IMMUNOFENOTYP DOJRZA YCH KOMÓREK HEMATOPOETYCZNYCH PIERWOTNE I WTÓRNE NIEDOBORY

POSTÊPY IMMUNOFENOTYP BIOLOGII KOMÓRKI DOJRZA YCH KOMÓREK TOM 35 HEMATOPOETYCZNYCH... 2008 SUPLEMENT NR 24 (45 64) IMMUNOFENOTYP DOJRZA YCH KOMÓREK HEMATOPOETYCZNYCH PIERWOTNE I WTÓRNE NIEDOBORY IMMUNOPHENOTYPE OF MATURE HEMATOPOIETIC CELLS PRIMY AND SECONDY IMMUNODEFICIENCES Anna PITUCH-NOWOROLSKA Zak³ad Immunologii Klinicznej, Polsko-Amerykañski Instytut Pediatrii, Collegium Medicum, Uniwersytet Jagielloñski Streszczenie: W pracy przedstawiono charakterystykê leukocytów krwi obwodowej i wêz³ów ch³onnych z ocen¹ immunofenotypów, podaniem zmiennoœci zwi¹zanej z wiekiem. W rozdziale o niedoborach odpornoœci przedstawione zosta³y pierwotne niedobory wraz z opisem zmian w obrêbie proporcji populacji leukocytów ocenianych metod¹ cytometrii przep³ywowej. Omówiono szerzej te niedobory, w których badania immunofenotypu komórek krwi obwodowej i wêz³ów ch³onnych stanowi podstawê rozpoznania. Summary: The leukocytes characteristics from peripheral blood and lymph nodes including age-related changes were shown. Primary immunodeficiencies were described based on quantitative changes within lymphocytes T and B populations assayed with flow cytometry. Immunodeficiences with diagnosis based on analysis of peripheral blood and lymph node cells' immunophenotypes were discussed. 1. OCENA OBECNOŒCI I IMMUNOFENOTYPU POPULACJI KOMÓRKOWYCH Krew obwodowa W warunkach fizjologicznych we krwi obwodowej obecne s¹ nastêpuj¹ce populacje komórkowe wyodrêbnione na podstawie w³aœciwoœci fizyko-chemicznych: ma³e ziarniste komórki odpowiadaj¹ce granulocytom, w tym równie niewielka populacja najbardziej ziarnistych komórek czyli granulocytów kwasoch³onnych, ma³e komórki nieziarniste odpowiadaj¹ce limfocytom, œredniej wielkoœci komórki o niewielkiej iloœci ziarnistoœci odpowiadaj¹ce monocytom, komórkom NK.

46 A. PITUCH-NOWOROLSKA RYCINA 1. Populacje komórek krwi obwodowej po lizie erytrocytów. Rozk³ad punktowy (dot plot) oparty na parametrach SSC i FSC ukazuje populacje komórek ró ni¹ce siê cechami fizycznymi wielkoœci¹ i rozbudow¹ powierzchni odzwierciedlaj¹c¹ iloœæ ziarnistoœci. WyraŸnie widoczne s¹ komórki ma³e, sk¹poziarniste odpowiadaj¹ce limfocytom (bramka R3), nieco wiêksze i bardziej ziarniste monocyty (R2) oraz najwiêksza iloœciowo populacja granulocytów wieloj¹drzastych (R1). Proporcje granulocytów do limfocytów zmieniaj¹ siê z wiekiem i u dzieci do 3 roku ycia przewa aj¹ limfocyty, a u starszych dzieci i osób doros³ych granulocyty Ponadto we krwi obwodowej stwierdza siê komórki wystêpuj¹ce w odsetku ni szym ni 1% (populacje œladowe). Nale ¹ do nich granulocyty zasadoch³onne, plazmocyty, komórki dendrytyczne, macierzyste komórki hematopoetyczne, czasami pojedyncze komórki œródb³onkowe i inne korzystaj¹ce z krwi jako drogi transportowej do miejsca docelowego. Do takich komórek nale ¹ np. komórki nowotworowe, prekursorowe w stanach zapalnych. W cytometrze przep³ywowym zale nie od ustawienia na wykresie punktowym o osiach FSC i SSC rozk³ad tych populacji komórek obecnych we krwi obwodowej jest ró ny (ryc. 1). W przypadku poszukiwania i analiz np. populacji œladowych o parametrach odpowiadaj¹cych populacji limfoidalnej bardziej korzystne wydaje siê zastosowanie skali logarytmicznej FSC ani eli liniowej. Przygotowanie zawiesiny komórkowej jest równie zale ne od celu analizy. Istniej¹ dwie podstawowe metody badania komórek krwi obwodowej. Jedna polega na barwieniu komórek w pe³nej krwi, a nastêpnie lizie erytrocytów. W pozostaj¹cej po lizie zawiesinie komórek do badania pozostaj¹ wszystkie populacje krwinek bia³ych ³¹cznie z granulocytami. Drugi sposób polega na nieci¹g³ym gradiencie gêstoœci, po którym w interfazie pozostaje zawiesina komórek jednoj¹drzastych pozbawiona erytrocytów i granulocytów. Metody te s¹ stosowane zale nie od potrzeb, ale w praktyce laboratoryjnej w celach porównawczych powinna byæ stale u ywana jedna z tych metod, gdy wyniki badañ tej samej zawiesiny komórkowej zale nie od metody mog¹ siê nieco ró niæ zw³aszcza w ocenie odsetka danej populacji komórkowej.

IMMUNOFENOTYP DOJRZA YCH KOMÓREK HEMATOPOETYCZNYCH... 47 RYCINA 2. Sposób pokazania obecnych populacji komórkowych. Komórki jednoj¹drzaste krwi obwodowej uzyskano poprzez nieci¹g³y gradient gêstoœci. Pobrana na EDTA krew obwodowa po rozcieñczeniu 1:1 sol¹ fizjologiczn¹ zostaje nawarstwiona na limfoprep (Ficoll/Isopaque) i wirowana (400 g przez 20 min). Po gradiencie w interfazie pozostaj¹ komórki jednoj¹drzaste, a erytrocyty i granulocyty opadaj¹ poni ej warstwy limfoprepu na dno próbówki. Komórki zebrane z interfazy, stanowi¹ mieszaninê limfocytów, monocytów, komórek NK.Ustawienie parametru SSC w skali logarytmicznej pozwala na lepsze uwidocznienie populacji limfocytarnej. Taki uk³ad parametrów mo na poleciæ do badania tych w³aœnie komórek np. w diagnostyce bia- ³aczek i ch³oniaków. Ustawienie skali linearnej parametru SSC pozwala na uwidocznienie lepsze populacji monocytarnej i granulocytarnej (na rycinie tej populacji komórek nie ma). To ustawienie jest powszechnie u ywane, a jego mankamentem mo e byæ po³o enie populacji limfocytarnej jako ciasnej chmury komórek bliskiej linii. Aby te komórki uwidoczniæ, nale y zmieniæ poziom czu³oœci SSC tak, aby kosztem chmury granulocytarnej wyraÿnie pokazaæ ca³¹ populacjê limfocytarn¹ KREW OBWODOWA GRADIENT GÊSTOŒCI SSC - skala logarytmiczna R1 - monocyty R2 - limfocyty KREW OBWODOWA GRADIENT GÊSTOŒCI SSC - skala linearna R3 - monocyty R4 - limfocyty Populacja limfocytów zawiera zarówno limfocyty T, jak i B. Stanowi ona wyraÿnie odgraniczon¹ populacjê komórek ma³ych pozbawionych ziarnistoœci ³atw¹ do bramkowania na podstawie parametrów FSC i SSC. W wielokolorowej cytometrii podstaw¹ selekcji populacji limfocytów T jest obecnoœæ na powierzchni komórek, a limfocytów B CD19 i/lub CD22. Zestaw przeciwcia³ wykorzystywany do oceny populacji limfocytów zawiera przeciwcia³a pozwalaj¹ce na szybk¹ i wstêpn¹ analizê (CD45,, CD4, CD8, CD2, CD5, CD7, CD19, CD16+CD56, CD14) populacji limfocytów T i limfocytów B, monocytów oraz komórek NK (ryc. 2). Analiza pozwalaj¹ca na charakterystykê immunofenotypow¹ i czêœciowo funkcjonaln¹ subpopulacji limfocytów T oparta jest na wykorzystaniu znacznej iloœci pozwalaj¹cych na ocenê ekspresji determinant zwi¹zanych z ró nicowaniem i funkcj¹ tych komórek, przyk³ad takiej listy do trójkolorowej analizy zawiera tabela 1.

48 A. PITUCH-NOWOROLSKA TABELA 1. Zestawienia przeciwcia³ limfocytów krwi obwodowej Przeciwcia³o FITC CD15 CD5 CD4 CD4 CD8 CD4 CD8 CD25 TRC a/ b CD7 CD8 8 CD10 sigm kappa Przeciwcia³o RPE CD14 CD19 CD8 CD45RA CD45RA CD45RO CD45RO HLA-DR TRC g/ d CD16/CD56 CD16/CD56 HLA-DR CD20 CD22 lambda monoklonalnych u ywane Przeciwcia³o sprzê one z 3. fluorochromem CD45 CD19 CD19 CD19 CD19 Identyfikowana do okreœlenia immunofenoty pu subpopulacja Kontrola "bramki" limfocytarnej Limfocyty T: + Limfocyty B: D5+/CD19,CD5-/CD19 Limfocyty T: /CD4 i /CD8 Limfocyty T: /CD45RA Limfocyty T: /CD45RO Marker aktywacji limfocytów T Limfocyty T: a/ b i g/ d Komórki NK Komórki NK Limfocyty B Limfocyty B: prekursory CD10+ Uwagi Czêsto w zestawieniu bez CD15 U dzieci œladowa populacja CD5+ 8 marker komórek prekursorowych Odsetki i iloœci limfocytów T i B, komórek NK, granulocytów i monocytów w warunkach prawid³owych zale nie od wieku i p³ci W tabeli 2 i 3 pokazano proporcje odsetkowe i iloœci komórek nale ¹cych do poszczególnych populacji w zale noœci od wieku. Obecnie czêsto okreœla siê obecnoœæ populacji limfocytów T podwójnie ujemnych (+/CD4/CD8-) we krwi obwodowej. Wzrost odsetkowy tej populacji obserwuje siê w okresach infekcji bakteryjnej, wirusowej. Opisano równie niedobór odpornoœci komórkowej polegaj¹cy na wysokim odsetku tych limfocytów T kr¹ ¹cych we krwi (tab. 2). Komórki NK stanowi¹ oko³o 10% populacji jednoj¹drzastych komórek krwi obwodowej. Ich liczba wzrasta w trakcie infekcji g³ównie wirusowych, aczkolwiek niektóre wirusy (np. wirus Epstein-Barr) prowadz¹ do d³ugotrwa³ego obni enia liczby komórek NK, co jest wi¹zane z objawami zespo³u przewlek³ego zmêczenia (chronic fatigue syndrome). Obecnie w wielu badaniach podkreœla siê zaburzenia ekspresji determinant (np. CD16) na powierzchni komórek NK, ale kliniczne znaczenie tych zaburzeñ nie jest jednoznacznie ustalone. Monocyty nale ¹ do komórek prezentuj¹cych antygeny i st¹d ich g³ówna rola w uk³adzie odpornoœci. Krytycznym dla prezentacji przetworzonych antygenów jest ekspresja determinant HLA-DR. W stanach przewlek³ych infekcji, rekonwalescencji po ciê kich infekcjach wirusowych we krwi mog¹ wystêpowaæ ró ne subpopulacje monocytów w³¹cznie z prekursorami i komórkami aktywowanymi. Odpowiednio bêd¹ siê one ró ni³y immunofenotypami (np. w ekspresji CD14, CD64, CD16).

IMMUNOFENOTYP DOJRZA YCH KOMÓREK HEMATOPOETYCZNYCH... 49 TABELA 2. Zestawienia odsetkowe subpopulacji limfocytarnych T we krwi obwodowej u noworodka, dziecka 1-rocznego i osoby doros³ ej P opulacja limfocytów N oworodek (%) 6 miesiêcy (%) 12 miesiêcy (%) Doros³y (%) Limfocyty T: Subpopulacje + TCR a/ b TCR g/ d CD4 CD8 CD45 RA CD45 RO CD4/CD45RA CD8/CD45RA CD4/CD45RO CD8/CD45RO /HLA-DR CD25 79 (58 89) 97 (94 99) 2 (0 3) 76 (69 87) 25 (13 31) 79 (52 90) 26 (16 65) 76 (41 88) 84 (67 97) 26 (17 73) 16 ( 5 43) 3 (1 27) 13 (10 21) 72 (50 78) 95 (90 97) 4 (1 6) 56 (34 64) 15 (8 32) 80 (64 90) 15 (13 71) 82 (72 91) 89 (84 94) 15 (13 90) 13 (5 65) 3 (2 6) 9 (6 11) Wêz³y ch³onne 65 (50 73) Wêz³y ch³onne stanowi¹ struktury tkanki limfatycznej i s¹ zasiedlone tylko przez limfocyty w rejonach korowych i czêœciowo rdzennych przez limfocyty T, natomiast tzw. oœrodki rozrodcze przez limfocyty B aktywowane zale nie od potrzeb, czyli produkcji swoistych przeciwcia³ i immunoglobulin. W centrach rozrodczych stwierdza siê równie obecnoœæ plazmocytów i komórek histiocytarnych. Proporcje pomiêdzy limfocytami T i B s¹ zale ne od stanu funkcjonalnego danego wêz³a ch³onnego (w okresach aktywacji wzrasta wyraÿnie odsetek limfocytów B, a w zaka eniu np. pr¹tkiem guÿlicy s¹ to prawie wy³¹cznie limfocyty T) oraz jego lokalizacji anatomicznej. Najczêœciej badane s¹ wêz³y ch³onne szyjne, pachowe, nadobojczykowe i w warunkach fizjologicznych limfocyty T stanowi¹ 50 70% wszystkich komórek, a resztê stanowi¹ limfocyty B. Proporcje te nieznacznie zmieniaj¹ siê z wiekiem u dzieci w okresie bujania tkanki ³¹cznej (3 7 lat) wy szy jest odsetek limfocytów B (50 60%). W okresach pobudzenia (przewlek³e zaka enia bakteryjne regionu, z którego limfa sp³ywa do badanego wêz³a ch³onnego) przewa aj¹ limfocyty B, czêsto wykazuj¹ce ekspresjê determinant prekursorowych, co jest dodatkowo oznak¹ pobudzenia centrów rozrodczych. Natomiast budowa i proporcje komórkowe wêz³ów ch³onnych pachwinowych (wêze³ Rosen-Millera) i krezkowych s¹ inne (np. wykazuj¹ wy szy odsetek komórek CD45,, CD19 ujemnych), co powoduje, e diagnostyka zmian chorobowych jest znacznie trudniejsza (ryc. 3). B³ony œluzowe MALT 92 (88-98) 4 (2 8) 50 (30 62) 16 (8 34) 80 (72 88) 16 (9 54) 80 (65 97) 89 (81 100) 16 (11 65) 15 (7 41) 3 (2 7) 8 (6 10) Opracowano na podstawie: Immunophenotyping of lymphocytes in healthy and immunodeficient children. Esther de Vries, Immunologie, Rotterdam 1999 72 (60 83) 93 (83 97) 5 (2 15) 58 (52 69) 33 (27 46) 60 (46 71) 56 (48 71) 49 (35 70) 73 (55 80) 63 (47 81) 46 (38 59) 28 (3 45) 27 (19 36) W obrêbie b³on œluzowych MALT (mucous associated lymphoid tissue) znajduj¹ siê komórki uk³adu odpornoœci w dwóch zasadniczych strukturach

50 A. PITUCH-NOWOROLSKA RYCINA 3. Krew obwodowa leukocyty uzyskane metod¹ lizy erytrocytów. Widoczne s¹ komórki odpowiadaj¹ce limfocytom, monocytom i granulocytom. Jest jeszcze populacja (R4) która stanowi mieszaninê limfocytów, komórek NK, pojedynczych monocytów. U zdrowego dziecka (5 lat) w populacji limfocytarnej (R1) limfocyty T stanowi¹ oko³o 70%, proporcja miêdzy subpopulacj¹ CD4 a CD8 jest zachowana (2,5), limfocyty B stanowi¹ 11,5%. Limfocyty T cytotoksyczne (CD8) wykazuj¹ siln¹ ekspresjê determinanty CD8 (ok. 10 3 ). Komórki o poœredniej i niskiej ekspresji nale ¹ do populacji komórek NK. Równoczesne barwienie tych komórek przeciwcia³em dla i HLA-DR pozwala na ocenê odsetka komórek wykazuj¹cych tylko ekspresjê HLA-DR (limfocyty B) oraz równoczesn¹ ekspresjê i HLA-DR (aktywowane limfocyty T) odpowiednikach wêz³ów ch³onnych, czyli kêpkach Peyera w przewodzie pokarmowym oraz w formie luÿnej tkanki limfatycznej. Populacja limfocytów T sk³ada siê z limfocytów T wspomagaj¹cych (Th) w 70% oraz supresyjnych (Ts) w 30 35%. Ze wzglêdu na szczególn¹ rolê spe³nian¹ przez limfocyty T znajduj¹ce siê w obrêbie MALT, a zwi¹zan¹ z odpowiedzi¹ swoist¹ na liczne antygeny odsetek limfocytów T pamiêci siêga 50%, a aktywowanych 35%. Populacja limfocytów B wykazuje na powierzchni g³ównie obecnoœæ ³añcuchów ciê kich IgM (sigm) oraz IgD (sigd), co odpowiada limfocytom naiwnym (55%). Populacja limfocytów B sigm+ bez ekspresji IgD, co odpowiada limfocytom B pamiêci, stanowi pozosta³e 45%. Proces zmiany izotypu immunoglobulin (switch) prowadzi do powstania populacji dojrza³ych limfocytów B

IMMUNOFENOTYP DOJRZA YCH KOMÓREK HEMATOPOETYCZNYCH... 51 RYCINA 4. Komórki wêz³a ch³onnego. Zawiesinê komórek uzyskuje siê poprzez mechaniczne rozdrobnienie fragmentu wêz³a ch³onnego. W pokazanym rozk³adzie punktowym widoczne s¹ w obrêbie bramki (R1) dwie populacje komórek mniejsze i wiêksze stanowi¹ce iloœciow¹ wiêkszoœæ. Obydwie populacje s¹ limfocytami. W badanym wêÿle limfocyty T stanowi³y oko³o 48%, w tym 38% limfocyty T CD4, a 10% limfocyty CD8. Dojrza³e limfocyty B stanowi¹ oko³o 42%, wszystkie wykazuj¹ ekspresjê CD19, CD20, CD22 (niepokazane) oraz immunoglobulin o proporcji ³añcuchów lekkich k/l 2:1. Poza bramk¹ pozosta³y niewielkie iloœci komórek o charakterystyce granulocytów, trochê resztek po uszkodzonych komórkach (detritus komórkowy). Te granulocyty, niekiedy trochê monocytów to komórki nap³ywaj¹ce z krwi¹ do wêz³a ch³onnego. Aby uzyskaæ zawiesinê limfocytów, nale y wstêpnie uzyskane komórki z wêz³a ch³onnego poddaæ gradientowi gêstoœci. W wêÿle ch³onnym w trakcie przewlek³ego procesu zapalnego dochodzi do zmiany proporcji limfocytów T do B na rzecz tych ostatnich. Odsetek limfocytów B mo e osi¹gaæ nawet 70%, ale obecne s¹ limfocyty B z ³añcuchami lekkimi obydwu rodzajów (barwienie CD19/kappa, CD19/lambda). Obecnoœæ ³añcucha lekkiego tylko jednego rodzaju mo e sugerowaæ rozrost monoklonalny wykazuj¹cych obecnoœæ siga (50 60%). S¹ to limfocyty B i plazmocyty produkuj¹ce lokalnie dwucz¹steczkowe IgA (tzw. sekrecyjne IgA). Produkcja w œcianie jelita obejmuje równie produkcjê elementu ³¹cz¹cego pojedyncze moleku³y IgA. Sekrecyjne IgA jest odpowiedzialne za reakcje z antygenami obecnymi w b³onie œluzowej.

52 A. PITUCH-NOWOROLSKA TABELA 3. Zestawienie odsetkowe populacji limfocytarnych obwodowej osób w ró nym wieku Populacja limfocytów Limfocyty T: CD4 CD8 Stosunek CD4:CD8 Limfocyty B: CD19 i/lub CD20 Komórki NK: CD16 CD56 Dziecko 6 m-cy % (Iloœæ/ m l) 71 (4030) 45-79(3610-8840) 49 (2950) 36-61(1690-4600) 24 (1450) 16-34 (650-2450) 2,2 (1,3 3,5) 23 (900) 19-31(500-1500) 12,7 (790 +/-352) 10,6 (627+/-308) 12 miesiêcy % (Iloœæ/ m l) 66(3300) 53-81(1460-6450) 43(2070) 31-54(1020-3600) 25(1320) 16-38(570-230) 1,6(1,0-3,0) 23 (900) 19-31(500-1500) i iloœci bezwzglêdne tych komórek we krwi 2 5 lat % (Iloœæ/ m l) 72 (3040) 62-80 (1610-4230) 41(1800) 35-51(900-2860) 30(1180) 630-1910) 1,4(1,0-2,4) 24 (900) 21-28(700-1300) 7 17 lat % (Iloœæ/ m l) 70 (1800) 66-76 (1400-2000) 37(800) 33-41(700-1100) 30 (800) 27-35 (600-900) 1,3 (1,1-1,4) 16 (400) 12-22 (300-500) Doros³y % (Iloœæ/ m l) 73 (1600) 61-84 (960-2600) 46 (940) 32-60 (540-1660) 27 (520) 13-40 (270-930) 1,7 (0,9-4,5) 13 (246) 10-31(122-632) W zapocz¹tkowaniu odpowiedzi immunologicznej na antygen odgrywa rolê aktywacja limfocytu T sk³adaj¹ca siê z dwóch etapów pierwszego sygna³u i wytworzenia synapsy immunologicznej pomiêdzy limfocytem T a komórk¹ prezentuj¹c¹ antygen oraz drugiego sygna³u, w którym najistotniejsze s¹ tzw. cz¹stki kostymuluj¹ce. Po procesie aktywacji i odpowiedzi na swoisty antygen wytwarza siê pamiêæ immunologiczna. Limfocyty T pamiêci maj¹ inny immunofenotyp w porównaniu z limfocytami T naiwnymi (dziewiczymi). CD45RA wystêpuj¹ g³ównie na populacji dziewiczych limfocytów T. Tylko niewielki odsetek tych limfocytów T wykazuje ekspresjê CD45RO. Ta ostatnia determinanta jest charakterystyczna dla limfocytów T pamiêci. CD25 receptor dla interleukiny 2 (IL-2). Wystêpuje na aktywowanych limfocytach T. Jest zwi¹zany z produkcj¹ IL-2 przez limfocyty T po aktywacji drugim sygna³em po kontakcie z antygenem. HLA-DR wystêpuje na limfocytach B i monocytach bez wzglêdu na stan aktywacji. Na limfocytach T wystêpuje po aktywacji i rozpoczêciu odpowiedzi immunologicznej. Aktywowane limfocyty B wykazuj¹ zwiêkszon¹ ekspresjê HLA-DR w porównaniu ze spoczynkowymi limfocytami B. TCR a/b jest stwierdzane na 95% limfocytów T. Heterodimer ³añcuchów a/b reaguje z antygenem w pocz¹tkowych stadiach odpowiedzi limfocytów T. TCR g/d we krwi obwodowej stanowi¹ mniej ni 5% limfocytów T, a w populacji MALT 5 10%. Uwa a siê, e limfocyty T g/d maj¹ zdolnoœæ rozpoznawania antygenów nieprzetworzonych przez komórki prezentuj¹ce antygen. Limfocyty TCR g/d bior¹ udzia³ w odpowiedzi przeciwzakaÿnej i przeciwnowo- 12,5 (714 +/-300) 12,2 (676 +/- 296) 12,9 (573 +/- 264) 13,1 (586 +/- 310) 15,2 (408+/-196) 16,5 (438 +/- 181) 15,5 (318 +/- 191) 16,4 (343 +/- 214) O pracowano na podstawie: Immunodeficiency disorders, General considerations. E.R. Stiehm, H.D. Ochs, A Winkelstein 2. EKSPRESJA MOLEKU ZWI ZANYCH Z FUNKCJ LIMFOCYTÓW T I B

IMMUNOFENOTYP DOJRZA YCH KOMÓREK HEMATOPOETYCZNYCH... 53 TABELA 4. Typ niedoboru 1. T-B+ SCID: Zestawienia a/ X-linked ( niedobó r g c) b/ brak JAK3 c/ brak IL7receptora d/ brak CD45 2. T-B-SCID a/ niedobó r RAG1/ 2 b/ niedobó r TEMI S c/ niedobó r ADA d/ dysgenezja siateczki 3. zespó³ Omenn'a 4. zespó³ hiper IgM (sprzê ony z p³ci¹) 5. brak CD40 6. niedobór determinant MHC klasy II 7. niedobó r ZAP-70 r 8. 2 Typ dziedziczenia niedobór TAP-1, TAP- Niedobory immunoglobulin 1. choroba Brutona (agammaglobulinemia) 2. agammaglobulinemia ciê kich skojarzonych niedoborów odpornoœci Pozio m immunoglobulin Obni ony Obni ony Obni ony, Wzrost IgE Wzrost IgM, niskie IgG, IgA Wzrost IgM, niskie IgG, IgA Prawid³owe lub obni one Prawid³owe Prawid³owe Niski lub brak Niski lub brak Limfocyty B iloœæ Prawid³owa lub podwy szona Znacznie obni ona Prawid³owa lub obni ona (brak) Obecne tylko IgM+, IgD+ Obecne IgM+, IgD+ Prawid³owe Prawid³owe Prawid³owe Pojedyncze lub brak Pojedyncze lub brak Limfocyty T iloœæ Znacznie obni ona Znacznie obni ona Prawid³owe Prawid³owe Prawid³owe lub obni one CD4 Prawid³owe CD4, obni one CD8 Prawid³owe CD4, obni one CD8 XL* ** Uwagi tworowej. Wiêkszoœæ limfocytów T g/d nale y do populacji CD8, a tylko niewielki odsetek jest CD4. W obrêbie MALT limfocyty T g/d odgrywaj¹ istotn¹ rolê jako komórki regulacyjne zapobiegaj¹c uogólnionej odpowiedzi na antygeny pokarmowe. TH1 i TH2 s¹ to funkcjonalne subpopulacje limfocytów T (g³ównie Th) ró ni¹ce siê przede wszystkim profilem produkowanych cytokin. Obecne (aktywowane) Prawid³owe Prawid³owe XL XL obni ona iloœæ NK -"- NK prawid³owe prawid³owe limfocyty Tgd granulocytopenia, ma³op³ytkowoœæ erytrodermia, eozynofilia, hepato- splenomegalia granulocytopenia, ma³op³ytkowoœæ, infekcje oportunistyczne granulocytopenia brak ekspresji determinant MHC klasy I ciê kie bakteryjne infekcje ciê kie bakteryjne infekcje Opracowano na podstawie: Primary immunodeficiency diseases: an update. Clin. Exp. Immunol., 2003, 132, 9-15 3. PIERWOTNE NIEDOBORY ODPORNOŒCI Ze wzglêdu na mo liwoœci cytometrii przep³ywowej jako metody diagnostycznej przedstawiono tylko te niedobory odpornoœci, w których okreœlenie iloœci i proporcji poszczególnych populacji komórek krwi obwodowej oraz ocena ich immunofenotypu ma znaczenie dla diagnostyki i monitorowania przebiegu choroby. Do niedoborów odpornoœci, w których dochodzi do zaburzeñ iloœciowych (brak okreœlonej populacji

54 A. PITUCH-NOWOROLSKA komórek), nale ¹ ciê kie skojarzone niedobory odpornoœci (SCID) oraz niedobory z przewag¹ zaburzeñ odpornoœci humoralnej (np. agammaglobulinemia sprzê ona z chromosomem X, jak i dziedziczona recesywnie autosomalnie, zespó³ hiper IgM ryc. 5, 6, 7) i komórkowej (np. zespó³ DiGeorge'a, niedobór ZAP70 obecnie wliczany przez niektórych do grupy SCID). Drug¹ grup¹ niedoborów, w których cytometria przep³ywowa jako metoda diagnostyczna jest przydatna, s¹ zaburzenia ekspresji okreœlonych determinant, receptorów itp. Do takich niedoborów nale ¹ m.in. zespó³ LAD (brak ekspresji moleku³ adhezyjnych), brak ekspresji determinant uk³adu MHC klasy II oraz niedobór TAP-1, TAP-2 (brak ekspresji MHC klasy I), grupa niedoborów zwi¹zanych z brakiem ekspresji CD40 i CD40L (CD154), receptorów dla interferonu, IL-12. Ciê kie skojarzone niedobory odpornoœci W tabeli 4 zestawiono wybrane skojarzone niedobory odpornoœci, w których dochodzi do braku okreœlonej populacji komórek rozwijaj¹cych siê w szpiku. Du ¹ grupê zró nicowanych klinicznie ciê kich skojarzonych niedoborów stanowi¹ zespo³y CD 4-51,2% CD 8-28,9% RYCINA 5. Krew obwodowa. Pacjent (W.B.) z zespo³em Brutona (agammaglobulinemia sprzê ona z chromosomem X). Komórki uzyskano metod¹ lizy erytrocytów. W bramkach wyselekcjonowano populacjê limfocytarn¹ (R1), monocytarn¹ (R2) oraz granulocytarn¹ (R3). Limfocyty T stanowi¹ 82% populacji R1, natomiast komórki wykazuj¹ce ekspresjê CD19 (limfocyty B) stanowi¹ mniej ni 1,0%. Proporcja pomiêdzy subpopulacj¹ CD4 a CD8 limfocytów T jest prawid³owa (2,3). Ze wzglêdu na znaczenie kliniczne rozpoznania choroby Brutona brak populacji limfocytów B powinien byæ wykazany równie przy u yciu przeciwcia³ monoklonalnych reaguj¹cych z innymi determinantami ani eli CD19. Najczêœciej u ywa siê przeciwcia³ dla CD20, CD22, ³añcuchów lekkich i ciê kich immunoglobulin (podwójnego barwienia, np. CD19/m, CD19/k, CD19/l)

IMMUNOFENOTYP DOJRZA YCH KOMÓREK HEMATOPOETYCZNYCH... 55 RYCINA 6. W badaniach limfocytów krwi obwodowej (bramka R2) u chorego (Sz.D.) z agammaglobulinemi¹ wykazano zaburzenia proporcji limfocytów CD4:CD8 oraz podwy szony odsetek aktywowanych limfocytów T (wykazuj¹cych ekspresjê HLA-DR, CD25). Jest to czêsto zwi¹zane z przewlek³ymi i nawracaj¹cymi zaka eniami bakteryjnymi

56 A. PITUCH-NOWOROLSKA przed stymulacj¹ po stymulacji przed stymulacj¹ po stymulacji przed stymulacj¹ po stymulacji RYCINA 7. Ekspresja ligandu dla CD40 (CD154) na komórkach zdrowego dawcy (kontrola) i 2 pacjentów z zespo³em hiper IgM. Limfocyty T pacjenta 1 po stymulacji wykazuj¹ tylko 27% komórek z indukowaln¹ ekspresj¹ CD154. Limfocyty pacjenta 2 wykazuj¹ indukowaln¹ ekspresjê CD154 w wysokim odsetku (88%), ale iloœæ cz¹steczek przypadaj¹ca na komórkê jest niewielka (niski wskaÿnik MCF). Limfocyty zdrowego dawcy odpowiadaj¹ na stymulacjê wysokim odsetkiem komórek i odpowiednio wysokim wskaÿnikiem MCF dla ekspresji CD154

IMMUNOFENOTYP DOJRZA YCH KOMÓREK HEMATOPOETYCZNYCH... 57 RYCINA 8. Ciê ki skojarzony niedobór odpornoœci (SCID) zespó³ Omenna. W zawiesinie komórek krwi obwodowej uzyskanych po lizie erytrocytów stwierdzono populacjê granulocytarn¹ (R2), limfocytarn¹ (R1) oraz monocytarn¹ (R3). W obrêbie populacji R1 limfocyty T () stanowi³y 65%, limfocyty B (CD19) 2,6%. Poza znacznie obni onym odsetkiem limfocytów B wykazano równie zaburzony stosunek limfocytów T CD4:CD8 (4,25), znacznie podwy szony odsetek aktywowanych limfocytów T (/HLA-DR 45%) charakteryzuj¹ce siê brakiem populacji limfocytów T we krwi obwodowej, co jest zwi¹zane nie tylko z zaburzeniem szpikowej hematopoezy, ale i obecnoœci¹ funkcji grasicy. Wstêpn¹ sugestiê takiego niedoboru u dziecka (noworodka, niemowlêcia) mo na wysun¹æ na podstawie oceny obrazu odsetkowego leukocytów w badaniu morfologii. Zaburzenie proporcji limfocytów i granulocytów na rzecz granulocytów, czêsto znaczne przesuniêcie w stronê form m³odych zwi¹zane z zaka eniem bakteryjnym mo e wskazywaæ na koniecznoœæ szczegó³owego badania iloœciowego i jakoœciowego tych komórek. W ocenie komórek wêz³ów ch³onnych i grasicy równie nie stwierdza siê zasiedlenia rejonów zwi¹zanych z obecnoœci¹ limfocytów T. U tych dzieci wêz³y ch³onne i grasica stanowi¹ resztkow¹ tkankê ³¹czn¹. Niewielk¹ iloœciowo populacjê komórek o charakterystyce limfoidalnej stanowi¹ limfocyty B, które i tak nie mog¹ spe³niaæ swojej funkcji. Wykazanie obni enia lub braku

58 A. PITUCH-NOWOROLSKA RYCINA 9. Ciê ki skojarzony niedobór odpornoœci (SCID) zespó³ Omenna pacjent M.F. W zawiesinie komórek krwi obwodowej uzyskanych po lizie erytrocytów stwierdzono populacjê granulocytarn¹ (R2) zawieraj¹c¹ jedynie granulocyty kwasoch³onne (brak granulocytów obojêtnoch³onnych) oraz limfocytarn¹ (R1). W obrêbie populacji R1 limfocyty T () stanowi³y ok. 90%, limfocyty B (CD19) poni ej 1,0%. Poza brakiem limfocytów B wykazano równie zaburzony stosunek limfocytów T CD4:CD8 (0,82), znacznie podwy szony odsetek aktywowanych limfocytów T (/HLA-DR 59%) limfocytów T, a czêsto równie i B we krwi obwodowej jest podstaw¹ potwierdzenia wstêpnego klinicznego rozpoznania SCID. W jednej z odmian SCID populacjê prawid³owych limfocytów T i B zastêpuj¹ komórki NK. Trudnoœci z wczesn¹ diagnostyk¹ polegaj¹ na tym, e w obrazie krwi w podstawowym badaniu morfologii proporcje granulocytów i limfocytów (komórki NK) mog¹ byæ zachowane. Natomiast w ocenie immunofenotypu stwierdza siê obecnoœæ wysokiego odsetka komórek NK, a prawid³owe limfocyty T i B stanowi¹ czêsto jedynie populacje resztkowe. Obecnie znane s¹ genetyczne zmiany zwi¹zane z patogenez¹ i wykazanie w badaniach molekularnych tych zmian stanowi podstawê klasyfikacji danego niedoboru. W ocenie zaburzeñ sugeruj¹cych zespó³ SCID istotne jest wykonanie badania przynajmniej dwukrotnie, gdy mo e siê zdarzyæ nasilona odpowiedÿ szpikowa na stan

IMMUNOFENOTYP DOJRZA YCH KOMÓREK HEMATOPOETYCZNYCH... 59 RYCINA 10. Ciê ki skojarzony niedobór odpornoœci (SCID): W zawiesinie komórek krwi obwodowej uzyskanych po lizie erytrocytów stwierdzono populacjê granulocytarn¹ (R2), monocytarn¹ (R3) oraz limfocytarn¹ (R1). W obrêbie populacji R1 limfocyty T () stanowi³y jedynie 10%, limfocyty B (CD19) ok. 7%, a komórki NK ok. 70%. Obecne niewielkie iloœciowo populacje limfocytów T i B by³y zdolne do swoistej odpowiedzi immunologicznej u tego pacjenta z zaka eniem wirusem cytomegalii stwierdzano przeciwcia³a w klasie IgG dla tego wirusa zaka enia, posocznicy, a znaczne obni enie odsetka limfocytów jest zjawiskiem przejœciowym. Równie krytycznie nale y analizowaæ wzrost odsetka komórek NK, który mo e byæ zwi¹zany z zaka eniem, np. wirusem cytomegalii, a nie obrazem zespo³u SCID. Powtórne badanie za kilka dni, czêsto w innej sytuacji klinicznej (poprawa stanu dziecka) mo e pomóc w rozstrzygniêciu tych w¹tpliwoœci. Najczêœciej jednak obraz kliniczny, brak obecnoœci wêz³ów ch³onnych, cienia grasicy, wywiad rodzinny jednoznacznie wskazuj¹ na zespó³ skojarzonego niedoboru odpornoœci, co u³atwia analizê, a przed wszystkim interpretacjê zaburzeñ komórkowych we krwi obwodowej. Do SCID nale y równie zespó³ Omenna, który ma bardzo charakterystyczny obraz kliniczny (erytrodermia, powiêkszenie wêz³ów ch³onnych, w¹troby, œledziony, czêsto przewlek³e biegunki). W badaniu morfologii typowa jest wysoka liczba leukocytów (hiperleukocytoza) oraz wysoki odsetek granulocytów kwasoch³onnych.

60 A. PITUCH-NOWOROLSKA W ocenie immunofenotypowej komórek krwi obwodowej stwierdza siê obecnoœæ dodatkowej populacji komórek ziarnistych (granulocyty kwasoch³onne), a w populacji limfocytarnej czêsto obni ony odsetek lub brak limfocytów B. Limfocyty T przewa- aj¹, proporcje pomiêdzy subpopulacjami tych komórek s¹ zachowane. Stwierdza siê cechy aktywacji, co przejawia siê tym, e wiêkszoœæ, a w niektórych przypadkach wszystkie limfocyty T wykazuj¹ ekspresjê HLA-DR, CD25. W ciê kich postaciach zespo³u Omenna mog¹ byæ dodatkowe zaburzenia hematopoezy, np. dyserytropoeza, agranulocytoza. W wêz³ach ch³onnych nie stwierdza siê centrów rozrodczych w ocenie histologicznej, a limfocytów B w badaniach populacji komórkowych wêz³a ch³onnego w cytometrze (ryc. 8 i 9). Innym dobrze okreœlonym niedoborem odpornoœci komórkowej, w którym dominuje brak populacji limfocytów T jest anomalia DiGeorge'a. Jest to zespó³ wad zwi¹zanych z zaburzeniem rozwoju trzeciej i czwartej kieszonki skrzelowej. Do tego zespo³u nale ¹ wada serca (g³ównie du ych pni naczyniowych, tetralogia Fallota), brak przytarczyc (zaburzenia gospodarki wapniowej), niedorozwój lub brak grasicy (w konsekwencji brak limfocytów T), dysmorfia twarzy. W ocenie subpopulacji komórek jednoj¹drzastych krwi obwodowej populacja limfocytów jest zmniejszona, sk³ada siê g³ównie z limfocytów B. Istniej¹ postacie kompletnej i niekompletnej anomalii DiGeorge'a, a liczba limfocytów T mo e byæ ró na od kilkunastu procent do prawie prawid³owej, proporcje pomiêdzy subpopulacjami CD4 i CD8 zachowane. Potwierdzenie zespo³u DiGeorge'a opiera siê na wykazaniu typowych delecji w chromosomie 22, u czêœci chorych w chromosomie 10. Podobny obraz obni onego odsetka limfocytów T obserwuje siê w zespole Nijmehen oraz innych zespo³ach, takich jak: ataksjateleangiektazja, zespó³ ataksjopodobny (mutacja genu Mre 11) nale ¹cych do grupy zwi¹zanej z niestabilnoœci¹ chromosomów. W tych zespo³ach obraz kliniczny jest bardzo typowy i ocena populacji limfocytów jest jedynie pomocnicza. W niedoborach z przewag¹ mechanizmów humoralnych ocena populacji limfocytów jest krytyczna dla rozpoznania agammaglobulinemii zarówno w postaci sprzê onej z chromosomem X (choroba Brutona), jak i znacznie rzadszej postaci o dziedziczeniu autosomalnym recesywnym, w której choruj¹ i ch³opcy, i dziewczêta. Wykazanie bardzo niskiej liczby lub braku limfocytów B potwierdza inne wyniki badañ, takie jak: brak immunoglobulin w surowicy, klinicznie obserwowane œladowe migda³ki czy niewyczuwalne wêz³y ch³onne u dziecka z ciê kim przebiegiem zaka eñ bakteryjnych (ryc.5 i 6). Znacznie czêœciej ani eli agammaglobulinemiê obserwuje siê pospolity zmienny niedobór odpornoœci (CVID) wystêpuj¹cy w ró nym wieku, u obu p³ci. W tym zespole podstaw¹ rozpoznania jest obni ony poziom najczêœciej IgG, ale towarzysz¹ temu u znacznego odsetka chorych zaburzenia proporcji limfocytów T CD4:CD8. Limfocyty B s¹ obecne w iloœci prawid³owej dla wieku, choæ u czêœci chorych ich liczba mo e byæ na dolnej granicy normy. Zespó³ hiper-igm wystêpuje w formie sprzê onej z p³ci¹ (dziedziczony jako sprzê ony z chromosomem X) oraz w formie dziedziczonej autosomalnie recesywnie. W postaci sprzê onej z chromosomem X na aktywowanych limfocytach T wspomagaj¹cych (CD4) chorego nie udaje siê stwierdziæ ekspresji ligandu dla cz¹steczki CD40 (CD154). Brak tego ligandu upoœledza interakcjê pomiêdzy limfocytami T a

IMMUNOFENOTYP DOJRZA YCH KOMÓREK HEMATOPOETYCZNYCH... 61 limfocytami B. W konsekwencji nie dochodzi do prawid³owego ró nicowania limfocytów B i nie nastêpuje zmiana izotypu wytwarzanych immunoglobulin. We krwi kr¹ ¹ limfocyty B wykazuj¹ce na powierzchni jedynie IgM i IgD. Ocena ekspresji CD40L wymaga procedury aktywacji komórek, równoleg³ego hodowania komórek osoby zdrowej (jako kontrola), równoczesnego barwienia CD4, CD8. Wykazanie braku zmiany izotypu immunoglobulin polega na pokazaniu obecnoœci jedynie ³añcucha ciê kiego m i d na powierzchni limfocytów B, a braku obecnoœci ³añcucha ciê kiego g, a, e. Proporcja limfocytów B z IgM i ³añcuchem lekkim k do limfocytów B z ³añcuchem lekkim l jest zachowana. 4. WTÓRNE NIEDOBORY ODPORNOŒCI Zmiany po infekcjach wirusowych Infekcje wirusowe (np. wirus herpes, cytomegalii, Epsteina-Barr i odry, ró yczki) powoduj¹ czêsto obni enie odsetka limfocytów Th (CD4), któremu towarzyszy brak odpowiedzi na stymulacjê mitogenami i antygenami. Zjawisko to jest przejœciowe aczkolwiek u niektórych chorych zw³aszcza po przebyciu mononukleozy zakaÿnej o ciê kim przebiegu zaburzenia w odpornoœci komórkowej mog¹ trwaæ nawet kilka lat. Z obserwacji wiadomo, e wirus odry równie prowadzi do przejœciowego zaburzenia odpowiedzi na antygeny i przebieg zaka eñ nastêpuj¹cych nied³ugo po przebyciu odry mo e byæ ciê ki i trudny do opanowania. Monitorowanie zaburzeñ w proporcji subpopulacji limfocytów T oraz odpowiedzi limfocytów B na antygeny (np. szczepionki) pozwala na okreœlenie, jak g³êbokie s¹ to zaburzenia i jak d³ugo trwa³y. Niedobory zwi¹zane z chemioterapi¹ D³ugotrwa³a chemioterapia prowadzi najczêœciej do obni enia odsetka limfocytów. W przypadku ostrych bia³aczek limfoblastycznych lub ch³oniaków nieziarniczych z linii limfocytu B obni enie liczby tych komórek mo e byæ bardzo znaczne (nawet poni ej 5%) i trwaæ stosunkowo d³ugo (do kilku miesiêcy). U niektórych chorych obserwuje siê zjawisko odwrotne wzrost liczby limfocytów B i ich prekursorów w szpiku, a czasem nawet we krwi obwodowej w nied³ugi czas po zakoñczeniu chemioterapii. Jest to tzw. odbicie (rebound). Taki obraz mo e sugerowaæ wznowê ostrej bia³aczki limfoblastycznej z linii limfocytu B i wymaga czêstej kontroli. Opisuje siê, e wzrost liczby prekursorów i limfocytów B po zakoñczeniu leczenia mo e trwaæ do kilku miesiêcy (ponad 6 miesiêcy) bez objawów wznowy procesu rozrostowego. Po tym okresie nastêpuje normalizacja. W zakresie limfocytów T nie obserwuje siê zjawiska odbicia natomiast mo e doœæ d³ugo utrzymywaæ siê zaburzenie proporcji limfocytów CD4:CD8. Obni enie odsetka i liczby bezwzglêdniej limfocytów T CD4 mo e utrzymywaæ siê ponad rok. Monitorowanie immunofenotypowe limfocytów T pozwala na okreœlenie czasu normalizacji iloœciowych proporcji pomiêdzy subpopulacjami tych komórek. Osobnym zagadnieniem jest zaburzenie funkcji tych komórek, które utrzymuje siê u niektórych chorych przez d³ugi okres. Chorzy

62 A. PITUCH-NOWOROLSKA ci po zakoñczeniu leczenia chemioterapi¹ mog¹ wymagaæ stosowania do ylnych preparatów immunoglobulin jako leczenia wtórnego niedoboru odpornoœci humoralnej. AIDS Ze wzglêdu na powszechn¹ znajomoœæ zmian w obrêbie subpopulacji limfocytów T u chorych zaka onych wirusem HIV i w trakcie rozwijaj¹cego siê zespo³u AIDS wspominamy jedynie o tym, aby przypomnieæ, e i w Polsce nale y o tym zaka eniu pamiêtaæ. Znaczne i postêpuj¹ce spadki odsetka i iloœci limfocytów CD4 u osób m³odocianych i doros³ych zw³aszcza z grup ryzyka powinny byæ uzupe³niane badaniami wirusologicznymi na obecnoœæ przeciwcia³ dla antygenów wirusa HIV. Monitorowanie chorych polega na systematycznej ocenie odsetka limfocytów CD4 i CD8 i okreœleniu bezwzglêdniej liczby limfocytów w ka dej z tych subpopulacji. 5. ZASTRZE ENIA I UWAGI DO OCENY ILOŒCIOWEJ I JAKOŒCIOWEJ (W TYM IMMUNOFENOTYPU) KOMÓREK IMMUNOKOMPETENTNYCH W DIAGNOSTYCE PIERWOTNYCH I WTÓRNYCH NIEDOBORÓW ODPORNOŒCI Zastrze enie i problemy w tych badaniach s¹ natury podstawowej i zwi¹zanej z pierwotnymi niedoborami. Te podstawowe to mo liwoœæ uszkodzenia komórek tak, e iloœæ nieuszkodzonych jest niewielka, ekspresja determinant niska, zmienna lub nieobecna. Wniosek z takiego obrazu na ekranie cytometru (dot plot FSC/SSC lub CD45//CD19) jest jeden powtórzyæ badanie. W drugiej grupie problemów s¹ takie, które wynikaj¹ z natury niedoborów, np. w niektórych postaciach SCID brakuje prawie ca³kiem populacji o charakterystyce limfocytarnej we krwi obwodowej. Problem jest tym wiêkszy, e najczêœciej s¹ to noworodki, niemowlêta lub ma³e dzieci o niskiej wadze, tak wyniszczone, e pobranie wiêkszych iloœci krwi stanowi pewn¹ trudnoœæ (np. mo e byæ wskazane przetoczenie napromieniowanej i ubogo leukocytarnej masy erytrocytarnej przed badaniami). Do zestawu przeciwcia³ dla leukocytów krwi obwodowej (zestawy firmowe) czêsto trzeba dodaæ przeciwcia³a, np. dla komórek NK. Poszukiwanie komórek NK jest wskazane szczególnie wtedy, gdy komórki obecne w bramce limfocytarnej nie wykazuj¹ ekspresji determinant typowych dla limfocytów lub suma komórek o charakterystyce immunofenotypowej limfocytów T i B jest niska, np. oko³o 40%. Rozpoznanie pierwotnego niedoboru odpornoœci jest rozpoznaniem wa nym dla chorego i lekarza, a najczêœciej jest to rozpoznanie na ca³e ycie. Standardy postêpowania diagnostycznego sugeruj¹ wykonanie wiêcej ni tylko jednego badania i sprawdzenie wyniku np. stosuj¹c kilka przeciwcia³ dla limfocytów B, poszerzaj¹c panel przeciwcia³ dla aktywnych limfocytów T itd. Mo liwoœæ uzyskania zawiesiny komórek do oceny immunofenotypu metod¹ lizy erytrocytów lub gradientu gêstoœci pozwala na unikniêcie problemów zwi¹zanych z

IMMUNOFENOTYP DOJRZA YCH KOMÓREK HEMATOPOETYCZNYCH... 63 trudnoœci¹ wyodrêbnienia poszczególnych populacji na podstawie parametrów SSC i FSC. Ponadto, obecnie d¹ y siê do wykorzystania 3- i 4-kolorowej cytometrii, co pozwala na równoczesne barwienie badanych komórek przeciwcia³em dla tzw. determinanty wyró niaj¹cej np. dla limfocytów T, a dla limfocytów B CD19 w ka dej próbówce, w której s¹ komórki barwione przeciwcia³ami dla innych determinant, np. CD4/CD8, CD20/CD22, ³añcuchy lekkie kappa/lambda itp. Diagnostyka pierwotnych i wtórnych niedoborów odpornoœci jest istotna dla ustalenia rozpoznania, prowadzenia chorych (profilaktyka zaka eñ, leczenie aktualnych infekcji), planowania leczenia perspektywicznego w tym równie przesz-czepienia szpiku jako metody trwa³ego wyleczenia w wielu niedoborach, zw³aszcza skojarzonych (np. SCID). Wprowadzanie szerokiego panelu przeciwcia³ do oceny immunofenotypu pozwala na bardziej precyzyjne okreœlenie typu niedoboru, a w konsekwencji bardziej skuteczne leczenie. LITERATURA [1] ALEMAN K, NOORDZIJ JG, DE GROOT R et al. Reviewing Omenn syndrome. Eur J Pediatr 2001; 160: 718/0725. [2] BALLOW M. Primary immunodeficiency disorders: antibody deficiency. J Allergy Clin Immunol 2002; 109: 581 591. [3] CHAPEL H, GEHA R, ROSEN F. Primary immunodeficiency disease: an update. Clin Exp Immunol 2003; 132: 9 15. [4] CONLEY MH, NOTANGELO LD, ETZIONI A. Diagnostic criteria for primary immunodeficiences. Clinical Immunology 1999; 93: 190 197. [5] CUNNINGHAM-RUNDLES CH, BODIAN C. Common variable immunodeficiency: clinical and immunological features of 248 patients. Clinical Immunology 1999; 92: 34 48. [6] CUNNINGHAM-BUNDLES S, YEGER-BITMAN R, NACHMAN SA et al. New variant of MHC class II deficiency with Interleukin-2 abnormality. Clin Immunol Immunopathol 1990; 56: 116 123. [7] DANIELS JA, LEDERMAN HM, MAITRA A et al. Gastrointestinal tract pathology in patients with common variable immunodeficiency (CVID). A clinicopathologic study and review. Am J Surg Pathol 2007; 31: 1800 1812. [8] ETZIONI A, OCHS HD. The hyper IgM syndrome - an evolving story. Review article. Pediatric Research 2004; 56: 519 525. [9] GEHA RS, NOTANGELO LD, CASANOVA J-L et al. Primary immunodeficiency diseases: an update from the International Union of Immunological Societies Primary Immunodeficiency Diseases Classification Committee. J Allergy Clin Immunol 2007; 120: 776 794. [10] GILMOUR KC, WALSHE D, HEATH S et al. Immunological and genetic analysis of 65 patients with a clinical suspicion of X linked hyper-igm. J Clin Pathol Mol Pathol 2003; 56: 256 262. [11] KATO M, KIMURA H, SEKI M et al. Omenn syndrome review of several phenotypes of Omenn syndrome and RAG1/RAG2 mutations in Japan. Allergology International 2006; 55: 115 119. 12] KILIC SS. Omenn's syndrome. Clinical article. International Pediatrics 2003; 18: 41 42. [13] VAN KOOTEN C, BANCHEREAU J. CD40-CD40ligand. J Leukoc Biol 2000; 67: 2 17. [14] LOPEZ-GRANADOS E, CAMBRONERO R, FERREIRA A et al. Three novel mutations reflect the variety of defects causing phenotypically diverse X-linked hyper-igm syndrome. Clin Exp Immunol 2003; 133: 123 131. [15] NOTANGELO LD, HAYWD. X-linked immunodeficiency with hyper-igm (XHIM). Clin Exp Immunol 2000; 120: 399 405. [16] PAVELEC G, BUHRING HJ. Expression of MHC class II epitopes on human T cell lymphocyte clones. Cellular Immunology 1990; 127: 520 526.

64 A. PITUCH-NOWOROLSKA [17] PITUCH-NOWOROLSKA A, KOWALCZYK D, MACURA-BIEGUN A et al. The clinical features of hyper IgM syndrome. A 4 cases report. Clinical Immunol 2007; 32: 105 112. [18] PRIMY IMMUNODEFICIENCY DISEASES. REPORT OF A WHO SCIENTIFIC GROUP. Clin Exp Immunol 1997; 109: 1 28. [19] PUCK JM. Severe combined immunodeficiency: new advances in diagnosis and treatment. Immunol Res 2007; 38: 64 67. [20] STENT G, IRVING L, LEWIN S et al. The kinetics of surface expression of CD11/CD18 integrins and CD54 on monocytes and macrophages. Clin Exp Immunol 1995; 100: 366 376. [21] STIEHM ER, OCHS HD, WINKELSTEIN JA.[red.] Immunologic disorders in infants and children. 5th edition. Elsevier, 2004. [22] de VRIES E. Immunophenotyping of lymphocytes in healthy and immunodeficient children. Rotterdam 1999. [23] ZEMAN K. [red.] Zaburzenia odpornoœci u dzieci. Biblioteka Pediatry. PZWL. 2002. [24] ZEMBALA M, GÓRSKI A. [red.] Zarys immunologii klinicznej. PZWL 2001. Anna Pituch-Noworolska, Zak³ad Immunologii Klinicznej, Polsko-Amerykañski Instytut Pediatrii Collegium Medicum Uniwersytetu Jagielloñskiego, ul. Wielicka 265, 30-663 Kraków e-mail: mipituch@cyf-kr.edu.pl