RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 1685851 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 31.01.2006 06101055.9 (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: 13.05.2009 Europejski Biuletyn Patentowy 2009/20 EP 1685851 B1 (13) T3 (51) Int. Cl. A61K51/12 G01N33/62 C12Q1/04 (2006.01) (2006.01) (2006.01) (54) Tytuł wynalazku: Sposób diagnozy infekcji wywołanych Helicobacter pylori i zestaw diagnostyczny do wykorzystywania tego sposobu (30) Pierwszeństwo: US20050252886 EP20050001997 19.10.2005 01.02.2005 (43) Zgłoszenie ogłoszono: 02.08.2006 Europejski Biuletyn Patentowy 2006/31 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: 30.10.2009 Wiadomości Urzędu Patentowego 10/2009 (73) Uprawniony z patentu: Aygen Sitke, Köln, DE PL/EP 1685851 T3 (72) Twórca (y) wynalazku: Aygen Sitke, Köln, DE (74) Pełnomocnik: WTS Rzecznicy Patentowi rzecz. pat. Gdula Anna 53-114 Wrocław ul. R. Weigla 12 Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).
Opis Tło wynalazku [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu diagnozy infekcji Helicobacter pylori oraz zestawu diagnostycznego do wykonania tego sposobu. [0002] Istnieje wiele znanych sposobów diagnozowania infekcji Helicobacter pylori, np. badanie endoskopowe górnego odcinka przewodu pokarmowego, test do wykrywania antygenu w kale (HpSA /Meridian, Mediolan, Włochy), metoda serologiczna (Pylortest EIA- G III / Orion Diagnostics, Espoo, Finlandia), badanie na wykrywanie przeciwciał w moczu (Otsuka Diagnostic, Frankfurt, Niemcy). Przodującą metodą stał się test oddechowy na obecność Helicobacter INFAI (INFAI GmbH, Kolonia, Niemcy). Jest on handlowo dostępny na rynku razem z 75mg mocznika znakowanego izotopem 13 C węgla wraz z do 1g kwasu cytrynowego dla dorosłych oraz z 45mg mocznika znakowanego 13 C wraz z 100ml soku pomarańczowego dla dzieci w wieku powyŝej 3 lat. [0003] W US-A-6 113 875 ujawniono tabletkę zawierającą 50 mg znakowanego izotopem 13 C mocznika razem z 63 mg kwasu cytrynowego, natomiast w EP-A-0 881 491 ujawniono zestaw wraz z 200 ml roztworu zawierającego 4.2 g kwasu cytrynowego i 50 ml roztworu zawierającego 75 mg znakowanego izotopowo 13 C mocznika. [0004] PowaŜną niedogodnością niemal wszystkich z tych testów, jednak, jest to, Ŝe terapia inhibitorami pompy protonowej (PPI) i lekami zobojętniającymi kwas (antacidami) zakłóca i powoduje powstawanie fałszywie negatywnych wyników; patrz L. Gatta et al, w American Journal of Gastroenterology, 2004, str. 823-828. [0005] Istnieje zatem konieczność, by leczenie wspomnianymi PPI oraz lekami zobojętniającymi kwas (antacidami) zostało przerwane przynajmniej 12 do 14 dni przed wykonaniem testu oddechowego z uŝyciem mocznika 13 C (UBT), tak by moŝna było otrzymać wiarygodne wyniki. Zwiększa to koszty i stanowi niedogodność, ze względu na to, Ŝe pacjent musi powrócić po przynajmniej 12 dniach. Ponadto, przerwanie terapii w czasie testu jest niedogodne dla pacjenta. Streszczenie wynalazku [0006] Celem wynalazku jest dostarczenie sposobu do diagnozy Helicobacter pylori u pacjentów pobierających PPI lub inne leki zobojętniające kwas (antacidy).
2 [0007] Zaskakująco, stwierdzono, Ŝe problem ten moŝe zostać rozwiązany, jeŝeli pacjentom pobierającym inhibitory pompy protonowej (PPI) podawane są wyŝsze ilości kwasów kompensujących w ciągu 10 minut do jednej godziny aktywność PPI. [0008] Nie moŝna było przewidzieć, Ŝe taka krótkotrwała kompensacja aktywności PPI będzie uŝyteczna w przezwycięŝeniu znanego, długotrwałego, negatywnego wpływu tych leków na wiarygodność testów UBT. [0009] Istnieją równieŝ istotne wskazania, Ŝe jest to takŝe pomocne w przypadku pacjentów, którym podawane są leki zobojętniające kwas (antacidy). [0010] Jest to nie tylko bardzo korzystne dla pacjentów poddawanych testowi natychmiastowo, bez przerywania przyjmowania PPI lub leków zobojętniających kwas (antacidów). Lepiej akceptowane są równieŝ uciąŝliwości związane z przerwaniem terapii przez najwyŝej jedną godzinę niŝ z przerwaniem jej na dwa tygodnie. Szczegółowy opis wynalazku [0011] W jednej z realizacji, w wynalazku dostarczono sposób diagnozowania infekcji Helicobacter pylori u pacjentów traktowanych inhibitorami pompy protonowej (PPI), obejmujący następujące etapy a) podanie pacjentowi ilości kwasu w zakresie od 5 do 7 g, b) zebranie od pacjenta pierwszej próbki testu oddechowego lub pierwszej próbki krwi lub obu tych próbek, c) podanie pacjentowi mocznika znakowanego izotopem 13 C, d) odczekanie okresu 10 do 60 minut, e) zebranie od pacjenta drugiej próbki testu oddechowego lub drugiej próbki krwi lub obu tych próbek, f) pomiar zawartości 13 C w CO 2 w pierwszej i drugiej próbce. [0012] Ilość kwasu mieści się korzystnie w zakresie od 5.5 do 6.5 g. Odpowiednie kwasy są dopuszczalnymi farmakologicznie kwasami, na przykład kwasami wybranymi z grupy kwasu cytrynowego, kwasu jabłkowego, kwasu winowego i ich mieszanin.
3 [0013] Szczególnie uŝyteczna mieszanina jest kombinacją 5 g kwasu cytrynowego, 0.3 g kwasu jabłkowego i 0.2 g kwasu winowego. [0014] Korzystnie, kwas podawany jest w roztworze z wodą, np. 150 do 300 ml. Korzystnie, dodane są słodziki w celu poprawy smaku roztworu. Podobnie, mogą być dodane inne składniki, takie jak substancje smakowe lub substancje barwiące. [0015] W jednej z realizacji wynalazku, testem jest test oddechowy. W teście tym, próbki oddechowe pobierane są przed podaniem mocznika znakowanego 13 C i około 30 minut po podaniu mocznika. Następnie, mierzona jest zawartość 13 C w CO 2 ze wspomnianych próbek oddechowych. RóŜnica pomiędzy wartością odczytaną dla 00 min a wartością dla 30 min większa niŝ 3.2, korzystnie większa niŝ 4 ppm, wskazuje na obecność infekcji Helicobacter pylori. [0016] W innej realizacji, próbki krwi pobierane są od pacjentów przed podaniem mocznika znakowanego 13 C a druga próbka krwi pobierana jest około 15 minut później. Pod wpływem dodania silnego kwasu, 13 CO 2 uwalniany jest z próbek krwi i odpowiednio, moŝe być mierzone stęŝenie 13 CO 2. Wartość graniczna dla testu z krwi wynosi 2 ppm, tj. róŝnica między wartością uzyskaną dla 00 min a wartością dla 15 min większa niŝ 2 ppm wskazuje na infekcję Helicobacter pylori. [0017] Pomiar 13 CO 2 jest związany z łączną zawartością 12 CO 2 i 13 CO 2. Odpowiednią metodą jest na przykład izotopowa spektrometria masowa (IRMS). [0018] Odpowiednie ilości mocznika- 13 C zaleŝą od stopnia czystości mocznika- 13 C oraz od rodzaju próbek. [0019] Handlowo dostępny mocznik- 13 C jest 99% czystości. JeŜeli zastosowany jest taki mocznik- 13 C, wystarczająca jest ilość od 10 do 100 mg. JeŜeli uŝyty jest mocznik- 13 C niŝszej czystości, ilość mocznika musi być odpowiednio wyŝsza. JeŜeli, na przykład zawartość 13 C wynosi 50%, potrzebna jest jego około dwa razy wyŝsza ilość. [0020] Do testu krwi, wystarczająca ilość leŝy w zakresie od 5 do 50 mg, korzystnie około 10 mg. Do testu oddechowego, typowo ilość ta wynosi około 75 mg, wymagana dla dzieci ilość to około 45 mg. [0021] W jednej z realizacji wynalazku, leczenie PPI jest zaprzestane na 1, 2 lub 3 dni, korzystnie jeden dzień, przed diagnozą infekcji Helicobacter pylori. PodwyŜsza to wiarygodność sposobu i pozwala na uŝycie niŝszych ilości kwasów. Korzystna mieszanina to np. 4.5 g kwasu cytrynowego, 0.3 g kwasu jabłkowego i 0.2 g kwasu winowego. [0022] W kolejnej realizacji, kwas podawany jest razem z mocznikiem znakowanym izotopem 13 C. Sposób obejmuje następujące etapy
4 a) zebranie od pacjenta pierwszej próby oddechowej lub pierwszej próby krwi lub obu prób, b) podanie pacjentowi ilości kwasu w zakresie od 5 do 7 g i znakowanego izotopem 13 C mocznika, c) odczekanie okresu 10 do 60 minut, d) zebranie od pacjenta drugiej próby oddechowej lub drugiej próby krwi lub obu prób, e) pomiar zawartości 13 C w CO 2 pierwszej i drugiej próby. [0023] Kwasy podawane są korzystnie w postaci roztworów wodnych. [0024] Takie roztwory mogą być otrzymane ze stałych lub ciekłych kwasów tuŝ przed przeprowadzeniem testu. Mogą one być równieŝ przygotowane w większych ilościach i następnie przechowywane. [0025] Test oddechu jest prowadzony w zwykły i dobrze określony sposób opisany w literaturze i ulotkach informacyjnych dla pacjentów, dostępnych równieŝ lekarzom. Próby są analizowane na przykład za pomocą gazowej, izotopowej spektroskopii masowej lub spektrometrii w podczerwieni. [0026] W poniŝszych przykładach porównano wyniki uzyskane za pomocą testu według niniejszego wynalazku, z zastosowaniem 5 g kwasu cytrynowego, 0.3 g kwasu jabłkowego oraz 0.2 kwasu winowego (Nowy 13 C UBT) z rezultatami testów znanych ze stanu techniki ( 13 C -UBT standardowy z 1g kwasu cytrynowego). [0027] Przebadano 152 kolejnych pacjentów Helicobacter pylori-pozytywnych. [0028] U kaŝdego pacjenta wykonano endoskopię górnego odcinka przewodu pokarmowego. Podczas endoskopii, przeprowadzano wielokrotne biopsje z odźwiernika i trzonu Ŝołądka. Zastosowano badania histologiczne, RUT (szybki test ureazowy) oraz przeprowadzono hodowlę w celu oceny statusu Helicobacter pylori, histologię wykonano stosując H&E i barwienie zmodyfikowaną metodą Giemsy. [0029] Wyniki histologiczne określano stosując zmodyfikowaną klasyfikację Sydney. Pacjentów uznawano za zainfekowanych, jeŝeli 2 z 3 testów dawały pozytywne wyniki lub jeŝeli sama hodowla była pozytywna.
5 [0030] Pacjentów określonych jako pozytywnych wybierano losowo za pomocą listy losowego doboru, do badania z uŝyciem standardowej 13 C-UBT lub nowej 13 C-UBT formulacji. [0031] Po teście UBT, otrzymywali oni standardową dawkę ezomeprazolu (40 mg/dzień) pobieraną rano, 30 min przed śniadaniem. [0032] Pacjenci proszeni byli o powrót w 14-ym i 28-ym dniu leczenia ezomeprazolem w celu wykonania testów UBT oraz w celu sprawdzenia prawidłowości przyjmowania leków. [0033] Pacjenci proszeni byli równieŝ o powrót w 7-ym i 14-ym dniu po zakończeniu leczenia ezomeprazolem w celu wykonania UBT. [0034] Czułość, róŝnicę pomiędzy odsetkami dla niezaleŝnych próbek oraz ich wartości Ci (przedziały ufności) obliczano na podstawie metod Wilsona i Newcombe. [0035] Czułość szacowano na podstawie analizy ITT (analizy wyników w grupach wyodrębnionych zgodnie z zaplanowanym leczeniem), tj. pacjenci, którzy zrezygnowali z badania uwaŝani byli za wyniki fałszywie negatywne. [0036] Wartość p obliczano stosując test dokładności Fischera. Obliczano równieŝ NNT (liczbę potrzebną do leczenia). [0037] Przeprowadzono wielozmienną regresję logistyczną dla niezaleŝnych czynników determinujących czułość z zastosowaniem następujących zmiennych: Rodzaj UBT Płeć Wiek Indeks masy ciała Wynik dla Helicobacter pylori w Antrum (gęstość) Wynik dla Helicobacter pylori w Corpus (gęstość) [0038] Wielozmienną regresję logistyczną wykonano stosując analizę ITT, tj. pacjenci, którzy zrezygnowali z badania uwaŝani byli za fałszywie negatywne wyniki. [0039] Spośród 152 pacjentów Helicobacter pylori-pozytywnych, 76 losowo wybranych pacjentów testowano za pomocą sposobu według wynalazku a 76 pacjentów testowano z uŝyciem formulacji znanych ze stanu techniki. Wyniki po 14-ym dniu PPI [0040] Test według wynalazku dał 71 prawdziwie pozytywnych prób, 3 fałszywie negatywne, 2 rezygnacje z badania.
6 [0041] Test standardowy dał 59 prawdziwie pozytywnych prób, 14 fałszywie negatywnych i 3 rezygnacje z badania. [0042] Czułość wzrosła od 75,7% do 95,8% przy wartości p równej 0.0005. Wyniki po 28-ym dniu PPI [0043] Sposób według wynalazku dał 67 prawdziwie pozytywnych prób, 7 fałszywie negatywnych, 2 rezygnacje z badania. [0044] Sposób według stanu techniki dał 43 prawdziwie pozytywne próby, 30 fałszywie negatywnych, 3 rezygnacje z badania. Wyniki po 7-ym dniu okresu wash-out [0045] Nowy test: 74 prawdziwie pozytywnych prób, 2 rezygnacje z badania. [0046] Standardowy test: 73 prawdziwie pozytywnych prób, 3 rezygnacje z badania. Wyniki po 14-ym dniu okresu wash-out [0047] Nowy test: 74 prawdziwie pozytywne próby, 2 rezygnacje z badania. [0048] Standardowy test: 73 prawdziwie pozytywnych prób, 3 rezygnacje z badania. [0049] Wyniki jasno wskazują na duŝe znaczenie ulepszenia uzyskanego za pomocą nowej formulacji i potwierdzają znany wymóg przynajmniej 12-dniowego zaprzestania leczenia PPI w przypadku testu konwencjonalnego. Obecnie moŝna tego uniknąć dzięki zastosowaniu sposobu według niniejszego wynalazku.
ZastrzeŜenia patentowe 1. Sposób diagnozy infekcji Helicobacter pylori u pacjentów traktowanych inhibitorami pompy protonowej (PPI), obejmujący następujące etapy I. a) podanie pacjentowi ilości kwasu w zakresie od 5 do 7 g, I. b) zebranie od pacjenta pierwszej próbki oddechowej lub pierwszej próbki krwi lub obu tych próbek, I. c) podanie pacjentowi mocznika znakowanego izotopem 13 C, I. d) odczekanie okresu 10 do 60 minut, I. e) zebranie od pacjenta drugiej próbki oddechowej lub drugiej próbki krwi lub obu tych próbek, I. f) pomiar zawartości 13 C w CO 2 w pierwszej i drugiej próbce lub II. a) zebranie od pacjenta pierwszej próby oddechowej lub pierwszej próby krwi lub obu prób, II. b) podanie pacjentowi ilości kwasu w zakresie od od 5 do 7 g i mocznika znakowanego 13 C, II. c) odczekanie okresu 10 do 60 minut, II. d) zebranie od pacjenta drugiej próby oddechowej lub drugiej próby krwi lub obu prób, II. e) pomiar zawartości 13 C w CO 2 pierwszej i drugiej próby. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, Ŝe ilość kwasu mieści się w zakresie od 5.5 do 6.5 g. 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, Ŝe kwas wybrany jest z grupy kwasu cytrynowego, kwasu jabłkowego, kwasu winowego i ich mieszanin.
8 4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, Ŝe kwasem jest kwas cytrynowy, sam lub w mieszaninie z kwasem cytrynowym, kwasem jabłkowym i kwasem winowym. 5. Sposób według dowolnego z zastrz. od 1 do 4, znamienny tym, Ŝe kwas podawany jest jako roztwór z wodą, opcjonalnie wraz ze składnikami wybranymi z grupy słodzików, substancji smakowych i substancji barwiących. 6. Sposób według dowolnego z zastrz. od 1 do 5, znamienny tym, Ŝe czas trwania etapu I. d) lub II. c) mieści się w zakresie od 10 do 15 minut oraz pierwsza i druga próba jest próbką krwi. 7. Sposób według dowolnego z zastrz. od 1 do 6, znamienny tym, Ŝe czas trwania etapu I. d) lub II. c) mieści się w zakresie od 20 do 40 minut oraz pierwsza i druga próba jest próbką oddechową. 8. Sposób według dowolnego z zastrz. od 1 do 7, znamienny tym, Ŝe pacjent przerywa leczenie PPI na 1 do 3 dni przed diagnozą infekcji Helicobacter pylori. 9. Sposób według dowolnego z zastrz. od 1 do 8, znamienny tym, Ŝe ilość mocznika znakowanego 13 C odpowiada od 10 do 100 mg 99% mocznika- 13 C. 10. Zestaw do diagnozy Helicobacter pylori zawierający a) kwasowy, wodny roztwór zawierający od 5 do 7 g kwasu oraz ilość mocznika znakowanego 13 C odpowiadającą od 10 do 100 mg 99% mocznika- 13 C lub b) opakowanie proszku ze stałym kwasem, zawierające od 5 do 7 g kwasu oraz oddzielne opakowanie mocznika, zawierające ilość znakowanego izotopowo mocznika- 13 C odpowiadającą od 10 do 100 mg 99% mocznika- 13 C c) pojemnik na zebranie próbki krwi lub próbki oddechowej d) ulotka informacyjna dla pacjenta 11. Zestaw według zastrz. 10, znamienny tym, Ŝe ilość kwasu mieści się w zakresie od 5.5 do 6.5 g.