigania przestępstw wymaga dokładnej i kompletnej informacji o próbce. Widma IR i Ramana odzwierciedlają w tych przypadkach złożony charakter produktu, a identyfikacja poszczególnych składników jest wciąż wymagana. Próbka została zmierzona techniką ATR i wykonano proste (jednoskładnikowe) przeszukiwanie biblioteki referencyjnej ATR. Takie podejście dało wynik o niskim współczynniku dopasowania - poniżej 70 - a sporo pasm nie zostało przypisanych. Istnieją jednak dalsze opcje analizy, z których najlepszą jest zaawansowana technika analizy statystycznej taka jak wyszukiwanie wieloskładnikowe (MCS). Rysunek 6 pokazuje wyniki wyszukiwania wieloskładnikowego (MCS) dla próbki przy użyciu oprogramowania Thermo Scientific OMNIC Specta.
Rysunek 6: Wyniki wyszukiwania wieloskładnikowego dla próbki. Automatyczny wybór dwóch składników z biblioteki ATR daje wysoki współczynnik dopasowania dla widma sumarycznego w porównaniu z widmem próbki. Wyniki podobne do tego sprawiają, że analiza FT-IR-MCS staje się preferowanym podejściem jako pierwsza analiza przesiewowa, będąc dużo szybszym sposobem niż większość alternatywnych technik analitycznych. CB-52 jest względnie nowym kannabinoidem syntetycznym, dla którego krąży wiele pytań dotyczących jego skuteczności. Zostały wykazane efekty terapeutyczne na myszach, ale jest niewiele raportów dotyczących jego oddziaływania na ludzi. AM-1241 jest znanym, skutecznym i selektywnym związkiem o działaniu agonistycznycm dla jednego z kluczowych receptorów kannabinoidów w organizmie ludzkim. Używanie bibliotek widm w fazie gazowej z wynikami uzyskiwanymi metodą GC-IR Metkatynony często pojawiają się na rynku oznakowane jako sole do kąpieli albo nawozy dla roślin ( produkt nie jest przenaczony do konsumpcji"). Kannabinoidy mogą być sprzedawane jako powłoki na materiale roślinnym oznakowane jako "potpourri". W obu przypadkach prosta analiza metodą IR lub Ramana może nie dawać jednoznacznych wyników, ponieważ substancja psychoaktywna może być przykryta przez informacje pochodzące od matrycy. Technika GC IR oferuje skuteczne narzędzie rozdziału i identyfikacji substancji (9). Próbki potpourri są namaczane w małej ilości rozpuszczalnika takiego jak metanol. Po takim "przemyciu" kropla rozworu jest zasysana do strzykawki GC. Próbki proszkowe są rozpuszczane bezpośrednio i zaciągane do strzykawki. W przeciwieństwie do bardziej czułej metody GC-MS, w technice GC IR próbka pozostaje nienaruszona (nie jest fragmentowana) w związku z czym można uzyskać informacje o izomerach i stereochemii.
W pomiarze GC-IR zostały wybrane warunki GC wymuszające szybką elucję, co powoduje, że sygnały chromatograficzne nakładają się tak jak to pokazuje wstawka na rysunku 7 Rysunek 7: Wynik GC IR dla mieszaniny narkotyków wyekstrahowanej z podejrzanej próbki potpourri Najwyższy sygnał pochodzi od składników wymywanych jednocześnie i w związku z tym powiązane widmo jest złożeniem widm mieszaniny. Wyszukiwanie wieloskładnikowe daje dobre dopasowanie dla mieszaniny dwóch kannabinoidów. Mimo nakładających się sygnałów dane IR pozwalają na jednoznaczne zidentyfikowanie specyficznych izomerów. AM-2201 jest silną substancją o działaniu agonistycznym dla kannabinoidów, dla której notowano przypadki ataków paniki, zaburzeń ruchu i wymiotów JWH-210 jest silnym środkiem przeciwbólowym, który działa także jak związek agonistyczny dla receptorów kannabinoidów. Oba są w wielu krajach na listach substancji zakazanych Wnioski Znaczenie identyfikacji nowych związków syntetycznych sprzedawanych jako "legalne dopalacze" rośnie wraz z dystrybucją tych substancji na cąłym świecie. Wyniki powyższej oceny możliwości analitycznych potwierdzają wartość dedykowanych bibliotejk widm w połączeniu ze spektrometrami FT-IR i Ramana w celu szybkiej analizy przesiewowej i identyfikacji dopalaczy. Doskonałe wyniki zostały uzyskane przy użyciu referencyjnych bibliotek widm nawet przy wykorzystaniu starszych technik pomiarowych i różnych typów spektrometrów. Planujemy dodawanie do bibliotek nowych związków w miarę jak będą się pojawiały. Bibliografia:
(1) DEA Website announcement of synthetic drug crackdown: http://www.justice.gov/dea/divisions/hq/2014/hq050714.shtml. (2) SWGDRUG Recommendations Edition 6.1 (2013-11-01), www.swgdrug.org, (2013-11-01). (3) S. Angelos and M. Garry, Forensics Magazine 08, 5 (2011) (4) E.G. Bartick, in Handbook of Vibrational Spectroscopy, J.M. Chalmers and P.R. Griffiths, Eds. (John Wiley and Sons, Ltd., New York, 2002), pp. 2993 3004. (5) S. Kumar, P, Joshi, and A. Raivanshi, Internet Journal of Forensic Science 4, (2008). (6) B. Lavine, A. Fasasi, N. Mirjankar, K. Nishikida, and J. Cambell, Appl. Spectrosc. 68, 608 615, (2014). (7) E. Bukowski and J. Monti, Am. Lab. 39, 16 19 (2007). (8) C. Goh, W. van Bronswijk, and C. Priddis, Appl. Spectrosc. 62, 640 648 (2008). (9) G. Everrett, W. Stanton, and M. Bradley, Thermo Scientific Application Note 52418, (2012). Polecamy rozwiązania Thermo Scientific do analizy dopalaczy - spektrometry FT-IR Nicolet is5, Nicolet is10, spektrometr Ramana DXR oraz system GC-IR Nicolet is50+trace GC+opcjonalnie moduł FT-Raman