1
WYMAGANIA STAWIANE KOLUMNIE CHROMATOGRAFICZNEJ w chromatografii cieczowej Prof. dr hab. inż. Agata Kot-Wasik Katedra Chemii Analitycznej Wydział Chemiczny, Politechnika Gdańska agawasik@pg.edu.pl 2
CHROMATOGRAF 3
ROZDZIELENIE Faza Ruchoma Pompa Faza Stacjonarna Kolumna chromatograficzna Detekcja Wynik analizy chromatogram 4
ROZDZIELENIE oddziaływania analit faza stacjonarna i analit faza ruchoma Faza Ruchoma Pompa Faza Stacjonarna Kolumna chromatograficzna 5
CHROMATOGRAFIA = ROZDZIELENIE 6
ROZDZIELENIE = KOLUMNA CHROMATOGRAFICZNA 7
ROZDZIELENIE RETENCJA GC kolumna chromatograficzna (długość, średnica, faza stacjonarna, grubość filmu fazy stacjonarnej) rodzaj gazu nośnego szybkość przepływu gazu nośnego temperatura HPLC kolumna chromatograficzna (długość, średnica, faza stacjonarna, średnica ziaren) rodzaj fazy ruchomej szybkość przepływu strumienia fazy ruchomej temperatura 8
ROZDZIELENIE RETENCJA GC kolumna chromatograficzna (długość, średnica, faza stacjonarna, grubość filmu fazy stacjonarnej) rodzaj gazu nośnego szybkość przepływu gazu nośnego temperatura HPLC kolumna chromatograficzna (długość, średnica, faza stacjonarna, średnica ziaren) rodzaj fazy ruchomej szybkość przepływu strumienia fazy ruchomej temperatura 9
KOLUMNA CHROMATOGRAFICZNA 10
11
ROZDZIELENIE Struktura analitów Matryca pka Stężenie Rozpuszczalność Parametry chemiczne (faza stacjonarna) KOLUMNA CHROMATOGRAFICZNA Liczba analitów Czas analizy Koszty Czułość Inne Parametry fizyczne (wymiary) 12
KOLUMNA CHROMATOGRAFICZNA Jaka powinna być kolumna chromatograficzna? Selektywność Sprawność Rozdzielczość Czas analizy Parametry zewnętrzne (fizyczne) wymiary Parametry wewnętrzne (chemiczne) wypełnienie 13
KOLUMNA CHROMATOGRAFICZNA powinna być selektywna Selektywność Sprawność Rozdzielczość Czas analizy Miara selektywności fazy stacjonarnej w stosunku do dwóch substancji 14
KOLUMNA CHROMATOGRAFICZNA powinna być sprawna Selektywność Sprawność Rozdzielczość Czas analizy zdolność kolumny do wytworzenia wąskich pików 15
KOLUMNA CHROMATOGRAFICZNA powinna być sprawna Selektywność Sprawność Rozdzielczość Czas analizy zdolność kolumny do wytworzenia wąskich pików 16
KOLUMNA CHROMATOGRAFICZNA powinna być sprawna Selektywność Sprawność Rozdzielczość Czas analizy zdolność kolumny do wytworzenia wąskich pików 17
KOLUMNA CHROMATOGRAFICZNA Selektywność Sprawność Rozdzielczość Czas analizy Czy kolumna powinna być długa czy krótka? 18
KOLUMNA CHROMATOGRAFICZNA powinna być 1 zdolna do rozdzielenia związków w możliwie najkrótszym czasie 6 4 5 8 7 2 1. acetazolamide, 2. hydrochlorothiazide, 3. hydroflumethiazide, 4. clopamide, 5. trichlormethiazide, 6. indapamide, 7. bendroflumethiazide, 8. spironolactone 3 30mmL x 2.1mm x1.7 μm ACQUITY UPLC C18; 35 C; Elucja: gradient 9 45% (H2O + 0.1% HCOOH ) / ACN; 0.86 ml/min Detekcja: UV 273nm 19
KOLUMNA CHROMATOGRAFICZNA powinna być zdolna do rozdzielenia związków w możliwie najkrótszym czasie 646 pestycydy rozdzielono na kolumnie Restec Raptor Biphenyl 100 mm 2.1 mm i.d. column packed with 2.7 µm 20
KOLUMNA CHROMATOGRAFICZNA powinna być zdolna do rozdzielenia związków w możliwie najkrótszym czasie 120 cm 100 m i.d. column packed with 3.6 m; C4-core-shell particles (200 Å pores) Yufeng Shen, Nikola Tolic et all., Environmental Molecular Sciences Laboratory, Pacific Northwest National Laboratory; High-resolution ultrahighpressure long column reversed-phase liquid chromatography for top-down proteomics, Journal of Chromatography A, 2017 http://dx.doi.org/10.1016/j.chroma.2017.01.008 21
KOLUMNA CHROMATOGRAFICZNA powinna rozdzielić anality Selektywność Sprawność Rozdzielczość Czas analizy Teoria Praktyka 22
KOLUMNA CHROMATOGRAFICZNA Selektywność Sprawność Rozdzielczość Czas analizy Rozdzielenie do podstawy R > 1.5 23
KOLUMNA CHROMATOGRAFICZNA Selektywność Sprawność Rozdzielczość Czas analizy w warunkach izokratycznych czas analizy jest określony przez czas retencji ostatniego piku chromatograficznego L HNreq tr = u (1+k) = u (1+k) L długość kolumny u liniowa prędkość przepływu fazy ruchomej H wysokość półki teoretycznej Nreq wymagana ilość półek teoretycznych 24
CZAS ANALIZY L HNreq tr = u (1+k) = u (1+k) L długość kolumny u liniowa prędkość przepływu fazy ruchomej H wysokość półki teoretycznej Nreq wymagana ilość półek teoretycznych H h (~2.2) h = dp H = dp Nreq tr ~ 2.2 (1+k) u dp f (L) f (dp) f (u) 25
CZAS ANALIZY Jak go skrócić? f (L) f (dp) f (u) 26
LC efekt zwiększenia długości kolumny chromatograficznej Czas analizy ~ 2min f (L) Czas analizy ~ 4min Czas analizy ~ 5min 27
LC efekt zmniejszenia średnicy ziaren d p f (dp) M. Tswett 1905 1960s 1970s 1980s dp ~ 50mm dp > 10mm dp = 10mm dp = 5mm Ziarno nieporowate Ziarno nieregularne Ziarno sferyczne Ziarno sferyczne 28
LC efekt zmniejszenia średnicy ziaren d p f (dp) 1990s 2004 Dzisiaj dp = 3.5mm dp = 1.7mm dp = 1mm Ziarno z rdzeniem 29
LC efekt zmniejszenia średnicy ziaren d p Sprawność [N/m] 500000 1.0mm f (dp) 400000 1.4mm 300000 1.7mm 2 μm 3-4 μm 5 μm 200000 10 μm 3mm 5mm 100000 10mm 0 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 Ciśnienie [bar] 30 Kolumna C18 150mm x 4.6mm; przepływ 1.8mL/min; temp. 30 oc
LC efekt zmniejszenia średnicy ziaren d p Kolumna C18: 5μm 70 pików Pojemność pików: 143 Kolumna C18: 1.8μm 168 pików Pojemność pików: 360 31
KOLUMNA CHROMATOGRAFICZNA HPLC kolumna pakowana (stal kwasoodporna) 5(25)cm L. x 2(4)mm I.D. x 2(5) mm dp 32
KOLUMNA CHROMATOGRAFICZNA FAZA STACJONARNA 33
KOLUMNA CHROMATOGRAFICZNA FAZA STACJONARNA 34
FAZA STACJONARNA Zwiększona retencja zasadowych związków polarnych Zwiększona retencja kwaśnych związków polarnych Mniej hydrofobowa faza niż C18 Zwiększona retencja związków aromatycznych Selektywność dla aromatów i związków polarnych Zwiększona retencja związków polarnych Zwiększona retencja związków polarnych 35
FAZA STACJONARNA CN Fenyl NH2 C4 C8 C18 HYDROFILOWE HYDROFOBOWE pka Mcz i log Kow min 36
37
KOLUMNA CHROMATOGRAFICZNA Kolumna chromatograficzna nie jest wieczna... 38
39
OCHRONA KOLUMNY CHROMATOGRAFICZNEJ Przygotowanie ekstraktu Filtracja wydłuża żywotność kolumny dzięki eliminacji Przedkolumny Regeneracja i filtry przed zanieczyszczeń stałych, kolumną które blokują wlot kolumny zwiększając ciśnienie wsteczne w kolumnie. 40
OCHRONA KOLUMNY CHROMATOGRAFICZNEJ Przedkolumny i filtry przed kolumną przedkolumna 41
OCHRONA KOLUMNY CHROMATOGRAFICZNEJ Przedkolumny i filtry przed kolumną 42
OCHRONA KOLUMNY CHROMATOGRAFICZNEJ Przedkolumny i filtry przed kolumną 43
44
KOLUMNA CHROMATOGRAFICZNA 45
46