CAMERA SEPARATORIA Volume 7, Number 1 / June 2015, pp. 70-86 Judyta KOSIŃSKA 1, Monika ŚMIEŁOWSKA 1,Marian KAMIŃSKI 1* 1 Katedra Inżynierii Chemicznej i Procesowej, Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej, 80-233 Gdańsk, ul, Narutowicza 11/12 * Autor do korespondencji, e-mail: markamin@pg.gda.pl Badania nad rozdzielaniem grupowym technikami sorpcji i chromatografii. Część I Wykorzystanie chromatografii cienkowarstwowej (TLC) dla doboru warunków rozdzielania tłuszczów i produktów ich konwersji technikami kolumnowymi. Streszczenie: Przeprowadzono badania wyjaśniające wpływ eluentu oraz fazy stacjonarnej na wartość parametrów elucji mono-, di-, triacylogliceroli oraz wolnych kwasów tłuszczowych, eluowanych w warunkach cienkowarstwowej chromatografii cieczowej (TLC). Celowo wykorzystano sorbenty inne niż kopolimer styrenu i di -winylobenzenu (SDVB). Starano się dobrać taki eluent, ab y możliwe było rozdzielanie tłuszczów za pomocą chromatografii wykluczania z kontrolowaną sorpcją. W przyszłości rozwiązania te powinny zastąpić drogie kolumny z wypełnieniem SDVB. Modyfikując warunki rozdzielania można znacznie zmieniać rozdzielczość i selektywność układów rozdzielczych. Dobór optymalnego składu eluentu i programu elucji powinien być dokonywany z zastosowaniem techniki TLC, co znacznie przyspiesza dobór optymalnych warunków separacji. Słowa kluczowe: chromatografia cieczowa, TLC, GPC/SEC, rozdzielanie tłuszczów, oddziaływania sorpcyjne Studies on group separation using sorption and chromatographic techniques. Part I Usefulness of thin layer chromatography (TLC) in conditions pre-selection for separation of fats and their conversion products using column techniques. Abstract: This paper shows results of investigations explaining influence of the type of the eluent and the nature of the stationary phase for elution parameters of model compounds eluted in the thin layer chromatography (TLC ) conditions. Separation of mono-, di-, triglycerides and free fatty acids was performed using TLC plates dedicated to normal phase chromatography (silica gel Si60 F 254 ) and reversed phase chromatography (oktadecylosilan phase RP18 F254 ). Single-step elutions using eight selected eluents of varying elution strength were carried out. Performed studies revealed that certain modifications of separation conditions can lead to changes in resolution and selectivity of separation systems. Studies were conducted to create model separation systems and to examine which model system gives such good results of tested compounds separation that it is worth to transfer the best conditions to a larger scale to studies using column liquid chromatography. Sorbents other than a copolymer of styrene and divinylbenzene (SDVB) were used intentionally, and the aim was to select an appropriate eluent which would allow for separation of fats using size exclusion chromatography with controlled sorption. In the future, this solution should replace expensive SDVB packed columns. Key words: liquid chromatography, TLC, GPC/SEC, separation of fats, sorption interactions 1. WSTĘP (Introduction) Podczas poszczególnych etapów otrzymywania tłuszczów jadalnych wymagana jest ścisła kontrola jakości, w tym składu produktu końcowego. Kontrola powinna też obejmować tłuszcze podczas ich przetwarzania oraz użytkowania. Ma to znaczenie między innymi ze względu na możliwość powstawania izomerów trans o potencjalnym działaniu rakotwórczym, wieloni enasyconych kwasów tłuszczowych, czy produktów polimeryzacji, hydrolizy lub/i utleniania tłuszczów. Poza tym analityka tłuszczów jadalnych dostarcza informacji na temat składu w zakresie kwasów tłuszczowych oraz zawartości naturalnych składników o cenionych walorach żywieniowych (kwasy omega-3, tokoferole, fitosterole) oraz pozwala na kontrolowanie usunięcia substancji zbędnych, których obecność może stanowić zagrożenie zdrowia konsumenta (m. in. pozostałości pestycydów, wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (WWA), trwałe zanieczyszczenia organiczne (TZO)) [1-3].
71 Przeprowadzanie kontroli jakości tłuszczów, czy produktów ich konwersji, wymaga zapewnienia odpowiednich procedur i narzędzi. W badaniach tłuszczów i produktów ich konwersji pod względem składu, w zakresie kwasów tłuszczowych, stosowane obecnie, znormalizowane metodyki i procedury, w przeważającej większości wykorzystujące kapilarną chromatografię gazową (CGC), są pracochłonne na etapie przygotowania próbki do badań (zmydlanie, tworzenie estró w metylowych kwasów tłuszczowych (FAME)). Wykonanie oznaczeń składu wymaga bardzo sprawnej kolumny i jest czasochłonne. Analityka tłuszczów i produktów ich konwersji związana jest z potrzebą posiadania dostatecznie czystych wzorców. Te otrzymuje się dzięki wieloetapowemu rozdzielaniu z tłuszczów czy produktów ich konwersji albo dzięki syntezie i wydzieleniu czystych składników z mieszaniny poreakcyjnej na drodze rozdzielania. Wiąże się to z potrzebą stworzenia warunków, pozwalających na selektywne rozdzielanie, oznaczanie, a także otrzymywanie wzorców analitycznych w postaci czystych indywiduów chemicznych określonych acylogliceroli, kwasów tłuszczowych i innych składników. W Tab.1. zestawiono oraz scharakteryzowano najważniejsze znormalizowane metodyki wykorzystujące rozdzielanie chromatograficzne w analityce tłuszczów i ich pochodnych. W przypadku badań nad zastosowaniem sorpcyjnej kolumnowej wysokosprawnej chromatografii cieczowej HPLC do rozdzielania oraz oznaczania tłuszczów, ich pochodnych i produkt ów konwersji, warto wykorzystać cienkowarstwową chromatografię cieczową jako technikę pilotową (przy wykorzystaniu sorbentów tak polarnych, jak i hydrofobowych oraz eluentów o zróżnicowanej sile elucyjnej). Chromatografia cienkowarstwowa była przed laty powszechnie stosowana. Obecnie jest nadal używana do rozdzielania tłuszczów i produktów ich konwersji, a przede wszystkim do orientacyjnej oceny składu. Zastosowanie normalnego układu faz (NP) pozwala na rozdzielanie grup związków chemicznych o różnej polarności. W odwróconych układach faz (RP) ma miejsce selekcja cząsteczek lipidów i ich pochodnych, które należą do tej samej klasy w zakresie polarności, ale różnią się hydrofobowością. Najczęściej używaną fazą stacjonarną w technice NP -TLC jest żel krzemionkowy, czasem tlenek glinu lub ziemia okrzemkowa (szczególnie dawniej). Obecnie prym wiodą żel krzemionkowy modyfikowany chemicznie grupami R-NH 2, R-CN, DIOL dla warunków NP lub C-18, C-8, grupami alkilofenylowymi dla warunków RP [13]. Interesującym zastosowaniem jest użycie jako fazy stacjonarnej w chromatografii cienkowarstwowej, a także w kolumnowej, sorbentów impregnowanych azotanem (V) srebra, kwasem borowym lub kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA). W tab. 2. przedstawiono najważniejsze zastos owanie wyżej wspomnianych impregnowanych sorbentów. Technika cienkowarstwowej chromatografii cieczowej TLC (Thin Layer Chromatography) posiada niewątpliwe zalety w postaci prostoty wykonania badań, niskich kosztów sprzętu, niewielkiego zużycia eluentów. Plamki na chromatogramach TLC można obserwować pod lampą UV 254 nm (płytki typu F-254 z fluoresceiną ) albo 365 nm (wykazujące fluorescencję struktury aromatycznej) lub wywoływać żółtobrunatną barwę adduktów I 2 w oparach jodu nie dotyczy to jednak składników obecnych w bardzo niskich lub śladowych zawartościach. Istotnymi wadami TLC jest względnie niska rozdzielczość oraz często niska czułość. Bardzo trudna realizacja elucji gradientowej, którą zastępuje się w praktyce najczęściej elucją skokową. Technik a TLC jest też nieprzydatna do rozdzielania i badania lotnych związków chemicznych. Wpływ stopnia nasycenia komory chromatograficznej parami eluentu na rozdzielanie analitów, przenoszenie warunków rozdzielania pod względem wartości parametrów, takich jak: współczynnik retencji (k), współczynnik selektywności (α) w warunkac h NP-TLC powoduje, że przenoszenie tych parametrów z TLC do chromatografii kolumnowej NP - HPLC nie daje identycznych rezultatów [18]. Najczęściej w HPLC wartości k są wyższe niż dla TLC. Mi mo to, cienkowarstwowa chromatografia cieczowa dostarcza istotnych informacji na temat zależności składu eluentu i rodzaju fazy stacjonarnej, tzn. wpływu parametrów układu chromatograficznego na rozdzielanie. Technika TLC może i powinna być stosowana jako technika pilotowa w doborze optymalnych warunków elucji i rozdzielania dla techniki HPLC.
72
73 Tab. 2. Zastosowanie impregnowanych sorbentów w rozdzielaniu tłuszczów za pomocą TLC lub HPLC w zależności od zastosowanego impregnatu fazy stacjonarnej Tab. 2. The use of impregnated sorbents in the separation of fats by TLC or HPLC depending on the applied impregnant of the stationary phase Impregnat Zastosowanie Publikacje Azotan (V) srebra Rozdzielanie tłuszczów na grupy związków chemicznych, [14-15] posiadające tę samą liczbę i konfigurację wiązań podwójnych, tzn. rozdzielanie izomerów cis/trans. Kwas borowy Rozdzielanie izomerów diacylogliceroli oraz izomerów [13,16] fosfolipidów. Kwas etylenodiaminotetraoctowy Rozdzielanie fosfolipidów kwasowych. [17] W tej pracy uwzględniono żel krzemionkowy oraz sorbent typu C18 oktadekan związany wiązaniem siloksanowym z żelem krzemionkowym (tzw. RP18), jako fazy stacjonarne oraz związki chemiczne należące do różnych grup w zakresie polarności oraz hydrofobowości, jako substancje modelowe. Tabela związków modelowych obejmuje także substancje lotne (Tabela 3). Badania niniejszej pracy dotyczą przede wszystkim tłuszczów i produktów ich konwersji, tzn. acylogliceroli, kwasów tłuszczowych i gliceryny. Zostały też wykonane badania w odniesieniu do niżej polarnych i bardziej hydrofobowych wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych (WWA) oraz nisko dyspersyjnych polistyrenów, a także reprezentantów innych grup, bardziej polarnych i mniej hydrofobowych związków chemicznych, rozpuszczalnych w różnym stopniu w rozpuszczalnikach organicznych. Kolejne prace będą dotyczyły bardziej szczegółowo innych grup związków chemicznych i innych rodzajów sorbentów. Cele programu badań, których jeden z etapów zrealizowano w tej pracy, to: 1. Opracowanie ogólnych zasad grupowego rozdzielania, techniką kolumnowej elucji wysokosprawnej (HPLC) lub ultrasprawnej (UPC) chromatografii cieczowej, organicznych związków chemicznych, rozpuszczalnych w określonych rozpuszczalnikach organicznych, z uwzględnieniem parametrów elucji i retencji związków chemicznych o szerokim zakresie polarności i hydrofobowości, począwszy od bardzo nisko polarnych składników ropy naftowej i jej produktów, badanych przez nasz zespół od wielu lat w zakresie rozdzielania grupowego, poprzez acyloglicerole (TAG triacyloglicerole, DAG diacyloglicerole, MAG monoacyloglicerole), wolne kwasy tłuszczowe (WKT) i ich estry metylowe (FAME) czy etylowe (FAEE), ketony, alkohole, aldehydy, kwasy karboksylowe, hydroksykwasy i keto kwasy oraz ich estry, amidy, imidy itp., a także naftochinony, polifenole i inne metabolity roślinne, grzybowe lub bakteryjne z uwzględnieniem rozpuszczalnych w acetonitrylu aminokwasów, peptydów oraz białek, czy kwasów nukleinowych i nukleotydów. Badania niniejszej serii prac nie obejmują związków chemicznych rozpuszczalnych wyłącznie w wodzie lub roztworach buforowych, tzn. cukrów, amin biogennych itp. Przedmiotowe rozdzielania grupowe ma być docelowo realizowane technik a HPLC w skali semipreparatywnej lub preparatywnej oraz przede wszystkim ma dotyczyć otrzymywania w czystej postaci wybranych indywiduów organicznych związków chemicznych, jako tzw. wzorców analitycznych, a także w formie użytkowej, np. dla dokładnego badania ich właściwości fizykochemicznych, jako substratów do dalszych syntez, a być może także jako naturalnych składników leków. Technika cienkowarstwowej elucyjnej chromatografii cieczowej z polarną fazą stacjonarną (NP) albo hydrofobową fazą stacjonarną C18 (RP), służy tu jako metodyka badań pilotowych, informująca o orientacyjnych wartościach parametrów elucji (R f ), retencji (k) i selektywności ( ) dla określonego rodzaju faz stacjonarnych i odpowiednich dla nich eluentów o różnych wartościach siły elucji dla określonego sorbentu i eluowanych składników modelowych rozdzielanych mieszanin. 2. W przypadku wielu mieszanin rozdzielanych związków chemicznych pochodzenia naturalnego, rozdzielanie grupowe, będące przedmiotem niniejszej serii prac powinno być w pierwsz ym etapie wykonywane techniką HPLC z zastosowaniem klasycznych warunków lipofilowego wykluczania. W tym celu stosuje się obecnie kosztowne kolumny HPLC najczęściej wypełnione porowatym, kulistym kopolimerem styrenu i di-winylobenzenu (SDVB) o określonej średniej wartości średnic porów wewnątrzziarnowych. Płytki TLC pokryte warstwą tego rodzaju sorbentu nie są dostępne, w tym także z tej przyczyny, że dla realizacji elucji i rozdzielania w warunkach wykluczania (GPC-SEC Gel Permeation Chromatography / Size Exclusion Chromatography) musiałyby być one bardzo długie, tak więc badania techniką klasycznej GPC-SEC będą wykonywane wyłącznie techniką kolumnową. Mimo to niektóre warunki rozdzielania techniką GPC-SEC z zastosowaniem tetrahydrofuranu (THF), ewentualnie innych rozpuszczalników, jak dichlorometanu (DCM), acetonu, dimetylosulfotlenku (DMSO), dimetyloformamidu (DMF), jako eluentu mogą być też modelowane z zastosowaniem techniki TLC, szczególnie z płytkami typu C18 lub Phenyl (np. oddziaływania hydrofobowe lub kwadrupolowe na powierzchni sorpcyjnej). Dotyczy to
74 układów TLC z płytkami z fazą stacjonarną C18 albo Phenyl czy CN oraz z eluentami wykazującymi bardzo wysokie siły elucji względem fazy typu C18 lub Phenyl lub CN, tzn. z zastosowaniem THFu, ace tonu, metyloetyloketonu (2-butanonu), eteru tert -butylowo-metylowego (MTBE) lub eteru tert -butylowo-etylowego (ETBE), eteru diizopropylowego (ip-o-ip) lub dietylowego (Et -O-Et) albo DCMu lub chloroformu (CHCl 3 ), jako eluentów. Wówczas otrzymane wnioski można najprawdopodobniej przenieść do warunków wykorzystania SDVB do elucji i rozdzielania. Ta kwestia jest także przedmiotem niniejszej serii publikacji. Wstępne wnioski zastosowania RP-TLC do modelowania GPC-SEC-SDVB zamieszczono także w niniejszej pracy. 3. Należy jednak stwierdzić, że podstawowym celem tej części badań niniejszej serii prac, jest idea zastąpienia kolumn SDVB, kolumnami typu C18 lub Phenyl albo CN, w badaniach z wykorzystaniem GPC/SEC w warunkach lipofilowych. Powodzenie jest uwarunkowane dobraniem takiego składu eluentu, albo takiego eluentu jednoskładnikowego, że zapewni on brak oddziaływań sorpcyjnych, także o charakterze van der Waalsa, wszystkich składników eluowanych mieszanin z powierzchnią fazy stacjonarnej typu C18 lub Phenyl lub CN, tzn. energia oddziaływania eluentu z fazą stacjonarną winna być co najmniej rząd wyższa, niż energia oddziaływań któregokolwiek ze składników rozdzielanej mieszaniny. Najprawdopodobniej nie jest to możliwe w przypadku elucji wysokowrzących i niskopola rnych składników ropy naftowej, ale powinno być możliwe w przypadku gliceryny, acylogliceroli, WKT, a być może i FAME. Wówczas, ze wszech miar celowe by było zastąpienie w warunkach GPC-SEC SDVB za pomocą C18 lub Phenyl. Dodatkowo, niekiedy korzystny może być taki dobór składu eluentu w warunkach wykorzystania hydrofobowych faz stacjonarnych HPLC do chromatografii wykluczania z jednoczesnymi słabymi oddziaływaniami sorpcyjnymi (GPC-SEC-RP) by bardziej hydrofobowe a jednocześnie mniejsze cząsteczki były nieco silniej sorbowane na powierzchni fazy stacjonarnej, niż większe i niżej hydrofobowe molekuły. Taka sytuacja może mieć miejsce w przypadku niektórych polifenole, gdy pochodne mniejszego naftalenu, mają więcej grup hydroksylowych czy karboksylowych lub tlenowych niż pochodne większego fenantrenu czy antracenu, albo pirenu. Jednakże odwrotne sytuacje są znacznie częstsze, tzn. gdy ze wzrostem masy cząsteczkowej / wielkości cząsteczek wzrasta ich hydrofobowość i jednocześnie spada polarność. Wówczas bardziej korzystne od warunków GPC-SEC-RP, powinny być warunki GPC-SEC-NP! 4. Najważniejszym elementem celu serii przygotowywanych publikacji jest zbadanie możliwości oraz zakresu przydatności jednoczesnego wykorzystania do rozdzielania grupowego warunków wykluczani a oraz słabej polarnej adsorpcji GPC-SEC-NP. Takie postępowania powinno mieć ogromny zakres zastosowań, ponieważ prawie regułą jest, że w zakresie określonych grup organicznych związków chemicznych ma miejsce wzrost ich polarności i spadek hydrofobowości w miarę zmniejszania się wielkości cząsteczek. Typowym przykładem są: TAG/DAG/MAG, czy FAME/WKT, czy poliglikole, czy poliestry, lub polifenole o takich samych lub rosnących liczbach grup hydroksylowych oraz grup karboksylowych ze zmniejszaniem się cząsteczek, a także alkohole alifatyczne, ketony alifatyczne, kwasy karboksylowe, kwasy -karboksylowe, - ketokwasy itd. Wówczas stosowanie warunków klasycznej chromatografii wykluczania wymaga bardzo długiej i bardzo wysoce sprawnej kolumny do rozdzielania związków chemicznych mało różniących się wielkością cząsteczki. Na przykład, dla rozdzielania etanolu, metanolu i wody do linii bazowej w warunkach klasycznej chromatografii wykluczania, potrzeba kolumny o co najmniej N=100 000 półek teoretycznych, gdy z zastosowaniem optymalnych warunków GPC-SEC-NP wystarczy około 1 000 półek teoretycznych. Podstawowym zadaniem niniejszej pracy, oprócz zaprezentowania i uzasadnienia powyższych idei, jest jak opisano powyżej. Celem niniejszej, pierwszej z serii kilku prac, jest zbadanie zależności między parametrami retencji i selektywności, a także wpływu rozpuszczalności w eluencie, wybranych związków chemicznych, traktowanych jako substancje modelowe reprezentujące określone grupy związków chemicznych, eluowane i rozdziel ane w warunkach sorpcji-desorpcji oraz chromatografii techniką cienkowarstwowej chromatografii cieczowej TLC, a rodzajem fazy stacjonarnej i składem eluentu. Przy czym, w badaniach należy wziąć pod uwagę także problem ewentualnej ograniczonej rozpuszczal ności składników badanych mieszanin w stosowanych eluentach, szczególnie składników względnie polarnych w niskopolarnych eluentach lub odwrotnie. Dalekosiężnym celem niniejszej serii publikacji jest opracowanie zasad ogólnych oraz nowych/zaktualizowanych procedur wielowymiarowego (nd) i wielokolumnowego (NC) rozdzielania wieloskładnikowych mieszanin w celu otrzymywania czystych grup związków chemicznych lub czystych indywiduów. 2. CZĘŚĆ EKSPERYMENTALNA (Experimental) 2.1. Rozpuszczalniki i eluenty (Solvents and eluents)
75 W badaniach zastosowano następujące eluenty: tetrahydrofuran cz.d.a. POCh (Polska), dichlorometan cz.d.a. POCh (Polska), n-heksan do HPLC Merck (Niemcy), izopropanol cz.d.a. POCh (Polska), aceton cz.d.a. POCh (Polska), eter tert-butylowo-metylowy do HPLC Merck (Niemcy). 2.2. Substancje wzorcowe i próbki badane (Reference substances and examined samples) Monooleinian glicerolu 99% Sigma-Aldrich (USA), monopalmitynian glicerolu 99% Sigma-Aldrich (USA), dioleinian glicerolu 99% Sigma-Aldrich (USA), trioleinian glicerolu 99% Sigma-Aldrich (USA), kwas stearynowy 98,5% Sigma-Aldrich (USA), kwas erukowy 99% Dr Theodor Schuchardt (Niemcy), olej rzepakowy Kujawski (Polska). 2.3. Płytki TLC (TLC plates) W części doświadczalnej dotyczącej cienkowarstwowej chromatografii cieczowej wykorzystano płytki aluminiowe do TLC: Si 60, F 254 Merck (Niemcy) oraz RP-18, F 254 Merck (Niemcy). 2.4. Aparatura (Instruments) Zestaw do rozwijania chromatogramów cienkowarstwowych oraz wizualizacji plamek składający się z: komór chromatograficznych, strzykawki do nanoszenia próbek na płytki chromatograficzne w postaci plamek pod wyciągiem laboratoryjnym (dygestorium), lampy UV o dwóch zakresach długości promieniowania (254 nm oraz 365 nm) do wizualizacji chromatogramów, eksykator z jodem do wywoływania chromatogramów, eksykator z chlorkiem wapnia do przechowywania płytek; Zestaw do odparowania rozpuszczalnika w strumieniu azotu, w skład którego wchodzą: butla z gazem obojętnym (N 2 ); pokrywa firmy J.T. Baker (Niemcy) wykonana z poliamidu, wyposażona w igły oraz podłączenie gazu; metalowy statyw, w którym umieszcza się fiolki z próbkami; wypływ azotu umieszczony nad powierzchnią odparowywanej cieczy; Waga analityczna Radwag. 2.5. Metody postępowania (Methods) Procedura badania parametrów elucji za pomocą chromatografii cienkowarstwowej Wstępny dobór optymalnych warunków rozdzielania mono -, di-, triacylogliceroli oraz wolnych kwasów tłuszczowych wykonano, wykorzystując płytki TLC dedykowane chromatografii w normalnym (żel krzemionkowy Si60 F 254 ) oraz odwróconym (faza oktadecylosilanowa RP18 F254 ) układzie faz. Zastosowano zestaw ośmiu eluentów, charakteryzujących się różną, najczęściej względnie wysoką, siłą elucji: izopropanol (izooh), aceton (ACET), MTBE:izoprpoanol (MTBE:izoOH 3:1 v/ v), eter tert-butylowometylowy (MTBE), tetrahydrofuran (THF), dichlorometan (DCM), n -heksan:popan-2-ol (nc6:izooh 3:1 v/v), n-heksan (nc6). Jedynie n-heksan i dichlorometan charakteryzowały się niską siłą elucji w warunkach NP - TLC oraz nietypowymi oddziaływaniami sorpcyjnymi w przypadku RP-TLC (jak i inne eluenty w przypadku warunków RP brak wody w eluencie). Wykonano szereg elucji, dozując, na płytki obu rodzajów sorbentu, za pomocą strzykawki po 5 μl każdego z roztworów w dichlorometanie, tj.: mieszaniny polistyrenów, mieszaniny związków hydrofobowych z dodatkiem benzo-a-pirenu, mieszaniny związków polarnych, mieszaniny tłuszczów, oraz po 2 μl roztworów pojedynczych acylogliceroli, kwasu erukowego i próbki oleju rzepakowego w acetonie. Dozowanie wykonywano pod wyciągiem laboratoryjnym. Wysoka lotność CH 2 Cl 2 oraz acetonu zapewniała natychmiastowe odparowanie rozpuszczalnika oraz niewielkie wymiary plamek. Następnie płytki umieszczono w pozycji pionowej w komorach wysyconych parami poszczególnych rozpuszczalnikó w. Po rozwinięciu chromatogramów płytki suszono, a efekty rozdzielania obserwowano pod lampą UV, emitującą promieniowanie o długości 254 oraz 365 nm tzw. wizualizacja w świetle UV. Dla każdego etapu wizualizacji plamek stosowano inny charakter linii obwiedni plamek, tzn. linia ciągła odpowiadała wizualizacji w świetle o długości 254 nm, natomiast linia przerywana wizualizacji w świetle o długości 365 nm. Ostatnim etapem wywoływania chromatogramów było umieszczenie płytek na 10 min. w eksykatorze z jodem (w oparach jodu) i obserwacja brązowych plamek, które powstały na skutek kontaktu z parami jodu. Warto nadmienić, iż brązowe zabarwienie plamek pojawiało się tylko wtedy gdy w strukturze danej substancji badanej obecne były wiązania podwójne w łańcuchu węglowym. Przykładowo, w przypadku kwasu erukowego obserwowano brązowe zabarwienie plamek, natomiast kwas stearynowy nie wykazywał tej
76 cechy. Wszystkie obserwacje uzyskane po rozwinięciu chromatogramów na płytkach TLC dokumentowano obrysowując plamki ołówkiem oraz wykonując fotografie. Retencję substancji rozdzielanych określono, obliczając współczynnik opóźnienia R f oraz współczynnik retencji k. Tab.3. Zestawienie badanych próbek. Tab.3. List of examined samples. Nazwa próbki Składniki Stężenie roztworu pojedynczego związku chemicznego TAG/DAG/MAG/WKT 1) trioleinian glicerolu 25 mg/ml 2,5 mg/ml ZWIĄZKI POLARNE 1) metanol 2) etanol 3) woda 4) gliceryna 5) dimetyloformamid 6) kwas octowy 7) kwas mlekowy 8) kwas benzoesowy 9) aceton 2) dioleinian glicerolu 25 mg/ml 2,5 mg/ml 3) monooleinian glicerolu 25 mg/ml 2,5 mg/ml 4) kwas erukowy 25 mg/ml 2,5 mg/ml --- po 1 mg/ml Stężenie każdego związku w roztworze mieszaniny związków chemicznych ZWIĄZKI NIEPOLARNE 1) benzen 2) ksylen 3) naftalen 4) antracen 5) metyloantracen 6) fenantren 7) piren 8) koronen 9) cykloheksan POLISTYRENY + STYREN 1) 2,75*10 6 --- po 1 mg/ml 2,1 mg/ml OLEJ RZEPAKOWY 2) 1,2*10 6 2,5 mg/ml --- 3) 1,2*10 5 2,12 mg/ml 4) 1,02*10 4 2,3 mg/ml 5) 0,95*10 3 4,3 mg/ml 6) styren 0,2 μl/ml Stężenie w roztworze: 25 mg/ml. 3. WYNIKI I DYSKUSJA (Results and discussion) Przedmiotem pracy jest przedstawianie wyników badań wyjaśniających wpływ eluentu oraz fazy stacjonarnej na wartość parametrów elucji, w tym, retencji wybranych modelowych związków chemicznych, reprezentujących poszczególne grupy, eluowanych w warunkach cienkowarstwowej chromatografii cieczowej (TLC). Jest to pierwsza praca z serii prac poświęconych badaniom rozdzielania grupowego nisko, średnio i względnie wysoko polarnych organicznych związków chemicznych, realizowanym przez autorów już od kilku lat. Rozdzielano mono-, di-, triacyloglicerole oraz wolne kwasy tłuszczowe, wykorzystując płytki TLC dedykowane chromatografii w normalnym (żel krzemionkowy Si60 F 254 ) oraz odwróconym (faza oktadecylosilanowa RP18 F254 ) układzie faz. Przeprowadzono szereg elucji z wykorzystaniem ośmiu eluentów o zróżnicowanej sile elucyjnej, a także innych niż acyloglicerole grup organicznych związków chemicznych. W badaniach celowo wykorzystano sorbenty inne niż kopolimer styrenu i diwinylobenzenu oraz starano się dobrać odpowiedni eluent, aby możliwe było rozdzielanie tłuszczów za pomocą chromatografii wykluczania z kontrolowaną sorpcją.
77 Poniżej zestawiono rezultaty badań uzyskane z wykorzystaniem opisanych warunków chromatograficznych. Eluent: izopropanol Mobile phase: isopropanol A Eluent: aceton Mobile phase: acetone B Rys. 1. Fotografie chromatogramów uzyskanych za pomocą TLC po wywołaniu plamek w parach jodu. Faza stacjonarna: po lewej Si60 F254, po prawej RP18 F254. Rozwijanie jednostopniowe faza ruchoma: A) izopropanol, B) aceton. Oznaczenia: linia ciągła plamki widoczne przy 254 nm, linia przerywana plami widoczne przy 365 nm, plamki koloru brązowawego plamki widoczne po wywoływaniu w parach jodu. Rozdzielane próbki: 1 MAG, 2 DAG, 3 TAG, 4 kwas erukowy, 5 olej rzepakowy. Rozpuszczalnik próbek: aceton. Fig. 1. Photographs of chromatograms obtained by TLC after spots development in iodine vapor. Stationary phase: on the left Si 60 F254, on the right RP 18 F254. Single-step elution mobile phase: A) isopropanol, B) acetone. Symbols: solid line spots visible at 254 nm, dashed line spots visible at 365 nm, brownish spots spots visible after development in iodine vapor. Examined samples: 1 MAG, 2 DAG, 3 TAG, 4 erucic acid, 5 rapeseed oil. Sample solvent: acetone. Eluent: MTBE:izopropanol (3:1 v/v) Mobile phase: MTBE:isopropanol (3:1 v/v) C Eluent: eter tert-butylowo-etylowy Mobile phase: methyl tert-butyl ether D Rys. 2. Fotografie chromatogramów uzyskanych za pomocą TLC po wywołaniu plamek w parach jodu. Faza stacjonarna: po lewej Si60 F254, po prawej RP18 F254. Rozwijanie jednostopniowe faza ruchoma: C) MTBE : izopropanol (3:1 v/v), D) MTBE. Oznaczenia: linia ciągła plamki widoczne przy 254 nm, linia przerywana plami widoczne przy 365 nm, plamki koloru brązowawego plamki widoczne po wywoływaniu w parach jodu. Rozdzielane próbki: 1 MAG, 2 DAG, 3 TAG, 4 kwas erukowy, 5 olej rzepakowy. Rozpuszczalnik próbek: aceton. Fig. 2. Photographs of chromatograms obtained by TLC after spots development in iodine vapor. Stationary phase: on the left Si60 F254, on the right RP18 F254. Single-step elution mobile phase: C) MTBE : isopropanol (3:1 v/v), D) MTBE. Symbols: solid line spots visible at 254 nm, dashed line spots visible at 365 nm, brownish spots spots visible after development in iodine vapor. Examined samples: 1 MAG, 2 DAG, 3 TAG, 4 erucic acid, 5 rapeseed oil. Sample solvent: acetone.
78 Eluent: tetrahydrofuran Mobile phase: tetrahydrofuran E Eluent: dichlorometan Mobile phase: dichloromethane F Rys. 3. Fotografie chromatogramów uzyskanych za pomocą TLC po wywołaniu plamek w parach jodu. Faza stacjonarna: po lewej Si60 F254, po prawej RP18 F254. Rozwijanie jednostopniowe faza ruchoma: E) THF, F) DCM. Oznaczenia: linia ciągła plamki widoczne przy 254 nm, linia przerywana plami widoczne przy 365 nm, plamki koloru brązowawego plamki widoczne po wywoływaniu w parach jodu. Rozdzielane próbki: 1 MAG, 2 DAG, 3 TAG, 4 kwas erukowy, 5 olej rzepakowy. Rozpuszczalnik próbek: aceton. Fig. 3. Photographs of chromatograms obtained by TLC after spots development in iodine vapor. Stationary phase: on the left Si60 F254, on the right RP18 F254. Single-step elution mobile phase: E) THF, F) DCM. Symbols: solid line spots visible at 254 nm, dashed line spots visible at 365 nm, brownish spots spots visible after development in iodine vapor. Examined samples: 1 MAG, 2 DAG, 3 TAG, 4 erucic acid, 5 rapeseed oil. Sample solvent: acetone. Eluent: n-heksan:izopropanol (3:1 v/v) Mobile phase: n-hexane:isopropanol (3:1 v/v) G Eluent: n-heksan Mobile phase: n-hexane H Rys. 4. Fotografie chromatogramów uzyskanych za pomocą TLC po wywołaniu plamek w parach jodu. Faza stacjonarna: po lewej Si 60 F254, po prawej RP18 F254. Rozwijanie jednostopniowe faza ruchoma: G) n-heksan : izopropanol (3:1 v/v), H) n-heksan. Oznaczenia: linia ciągła plamki widoczne przy 254 nm, linia przerywana plami widoczne przy 365 nm, plamki koloru brązowawego plamki widoczne po wywoływaniu w parach jodu. Rozdzielane próbki: 1 MAG, 2 DAG, 3 TAG, 4 kwas erukowy, 5 olej rzepakowy. Rozpuszczalnik próbek: aceton. Fig. 4. Photographs of chromatograms obtained by TLC after spots development in iodine vapor. Stationary phase: on the left Si60 F254, on the right RP18 F254. Single-step elution mobile phase: G) n-hexane : isopropanol (3:1 v/v), H) n-hexane. Symbols: solid line spots visible at 254 nm, dashed line spots visible at 365 nm, brownish spots spots visible after development in iodine vapor. Examined samples: 1 MAG, 2 DAG, 3 TAG, 4 erucic acid, 5 rapeseed oil. Sample solvent: acetone.
79 Tab. 4. Wartości współczynników R f dla MAG, DAG, TAG oraz próbki oleju rzepakowego uzyskane z zastosowaniem ośmiu różnych eluentów oraz sorbentu Si60. Tab. 4. The values of Rf coefficients for MAG, DAG, TAG and sample of rapeseed oil, obtained for eight different mobile phases and Si60 stationary phase. Próbka (Sample) MAG DAG TAG IzoOH ACET MTBE:izoOH 3:1v/v Faza stacjonarna Si60 (Si60 stationary phase) Eluent (Mobile phase) MTBE THF DCM nc6:izooh 3:1v/v 0,62 0,65 0,69 0,37 0,71 0 0,44 0 0,72 0,78 0,86 0,71 0,82 0,15 * 0,27 ** nc6 0,71 0 0,76 0,82 0,90 0,78 0,86 0,67 0,78 0 kwas 0,63 0,64 0,79 0,61 0,77 0,18 0,68 0 erukowy olej 0,76 0,82 0,86 0,78 0,86 0,68 0,78 0 rzepakowy * 1,2-izomer DAG, ** 1,3-izomer DAG. Stosowane skróty: IzOH = izopropanol, ACET = aceton, MTBE:izoOH = et er tertbutylowo-metylowy:izopropanol, MTBE = eter tert-butylowo-metylowy, THF = tetrahydrofuran, DCM = dichlorometan, nc6:izooh = n-heksan:izopropanol, nc6 = n-heksan. * 1,2-isomer DAG, ** 1,3-isomer DAG. Abbreviations: IzOH = isopropanol, ACET = acetone, MTBE:izoOH = methyl tertbutyl ether:isopropanol, MTBE = methyl tert-butyl ether, THF = tetrahydrofuran, DCM = dichloromethane, nc6:izooh = n- hexane:isopropanol, nc6 = n-hexane. Tab. 5. Wartości współczynników R f dla MAG, DAG, TAG oraz próbki oleju rzepakowego uzyskane z zastosowaniem ośmiu różnych eluentów oraz sorbentu RP18. Tab. 5. The values of Rf coefficients for MAG, DAG, TAG and sample of rapeseed oil, obtained for eight different mobil e phases and RP18 stationary phase. Próbka (Sample) MAG DAG TAG IzoOH ACET MTBE:izoOH 3:1v/v Faza stacjonarna RP18 (RP18 stationary phase) Eluent (Mobile phase) MTBE THF DCM nc6:izooh 3:1v/v 0,67 0,68 0,84 0,71 0,85 0,36 0,74 0 0,62 0,60 0,86 0,83 0,88 0,75 * 0,71 ** nc6 0,86 0 0,41 0,41 0,89 0,86 0,89 0,82 0,88 0 kwas 0,63 0,64 0,84 0,80 0,85 0,70 0,83 0 erukowy olej rzepakowy 0,42 0,43 0,89 0,86 0,89 0,77 0,88 0 * 1,2-izomer DAG, ** 1,3-izomer DAG. Stosowane skróty: IzOH = izopropanol, ACET = aceton, MTBE:izoOH = et er tertbutylowo-metylowy:izopropanol, MTBE = eter tert-butylowo-metylowy, THF = tetrahydrofuran, DCM = dichlorometan, nc6:izooh = n-heksan:izopropanol, nc6 = n-heksan. * 1,2-isomer DAG, ** 1,3-isomer DAG. Abbreviations: IzOH = isopropanol, ACET = acetone, MTBE:izoOH = methyl tertbutyl ether:isopropanol, MTBE = methyl tert-butyl ether, THF = tetrahydrofuran, DCM = dichloromethane, nc6:izooh = n- hexane:isopropanol, nc6 = n-hexane.
80 Tab. 6. Wartości współczynników k dla MAG, DAG, TAG oraz próbki oleju rzepakowego uzyskane z zastosowaniem ośmiu różnych eluentów oraz sorbentu Si60. Tab. 6. The values of k coefficients for MAG, DAG, TAG and sample of rapeseed oil, obtained for eight different mobile phases and Si60 stationary phase. Próbka (Sample) MAG DAG TAG IzoOH ACET MTBE:izoOH 3:1v/v Faza stacjonarna Si60 (Si60 stationary phase) Eluent (Mobile phase) MTBE THF DCM nc6:izooh 3:1v/v 0,61 0,53 0,45 1,72 0,41 -- 1,29 -- 0,39 0,28 0,16 0,41 0,22 5,58 * 2,76 ** nc6 0,40 -- 0,32 0,22 0,11 0,27 0,16 0,49 0,29 -- kwas 0,58 0,56 0,27 0,61 0,30 4,64 0,48 -- erukowy olej 0,32 0,22 0,16 0,27 0,16 0,46 0,29 -- rzepakowy * 1,2-izomer DAG, ** 1,3-izomer DAG. Stosowane skróty: IzOH = izopropanol, ACET = aceton, MTBE:izoOH = et er tertbutylowo-metylowy:izopropanol, MTBE = eter tert-butylowo-metylowy, THF = tetrahydrofuran, DCM = dichlorometan, nc6:izooh = n-heksan:izopropanol, nc6 = n-heksan. * 1,2-isomer DAG, ** 1,3-isomer DAG. Abbreviations: IzOH = isopropanol, ACET = acetone, MTBE:izoOH = methyl tertbutyl ether:isopropanol, MTBE = methyl tert-butyl ether, THF = tetrahydrofuran, DCM = dichloromethane, nc6:izooh = n- hexane:isopropanol, nc6 = n-hexane. Tab. 7. Wartości współczynników k dla MAG, DAG, TAG oraz próbki oleju rzepakowego uzyskane z zastosowaniem ośmiu różnych eluentów oraz sorbentu RP 18. Tab. 7. The values of k coefficients for MAG, DAG, TAG and sample of rapeseed oil, obtained for eight different mobile phases and RP 18 stationary phase. Próbka (Sample) MAG DAG TAG IzoOH ACET MTBE:izoOH 3:1v/v Faza stacjonarna RP18 (RP18 stationary phase) Eluent (Mobile phase) MTBE THF DCM nc6:izooh 3:1v/v 0,49 0,48 0,20 0,40 0,18 1,75 0,34 -- 0,61 0,67 0,16 0,21 0,14 0,34 * 0,41 ** nc6 0,16 -- 1,47 1,42 0,13 0,16 0,13 0,22 0,13 -- kwas 0,58 0,57 0,20 0,25 0,18 0,43 0,20 -- erukowy olej 1,39 1,35 0,13 0,16 0,13 0,31 0,13 -- rzepakowy * 1,2-izomer DAG, ** 1,3-izomer DAG. Stosowane skróty: IzOH = izopropanol, ACET = aceton, MTBE:izoOH = et er tertbutylowo-metylowy:izopropanol, MTBE = eter tert-butylowo-metylowy, THF = tetrahydrofuran, DCM = dichlorometan, nc6:izooh = n-heksan:izopropanol, nc6 = n-heksan. * 1,2-isomer DAG, ** 1,3-isomer DAG. Abbreviations: IzOH = isopropanol, ACET = acetone, MTBE:izoOH = methyl tertbutyl ether:isopropanol, MTBE = methyl tert-butyl ether, THF = tetrahydrofuran, DCM = dichloromethane, nc6:izooh = n- hexane:isopropanol, nc6 = n-hexane. Na podstawie chromatogramów, które zostały zamieszczone w pracy (rys.1 4), jak również wartości współczynników R f i k (tab. 4 7), a także chromatogramów otrzymanych dla grup związków chemicznych: polarnych, hydrofobowych oraz polistyrenów (których szczegółowe wyniki zostaną przedstawione w kolejnej części tej serii prac), można wyciągnąć następujące wnioski: dla układu rozdzielczego z sorbentem oznaczonym jako Si 60 i ośmioma różnymi eluentami - dla grup związków chemicznych polarnych, hydrofobowych oraz polistyrenów: W przypadku zastosowania izopropanolu, jak również acetonu, jako fazy ruchomej uzyskano układ, gdzie występują oddziaływania o charakterze NP (polarna adsorpcja), wraz z którymi może występować
81 wykluczanie steryczne. Świadczy o tym zbliżona elucja polarnych i hydrofobowych związków chemicznych z delikatną przewagą większej retencji polarnych związków chemicznych. Ponadto niepolarne polistyreny uległy silnej adsorpcji, co nie powinno występować, gdyby miały miejsce tylko oddziaływania typu NP. Silna adsorpcja polistyrenów świadczy albo o występowaniu wykluczania sterycznego, albo o słabej rozpuszczalności tych związków chemicznych w eluencie. Silniejsza adsorpcja polarnych związków chemicznych, aniżeli hydrofobowych została zaobserwowana, gdy eluentem była mieszanina MTBE:izopropanolu (3:1 v/v), jednak żadna z tych mieszanin nie uległa rozdzieleniu. Polistyreny nie uległy elucji w ogóle, co potwierdziło słabą rozpuszczalność tych związków w izopropanolu, który jest składnikiem eluentu. Z koleji niewielka elucja polistyrenów (R f 0,025) została zaobserwowana dla MTBE jako fazy ruchomej. W tym przypadku miała również miejsce zwiększona adsorpcja polarnych związków chemicznych. Natomiast hydrofobowe związki chemiczne wykazały zwiększoną retencję i uzyskane zostało ich rozdzielenie. Podobne obserwacje odnotowano także, gdy użytym eluentem był THF. DCM powoduje z kolei zwiększoną retencję polarnych związków chemicznych (zostają na linii startu ), która może wynikać ze słabej rozpuszczalności niektórych związków chemicznych w DCM (np. woda). W przypadku hydrofobowych związków chemicznych, można zauważyć, że związki chemiczne silniej sorbowane zostają rozdzielone, natomiast te, wykazujące niższą retencję nie uległy rozdzieleniu. Polistyreny ulegają elucji, jednak nie rozdzielają się. Zaobserwowano, iż n-heksan posiada zbyt niską siłę elucji i/lub jest zbyt słabym rozpuszczalnikiem dla badanych związków chemicznych, aby przy zastosowaniu sorbentów Si 60 (jak również RP 18 ) rozdzieleniu uległy jakiekolwiek związki chemiczne, poza silnie hydrofobowymi. Jednakże dodatek izopropanolu do eluentu (n-heksan:izopropanol (3:1 v/v)), spowodował, że nastąpiło częściowe rozdzielenie hydrofobowych związków chemicznych, jednak polarne związki chemiczne pozostały nierozdzielone i posiadały retencję zbliżoną do najsilniej sorbowanych hydrofobowych związków chemicznych. - dla tłuszczów, tj. MAG, DAG, TAG oraz próbki oleju rzepakowego: Podczas stosowania izopropanolu jako eluentu tłuszcze są eluowane zgodnie z malejącą masą cząsteczkową, za wyjątkiem kwasu erukowego (WKT), który to jest eluowany przed monooleinianem glicerolu (MAG). Elucja w tej samej kolejności, tj.: TAG, DAG, WKT, MAG miała także miejsce, gdy zastosowane zostały następujące fazy ruchome: MTBE, THF oraz n-heksan:izopropanol (3:1 v/v). Natomiast elucja całkowicie zgodna z malejącą masą cząsteczkową (tj. bez zamiany kolejności elucji MAG oraz WKT) miała miejsce w przypadku zastosowania acetonu jako fazy ruchomej. Dodatkowo, warunki tego rozdzielania okazały się bardziej korzystne niż w przypadku użycia izopropanolu, ponieważ uzyskano ni ższe wartości współczynników retencji (tab. 6), co sugeruje krótszy czas trwania analizy; dyskusyjna pozostała natomiast kwestia efektywnego rozdzielania DAG i TAG (mają zbliżone współczynniki retencji). Z kolei najniższymi wartościami współczynników retencji charakteryzowały się próbki rozdzielane w mieszaninie MTBE:izoOH (3:1v/v). W przypadku tego układu rozdzielczego prawdopodobnie występuje wykluczanie steryczne z sorpcją typu NP. Należałoby sprawdzić za pomocą kolumnowej chromatografii wykluczania czy możliwe jest rozdzielenie TAG i DAG, ponieważ z rezultatów uzyskanych za pomocą TLC wynika, iż retencja obu związków jest zbliżona. Gdy jako fazę ruchomą zastosowano MTBE zaobserwowano, iż tłuszcze zostały lepiej rozdzielone niż w przypadku zastosowania mieszaniny MTBE:izopropanol (3:1 v/v), jednak MAG uległ znacznie silniejszej adsorpcji, co może znacznie wydłużać czas analizy, gdyby opisywane warunki zostały przeniesione do kolumnowej chromatografii wykluczania. W przypadku zastosowania tego układu chromatograficznego w kolumnowej GPC, może być konieczne zastosowanie zaworu przepływu zwrotnego. Po zastosowaniu DCM jako eluentu, tłuszcze są eluowane w kolejności: trioleinian glicerolu; 1,3-dioleinian glicerolu; kwas erukowy; 1,2-dioleinian glicerolu. W przypadku zastosowania układu rozdzielczego z sorbentem oznaczonym jako Si 60 i DCM jako eluentem możliwe jest zatem rozdzielenie próbki DAG na dwa izomery, charakteryzujące się różną polarnością, przy czym izomer 1,3 - jest mniej polarny aniżeli izomer 1,2.Tłuszcze są lepiej rozdzielone niż w przypadku zastosowania tetrahydrofuranu jako eluentu, jednak WKT oraz obydwa izomery DAG uległy znacznie silniejszej adsorpcji, co może znacznie wydłużać czas analizy, gdyby opisywane warunki zostały przeniesione do kolumnowej chromatografii wykluczania. Monooleinian glicerolu zostaje na linii startu. W przypadku zastosowania tego układu chromatograficznego w kolumnowej GPC, również konieczne byłoby zastosowanie zaworu przepływu zwrotnego. Oddziaływania, jakie mają miejsce mają charakter układu NP (polarna adsorpcja). Współczynniki opóźnienia dla acylogliceroli i wolnych kwasów tłuszczowych, uzyskane po zastosowaniu mieszaniny n-heksan:izopropanol (3:1 v/v), wskazują na to, iż w kolumnowej GPC mogą się one dobrze rozdzielać. Oddziaływania, jakie mają miejsce w tym wypadku to prawdopodobnie wykluczanie steryczne z adsorpcją typu RP (hydrofobowa adsorpcja). Ponownie, n-heksan, stosowany bez dodatku izopropanolu, posiada zbyt niską siłę elucji i/lub jest zbyt słabym rozpuszczalnikiem dla badanych związków chemicznych, aby przy zastosowaniu sorbentów Si 60 i RP 18 rozdzieleniu uległy jakiekolwiek związki chemiczne, poza silnie hydrofobowymi. Po przeanalizowaniu wyników większości jednostopniowych elucji (poza tą, gdzie fazą ruch omą był właśnie n-heksan), zauważalne jest także, że głównym składnikiem obecnym w próbce oleju rzepakowego są triacyloglicerole. dla układ rozdzielczego z sorbentem oznaczonym jako RP 18 i ośmioma różnymi eluentami: - dla grup związków chemicznych polarnych, hydrofobowych oraz polistyrenów:
82 Układ rozdzielczy z izopropanolem jako eluentem charakteryzuje się występowaniem oddziaływań o charakterze RP (hydrofobowa adsorpcja). Hydrofobowe związki chemiczne są dobrze rozdzielone, a polarne związki chemiczne są szybko eluowane. Podobnie jak miało to miejsce w przypadku użycia sorbentu Si 60, wystąpiła silna adsorpcja polistyrenów, co potwierdza ich niską rozpuszczalność w izopropanolu. Po zastosowaniu acetonu jako eluentu, można zauważyć lepsze rozdzielenie związ ków hydrofobowych, a także delikatną elucję polistyrenów, co dementuje hipotezę, iż polistyreny miałyby się nie rozpuszczać w acetonie. Zauważalne jest, że w przypadku zastosowania MTBE, jak również THF, jako fazy ruchomej polistyreny ulegają elucji, natomiast gdy do eluentu dodany został izopropanol (MTBE:izopropanolu (3:1 v/v)) elucja nie zachodziła. W układzie rozdzielczym z mieszaniną MTBE:izopropanolu (3:1 v/v) zauważalna jest silniejsza sorpcja hydrofobowych związków chemicznych, niż polarnych, natomiast układ rozdzielczy bez dodatku izopropanolu do MTBE oraz ten, w którym eluentem jest THF, charakteryzuje się zbliżoną adsorpcją polarnych związków chemicznych i hydrofobowych. Jednak w tym przypadku, gdy fazą ruchomą jest MTBE, polarne związki chemiczne uległy nieco silniejszej adsorbcji. Zastosowanie DCM jako eluentu, powoduje spadek retencji hydrofobowych związków chemicznych w porównaniu do rezultatów uzyskanych przy zastosowaniu fazy stacjonarnej oznaczonej jako Si 60 i DCM jako eluentu, jednak związki chemiczne nie zostały całkowicie rozdzielone. Polarne związki chemiczne są sorbowane w sposób podobny jak przy zastosowaniu sorbentu Si 60. Obserwuje się jednak znacznie lepsze rozdzielenie polistyrenów. W przypadku zastosowania mieszaniny n-heksan:izopropanol (3:1 v/v) oraz sorbentu oznaczonego jako RP 18, zauważalne jest lepsze rozdzielenie hydrofobowych związków chemicznych, niż przy zastosowaniu sorbentu Si 60, podczas gdy polarne związki chemiczne wykazują znacznie niższą retencję. Polistyreny rozdzielają się w podobny sposób jak przy zastosowaniu sorbentu Si 60. - dla tłuszczów, tj. MAG, DAG, TAG oraz próbki oleju rzepakowego: W układach rozdzielczych, gdzie zastosowano izopropanol, jak również aceton jako fazę ruchomą acyloglicerole są eluowane zgodnie z rosnącą masą cząsteczkową i rosnącą hydrofobowością. Jednakże, w przypadku izopropanolu można ponownie zaobserwować odwróconą kolejność elucji WKT i MAG. Oba układy (zarówno ten z izopropanolem jak i acetonem) stwarzają lepsze warunki do rozdzielania tł uszczów niż Si 60, co można stwierdzić na podstawie otrzymanych wartości parametrów elucji. W przypadku gdy eluentem był MTBE lub THF acyloglicerole były eluowane w kolejności zgodnej z malejącą masą cząsteczkową i malejącą hydrofobowością. W przypadku stosowania MTBE ponownie można zaobserwować odwróconą kolejność elucji WKT i MAG, a oddziaływania, jakie występują mają charakter NP (polarna adsorpcja), ewentualnie z wykluczaniem sterycznym. Kwestia efektywnego rozdzielania MAG i WKT (mają takie same współczynniki retencji) pozostaje dyskusyjna w układzie rozdzielczym, w którym zastosowany został THF, a mechanizmem decydującym o rozdzielaniu jest wykluczanie steryczne. Układ ten wprawdzie charakteryzuje się niską retencją tłuszczów, jednak zbliżone współczynniki opóźnienia R f (tab. 7) świadczą o tym, że związki mogą ulegać elucji w bardzo zbliżonym czasie retencji i nie rozdzielać się należy to sprawdzić za pomocą kolumnowej chromatografii wykluczania. Gdy eluent zawierał dodatek izopropanolu (MTBE:izopropan ol (3:1 v/v)) wśród tłuszczów, zauważono dominację wykluczania sterycznego z oddziaływaniami typu RP związki są eluowane w kolejności: TAG, DAG, MAG, WKT, czyli w kolejności podyktowanej malejącą masą cząsteczkową, natomiast dyskusyjna pozostaje kwestia efektywnego rozdzielania MAG i WKT (mają takie same współczynniki retencji). Należałoby sprawdzić czy acyloglicerole i wolne kwasy tłuszczowe ulegają rozdzieleniu przy zastosowaniu kolumnowej GPC w tych samych warunkach rozdzielczych. W przypadku zastosowania DCM jako fazy ruchomej tłuszcze były eluowane w kolejności: trioleinian glicerolu; 1,2-dioleinian glicerolu; 1,3-dioleinian glicerolu; kwas erukowy; monooleinian glicerolu, a oddziaływania, jakie miały miejsce to najprawdopodobniej wykluczanie steryczne, być może z oddziaływaniami o charakterze NP (polarna adsorpcja). Zastosowanie kolumnowej GPC do dokładniejszego zbadania charakteru oddziaływań, jakie mają miejsce, powinno zapewnić dobre rozdzielenie TAG; 1,2-DAG; MAG i WKT, jednak silna sorpcja MAG prawdopodobnie wymagać będzie zastosowania zaworu przepływu zwrotnego. Po zastodowaniu DCM jako eluentu dyskusyjna pozostaje natomiast kwestia efektywnego rozdzielania 1,3-DAG oraz WKT (zbliżone współczynniki retencji). W mieszaninie n-heksan:izopropanol (3: 1 v/v), tłuszcze są eluowane w kolejności: TAG, DAG, WKT, MAG, a mechanizmem decydującym o rozdzielaniu prawdopodobnie jest wykluczanie steryczne. Gdy n-heksan jest pozbawiony dodatku izopropanolu, MAG i DAG zostają na linii startu, nie ulegając elucji w ogóle. Jedynie TAG oraz WKT wykazuje rozmycie plamki, co widoczne jest także po próbie rozdzielenia próbki oleju rzepakowego, gdzie stężenie TAG jest wysokie. Świadczy to o niezbyt wysokiej sile elucyjnej n-heksanu oraz o tym, że przyczyną braku elucji MAGów i DAGów jest ich słaba rozpuszczalność w eluencie.
83 Tab. 8. Prawdopodobnie występujące oddziaływania pomiędzy cząsteczkami rozdzielanych związków chemicznych a powierzchnią fazy stacjonarnej, występujące w badanych warunkach chromatograficznych TLC. Tab. 8. Probable interactions occurring, in examined TLC conditions, between molecules of separated compounds and the stationary phase surface. Eluenty (Mobile phase) Si60 Stosowane fazy stacjonarne (Stationary phases used) Izopropanol (isopropanol) GPC/SEC-NP lub NP-LC RP-LC Aceton (acetone) GPC/SEC-NP GPC/SEC-RP MTBE : izopropanol (3:1 v/v) (MTBE:isopropanol) (3:1 v/v) GPC/SEC-NP GPC/SEC-RP MTBE GPC/SEC-NP NP-LC lub GPC/SEC-NP THF NP-LC GPC/SEC DCM NP-LC GPC/SEC-NP lub GPC/SEC n-heksan : izopropanol (3:1 v/v) (n-hexane:isopropanol) (3:1 v/v) GPC/SEC-NP GPC/SEC n-heksan (n-hexane) - - W tab. 8 zestawiono podsumowanie wniosków cząstkowych na temat oddziaływań, jakie najprawdopodobniej mają miejsce w poszczególnych układach chromatograficznych. W przypadku, gdy charakter mechanizmu rozdzielania określono mianem wyłącznie, "wykluczania" (GPC/SEC), mamy do czynienia praktycznie z czystym wykluczaniem sterycznym rozdzielanych związków chemicznych. Gdy układ chromatograficzny posiada cechy układu GPC/SEC-NP, o rozdzielaniu związków chemicznych decyduje występowanie, obok wykluczania sterycznego, oddziaływań dyspersyjnych, dipolowych, polarnych oraz wodorowych, zaś gdy posiada cechy GPC/SEC-RP obok wykluczania sterycznego, występowanie oddziaływań van der Waalsa, a także o charakterze π-π, π-para elektronowa i kwadrupolowych. 4. WNIOSKI KOŃCOWE Technika TLC pozwoliła na uzyskanie orientacyjnych informacji na temat rozdzielczości i retencji badanych związków chemicznych. Z przeprowadzonych badań wynika, iż określone modyfikacje warunków kolumnowej chromatografii wykluczania mogą prowadzić do zmian rozdzielczości i selektywności układów rozdzielczych. Poznanie oddziaływań, jakie mają miejsce między cząsteczkami tłuszczów i produktów ich konwersji a powierzchnią fazy stacjonarnej oraz znalezienie optymalnego składu eluentu i programu elucji może i powinno być dokonywane z zastosowaniem techniki chromatografii cienkowarstwowej (TLC), co w zasadniczym stopniu przyspiesza oraz ułatwia dobór optymalnych warunków separacji. Następnie, zasadne jest przeniesienie najważniejszych wniosków do warunków wysokosprawnej chromatografii kolumnowej (HPLC), najpierw w skali modelowej, a następnie, preparatywnej. W ten sposób można w zasadniczym stopniu przyśpieszyć opracowanie optymalnych warunków rozdzielania grupowego oraz "szczegółowego" skomplikowanych mieszanin związków chemicznych, w tym, tłuszczów i produktów ich konwersji. Realizowane badania powinny w przyszłości pozwolić na opracowanie zautomatyzowanej aparatury do wielokolumnowego (NC) i wielowymiarowego (nd), preparatywnego rozdzielania tłuszczów i produktów ich konwersji.. Docelowo taka zautomatyzowana aparatura może posłużyć do otrzymywania użytkowych ilości "wzorców" tłuszczów i produktów ich konwersji. Podczas przenoszenia warunków rozdzielania zastosowanych podczas badań TLC do chromatografii kolumnowej (HPLC), należy pamiętać, iż w przypadku chromatografii cieczowej, w tym, w chromatografii wykluczania (GPC/SEC), najbardziej korzystne są warunki, gdy rozpuszczalnikiem składników rozdzielanej mieszaniny jest eluent, a w przypadku elucji gradientowej ciecz o składzie identycznym jak początkowy eluent w programie elucji. W warunkach klasycznej chromato grafii wykluczania eluent, będący rozpuszczalnikiem mieszaniny dozowanej do kolumny powinien, dodatkowo, zapewnić minimalizację, a najkorzystniej brak oddziaływań sorpcyjnych wszystkich składników rozdzielanej mieszaniny z powierzchnią porów wypełnienia kolumny. Wówczas elucja z kolumny ma miejsce w kolejności od największych do najmniejszych cząsteczek. Największe mają do dyspozycji jako "drogę dyfuzji" tylko niewielką przestrzeń największych porów w wypełnieniu kolumny. Najmniejsze największą przestrzeń wszystkich porów największych, średnich i najmniejszych. Powyższe dotyczy klasycznej chromatografii wykluczania, a więc przy braku oddziaływań sorpcyjnych składników rozdzielanej mieszaniny z powierzchnią mikro -porów wypełnienia kolumny. Natomiast w przypadku, gdy skład eluentu oraz faza stacjonarna kolumny zostały w ten sposób dobrane, że oprócz efektu wykluczania, będą miały miejsce słabe oddziaływania adsorpcyjne, do tego korzystnie, tym silniejsze, im niższa masa molekularna rozdzielanych substancji - powinno to powodować wzrost rozdzielczości tak zaprojektowanego układu rozdzielczego, podobnie, jak to obserwowano podczas badań techniką TLC, opisanych w niniejszej pracy. RP18